Cultures primaires mixtes de murine Petit Intestin destiné à l'étude de la Gut hormone Sécrétion et imagerie de cellules vivantes de cellules entéroendocrines

Toutes les procédures d'animaux ont été approuvées par l'Université de Cambridge et du bien-être animal du corps examen éthique et conformées aux animaux (procédures scientifiques) de la Loi de 1986 Règlement Amendement (SI 2012/3039). 1. Préparation à l'avance Placer une aliquote de la matrice de la membrane basale (BMM) (~ 200 pi) sur la glace au dégel. NOTE: Le BMM se solidifie à température ambiante (RT). Pré-chaud 50 ml Dulbecco stérile à haute glucose Modified Eagle Medium (DMEM) (sans additifs) et ~ 40 ml de milieu de culture stérile (DMEM riche en glucose additionné de 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 100 U de pénicilline / ml et 0,1 mg / ml de streptomycine (P / S), et 2 mM de L-glutamine) dans des tubes de centrifugation de 50 ml dans un bain d'eau à 37 o C. Pré-refroidissement du calcium et de magnésium contenant de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Peser 15 mg de collagénase (XI brut), ajouter à un tube de centrifugation de 50 ml et le maintenir sur de la glace. <li> ATTENTION: collagénase est nocif. Il provoque une irritation de la peau (H315) et irritation des yeux (H319). Il peut causer des symptômes d'allergie ou d'asthme ou des difficultés respiratoires par inhalation (H334). Il peut provoquer une irritation des voies respiratoires (H335). Utiliser un équipement de protection individuelle approprié, d'éviter la formation de poussière et éviter de respirer les poussières. Assurer une aération suffisante. 2. Collection de tissus Ajouter ~ 20 ml de milieu L-15 à un tube de centrifugeuse de 50 ml et placez-le sur la glace. Euthanasier une souris par dislocation cervicale, ou toute autre méthode annexe 1 approuvé. REMARQUE: le tissu intestinal est typiquement obtenu à partir de souris sur un fond C57BL6. Cependant, d' autres milieux génétiques ont également été utilisés , par exemple 129 / SvEv 15. Des expériences d'imagerie nécessitent l'utilisation de souris rapporteurs fluorescents par exemple Glu-Venus 1. Le tissu est obtenu à partir de souris adultes (2-6 mois) des deux sexes. Les souris sont logées dans individuacages ventilé lly avec ad libitum accès à l' eau et chow régulière. Cependant, des expériences pour tester l'effet d'un régime alimentaire riche en matières grasses, par exemple, sur la fonction cellulaire entéroendocrine 16 peut être réalisée si elle est soutenue par une licence de projet. Disséquer et retirer doucement l'intestin de souris (de pylore et le début du rectum) à l'aide des pinces et des ciseaux de dissection. Conservez-le dans milieu L-15 sur la glace jusqu'à prêt à l'emploi. 3. Préparation des tissus Placer le tissu intestinal dans une boîte de Pétri de 10 cm contenant du PBS suffisant pour couvrir le tissu. Prendre 10 cm de tissu souhaité (par exemple , l' intestin grêle supérieur, haut, 10 cm de pylore distaux). Rincer le contenu intestinal à l' aide d' une pipette Pasteur en matière plastique et PBS refroidi. En utilisant des pinces, délicatement préhension d'une extrémité du segment intestinal et placer la pointe d'une pipette Pasteur en elle. Rincez le contenu avec PBS refroidi. Répétez des deux extrémités jusqu'à ce que la majorité du contenu a été débusqué. Transfert à une boîte de Pétri contenant du PBS propre fraîches, réfrigérées. En utilisant des pinces, enlever le tissu adipeux et méso, en prenant soin de ne pas retirer la couche musculaire en même temps. Peler la couche musculaire off « comme une chaussette » sous un microscope à dissection en utilisant deux jeux de pinces fines. REMARQUE: Cette étape est pas indispensable mais est fortement recommandée. Il existe d'autres façons d'éliminer la couche musculaire à celle décrite ici. Par exemple, l'intestin peut être coupée longitudinalement ouverte en premier, avant l'enlèvement de la couche de muscle. Trouver un point de départ à l'extrémité proximale plus du tissu où il y a un volet visible du muscle. Tirez doucement loin une petite quantité de la couche musculaire tout autour de l'intestin. NOTE: Pour éviter la déchirure de la couche de muscle ou de l'épithélium intestinal, de réduire la force de tension par serrage d'une plus grande surface au lieu d'utiliser le tips des pinces fines. Fixer l'intestin et comme une grande partie du lambeau musculaire possible, tirez doucement en dehors et commencer à décoller la couche musculaire autour de l'intestin. Pour éviter de déchirer à la fois la couche musculaire et de l'épithélium, maintenir la position de réajustant la pince pour les garder proches. De cette manière, éliminer la couche musculaire de la totalité de la longueur du segment intestinal et le jeter. Couper l'intestin ouvert longitudinalement et laver par tourbillonnant dans une boîte de Pétri propre avec du PBS frais, réfrigérés. Répétez si nécessaire pour éliminer toute chyme ou de mucus restant. Mince tissu avec une lame de scalpel chirurgical pour réaliser des carrés de 1-2 mm ~ 2 et les ajouter à ~ 20 ml de PBS refroidi dans un tube de centrifugation de 50 ml en utilisant une pipette Pasteur. Pour éviter les morceaux de tissu coller à la pipette, couper la pointe et mouiller la pipette par trituration avec du PBS. Secouer doucement le tube pour laver davantage les morceaux de tissu. Laisser le tissu pour régler et verser ou pipette au large de la majorité du PBS et répéter avec du PBS frais jusqu'à ce que le PBS semble claire. 4. Préparation de la plaque à revêtement BBM / Plats et Digestion moyen REMARQUE: Les étapes suivantes doivent être effectuées dans une hotte de culture tissulaire (avec les étapes d'incubation dans un bain d'eau à 37 ° C). Préparer une solution BMM 2% dans du DMEM frais (sans additions). Tout en travaillant, maintenir la solution sur la glace. Pour une solution à 2%, ajouter 140 uL décongelé BMM à 7 ml de DMEM (suffisamment pour préparer une plaque à 24 puits). Ajouter 250 uL de 2% solution BMM par puits (plaque 24 puits) ou par boîte d'imagerie à fond de verre. Incuber les plaques / plats couchés pendant au moins 30 min dans un incubateur à 37 ° C pour permettre une polymérisation suffisante de la BMM. Ajouter le DMEM (sans additions) de la collagénase 15 mg préchauffé 50 ml ( à partir étapes 1,2 et 1,4) pour former une solution à 0,3 mg / mL et inverser la dissolution. SurCE complètement dissous, en utilisant une seringue de 20 ml, on filtre la solution de collagénase à travers un filtre stérile de 0,2 um dans un nouveau tube de centrifugation stérile de 50 ml. Étiquette ce que le milieu de la digestion. 5. La digestion des tissus Retirer les morceaux de tissu de la PBS en utilisant une pipette sérologique de 10 ml et ajouter à un tube de centrifugation stérile de 50 ml contenant du DMEM stérile frais (sans additions), tourbillon, puis retirer DMEM. REMARQUE: Pour éviter de coller le tissu à la pipette sérologique, humide par trituration avec DMEM avant le contact avec le tissu. 1 et 2 « Digest »: Elimination des débris cellulaires et des cellules individuelles Ajouter milieu de digestion 7 ml aux morceaux de tissu et de donner le tube un tourbillon. Incuber pendant 5 min dans un bain-marie à 37 ° C. Secouer doucement (non tourbillonner) pour le tube ~ 3 s. Laisser le tissu à établir et à rejeter le milieu de la digestion, réservant unepetit volume à regarder sous le microscope. REMARQUE: Surtout lors du démarrage, il est fortement recommandé d'inspecter un petit volume de chaque « digérer » (~ 30 pi) sous le microscope pour évaluer les progrès du processus de digestion. Si plusieurs cryptes sont observés à ce stade, l'agitation peut être trop forte. Pour des images représentatives de ce que les différentes étapes « digérer » présentera comme suit , reportez – vous à la figure 1. Répétez les étapes 5.2.-5.2.4 (avec un milieu de digestion frais). ' Les résumés de 3 à 5: Collection de fragments cryptiques Ajouter milieu de digestion 7 ml au tissu. Incuber pendant 10 min à 37 ° C. Au cours de l'incubation, agiter toutes les 5 min pour 10-12 s. NOTE: L'agitation est plus vigoureuse que l'agitation pendant « » digestions 1 et 2. Laisser les tissus non digérés de régler et de recueillir le milieu de la digestion dans un tube de centrifugation de 15 ml. Sile tissu est accidentellement recueilli avec le milieu, le laisser décanter, éliminer à l'aide d'une pipette sérologique de 10 ml et le transférer vers le tube de centrifugeuse de 50 ml contenant le tissu non digéré. Centrifugeuse moyen / surnageant recueilli à la température ambiante pendant 3 min à 100 x g. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 5 milieu de culture préchauffée ml par trituration douce et mettre de côté. Inspecter un petit volume de la suspension cellulaire au microscope (voir note de l'étape 5.2.4). NOTE: Dans l'idéal, des fragments crypte commencent à apparaître dans « digérer » 3 ainsi que des débris cellulaires et des cellules individuelles. « » Les résumés 4 et 5 contiennent un nombre significativement plus élevé de fragments cryptiques avec les débris cellulaires réduite (Figure 1). Régler secouer l' intensité nécessaire à savoir si le tissu ne digère et des fragments de la crypte n'apparaissent pas, secouez plus vigoureusement. Répétez les étapes 5.3.1-5.3.6 jusqu'à 5 « » ont été DIGESTSterminé ou jusqu'à ce que la majorité du tissu a été digéré (un peut être nécessaire digest 6 e). Une fois que tous les surnageants de 3-5 'de digestion de (ou 6.3) ont été recueillies, centrifuger le produit de digestion surnageants à température ambiante pendant 3 minutes à 100 x g. Pour les expériences de sécrétion, combiner les surnageants de « digestions » 3-5 (ou 3-6) avant la centrifugation. REMARQUE: moins de tissu est nécessaire pour des expériences d'imagerie, donc choisir le surnageant de digestion qui est la plus propre (absence de débris cellulaires et des cellules individuelles) avec le plus grand nombre de fragments de la crypte. Ceci est généralement « digérer » 4 ou 5. Jeter le surnageant et remettre en suspension doucement le culot en triturant jusqu'à ce qu'aucun amas sont visibles. Remettre en suspension le culot dans du milieu de culture préchauffé additionné de 10 uM Y-27632 dichlorhydrate (pour empêcher anoikis 17). Utilisez 5 ml pour les expériences de sécrétion et 2 ml de milieu de culture pour des expériences d'imagerie. Filtresuspension de cellules à travers un filtre de 100 um (pour éliminer tout tissu non digéré). Exécuter un supplément de 2 ml de milieu de culture préchauffé à travers le filtre de lavage (volume total: 7 ml et 4 ml pour la sécrétion et l'imagerie, respectivement). NOTE: Le filtrage est pas essentiel, cependant, des fragments de tissus plus grands tendent à ne pas adhérer à la plaque / plats. Figure 1: Des images représentatives de « digestion » de la méthode de culture primaire petit intestin. (A) un matériau contenant typique de « digestion » 1 et 2 principalement des cellules individuelles et les débris cellulaires. (B) Un exemple de produits de « digérer » 3. Les flèches noires indiquent des fragments cryptiques apparaissant dans le matériau à digérer. (C) de type 'digest' 4 ou 5. Panneau (D) représente rassemblées digérer la matière à partir de« digestions » 3-5 passé à travers un filtre de 100 um pour éliminer les fragments de tissus indésirables observés dans les grandes (C). Toutes les images ont été prises à l'aide d'un microscope inversé numérique avec un objectif 20X. Les barres d'échelle = 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. 6. Revêtement Cultures intestinales (enrichie pour les cellules des cryptes) Retirer l'excès de solution BMM de la plaque ou de la vaisselle, et ajouter 250 pi de milieu de culture préchauffée par sécrétion bien. REMARQUE: Les plats imagerie sont laissés sans moyen donc passer à l'étape suivante rapidement pour empêcher le plat de sécher. Plate suspension de cellules 250 pl par puits (plaque 24 puits) ou par boîte à fond de verre. goutte à goutte plaque dans un mouvement « zig-zag » lent à travers le puits. Permettre aux fragments cryptiques de se déposer pendant environ 5 min avant de déplacer la plaque de thincubateur e. NOTE: Cela devrait encourager une répartition équitable des cryptes / cellules dans le puits. Incuber la plaque ou de la vaisselle pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO 2. NOTE: Une monocouche « parcellaire » aurait dû faire. Pour une image représentative des cultures suivantes trois lavages, voir la figure 2A. plats d'imagerie « inondation » avec 2 ml de milieu de culture préchauffé par boîte. NOTE: Ces plats seront adaptés pour l'imagerie jusqu'à ~ 72 heures après placage. cultures durent généralement plus longtemps colique, jusqu'à 7 jours. Les cellules qui n'ont pas adhéré peuvent être éliminés par une étape de lavage. Les cultures primaires sont maintenant prêts à être utilisés pour des expériences.