Gemischte Primärkulturen von Murine Duenndarm bestimmt zur Untersuchung von Gut Hormonausschüttung und Live Cell Imaging von enteroendokrinen Zellen
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von gemischten murine kleinen Darmzellen. Diese primären intestinalen Kulturen ermöglichen die Untersuchung von Signalwegen zugrunde liegenden Darmpeptid die Sekretion einer Reihe von Techniken.
Abstract
Der Darm ist das größte endokrine Organ des Körpers, mit hormonsezerniere enteroendokrinen Zellen entlang der Länge des Magen-Darm-Epithel entfernt. Trotz ihrer physiologischen Bedeutung, repräsentieren enteroendokrinen Zellen nur einen kleinen Teil der epithelialen Zellpopulation und in der Vergangenheit hat ihre Charakterisierung eine große Herausforderung in einer Abhängigkeit von Zelllinie Modellen resultierende präsentiert. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Kultur von gemischten murine kleinen Darmzellen. Diese Primärkulturen wurden verwendet, um die Signalwege, die unter der Stimulierung und Hemmung von Darmpeptid Sekretion in Reaktion auf eine Reihe von Nährstoffen und Neuropeptiden sowie pharmakologische Wirkstoffe zu identifizieren. Ferner wird in Kombination mit der Verwendung von transgenen Mäusen fluoreszierender Reporter haben wir gezeigt, daß diese Primärkulturen ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung von fluoreszenzmarkierten Zellen an den enteroendokrinen in wordenzellulären Ebene, unter Verwendung von Verfahren wie Patch-Clamp und Einzelzellen-Calcium und cAMP-FRET-Bildgebung.
Introduction
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist, zu isolieren und Kultur gemischt murinen Darmzellen die Untersuchung der Darm-Peptid-Sekretion und Live Cell Imaging von enteroendokrinen Zellen zu ermöglichen. Eine frühe Version dieses Verfahrens wurde ursprünglich im Jahr 2008 von Reimann et al. Und 1 hat , da die Basis von weiteren 20 Veröffentlichungen unserer Arbeitsgruppe gebildet. Aus diesem Manuskript, wählten wir auf kleine Darm-Kulturen zu konzentrieren, da sie schwieriger sind als Kolon-Kulturen zu etablieren.
Enteroendokrinen Zellen sezernieren eine Reihe von Darmpeptide einschließlich Glucagon-like Peptid 1 (GLP-1), glukoseabhängige insulinotrope Peptid (GIP), Cholecystokinin (CCK) und Peptid YY (PYY) 2. Diese Darmpeptide haben wichtige physiologische Rolle in der postprandialen Reaktionen wie die Verlangsamung der Darmtransit orchestriert, Potenzierung der Glucose-stimulierte Freisetzung von Insulin und Induktion der Sättigung. GLP-1-Mimetika and Medikamente , die seinen Abbau hemmen , werden derzeit für die Behandlung von Typ – 2 – Diabetes zugelassen , und es gibt die laufende Beurteilung des therapeutischen Potenzials der endogene Sekretion dieses Peptids 3 stimuliert. Ein besseres Verständnis der enteroendokrinen Physiologie und die Mechanismen, durch die die Sekretion entweder stimuliert oder gehemmt ist daher von entscheidender Bedeutung.
Gut Peptid – Sekretion untersucht wird , kann eine Vielzahl von in vitro und ex vivo unter Verwendung von experimentellen Modellen, die jeweils Vor- und Nachteilen (für eine umfassende aktuelle Übersicht abdeckt auch die Verwendung von in – vivo – Modellen siehe Svendsen et al. 4). Ex – vivo – Techniken , wie beispielsweise der Darm isoliert perfundierten 5 und Ussing – Kammern 6 sind derzeit verwendeter Darm – Peptid – Sekretion als Antwort auf verschiedene Substanzen zu entdecken. Der Hauptvorteil dieser Methoden, wiePrimärkulturen im Vergleich zu, ist, dass die unmittelbare Umgebung der enteroendokrinen Zellen weitgehend intakt bleibt und vor allem wird die Polarität der Zellen erhalten. Daher ist es möglich , Informationen zu entlocken , die die Zelloberfläche ein Sekretagogum auf 6 wirkt. Diese sind jedoch typischerweise geringe Durchsatzverfahren, und die Qualität der von ihnen abgeleiteten Daten stützt sich stark auf die Integrität und Lebensfähigkeit des Darmgewebes, die zwangsläufig mit der Zeit abnehmen.
Intestinale Organoide werden jetzt in zunehmendem Maße als in vitro – Modelle für die Untersuchung der enteroendokrinen Zellfunktion und Entwicklung 7 verwendet wird. Organoide, die sowohl von murinen und humanen Geweben abgeleitet werden können, hat den Vorteil der 3D ‚Krypta-like‘ Strukturen bilden, die Zellpolarität in Kultur halten. Jedoch haben organoiden abgeleitetes enteroendokrinen Zellen noch nicht vollständig an natives L cel charakterisiert und ihre Ähnlichkeit werdenls bleibt weitgehend unbekannt. Primäre Kulturen haben den Vorteil, einen Schritt näher an der physiologischen Einstellung zu sein, wie enteroendokrinen Zellen sind nicht in künstlichen Bedingungen für längere Zeiträume aufrechterhalten und differenziert.
Eine alternative Primärkulturverfahren , die für die Bewertung der Darm – Peptid – Sekretion eingesetzt wurde , ist die Isolierung von fötalen Rattendarmzellen (FRICS) 8. Allerdings hat sich die Kultur von adulten Darmgewebe mit weniger Erfolg und einige Unterschiede wurden in der Ansprechbarkeit von FRICS vs. erwachsenen Mäuse – Darm-Zellen (zB Glucose 8) beobachtet.
Enteroendokrinen artigen Zelllinien (zB GLUTag, STC-1 und NCI-H716) werden traditionell verwendet worden vs direkt zu unterscheiden. indirekte Wirkungen auf Zellen und enteroendokrinen zugrunde liegende molekulare Mechanismen sezieren, um Sekretionskopplung Reiz; siehe Kuhre et al </em>. 9 für die Peptidproduktion und Sekretion von ‚L zellähnliche‘ immortalisierte Zelllinien. Dies wurde als enteroendokrinen Zellen notwendig gewesen, entlang des Magen – Darm – Trakt verstreut, bilden knapp 1% der intestinalen Epithelzellen 10 und sortierten Zellen, in unseren Händen, nicht überleben in Kultur 1. Zelllinien nützliche Werkzeuge bleiben aufgrund der Tatsache, dass sie eine weitgehend homogene Zellpopulation sind, die auf genetische Manipulationen, wie Gen-Silencing förderlich ist. Folglich ist es leicht, die Rolle von Proteinen zu untersuchen, die nicht pharmakologisch ausgerichtet werden können, wenn transgene Mäuse nicht verfügbar sind. Allerdings Zelllinien sind nicht immer gültig Modelle von Primärzellen. Zwar gibt es viele Ähnlichkeiten, Erkenntnisse aus Primärkulturen gelegentlich hervorgehoben haben Unterschiede in den Signalweg durch bestimmte Nährstoffe in primären L – Zellen im Vergleich zu GLUTag Zellen aktiviert, zum Beispiel (z. B. Peptone <sup class = "xref"> 11). Entscheidend ist, dass in Kombination mit transgenen Mäusen fluoreszierenden Reporter, das primäre Kulturmodell ermöglicht eine detaillierte Untersuchung der einzelnen Primär enteroendokrinen Zellen an der intrazellulären Ebene. Fluoreszenz-markierte L – Zellen innerhalb von Primärkulturen werden für die Patch – Clamp – 1, 12 Studien , die von unserer Gruppe verwendet wurden, und Einzelzellen – Calcium 11, 13 und cyclischem Adenosinmonophosphat-FRET – Bildgebung 14 Studien, die wesentliche Fortschritte auf dem Gebiet der enteroendokrinen nachgegeben Physiologie.
Das folgende Protokoll ist für die Durchführung der Sekretion Experimente optimiert, eine 24-Well-Platte oder für die Herstellung von bis zu 16 Abbildungs Geschirr, aus einem 10 cm-Abschnitt des Dünndarms von einer einzigen erwachsenen Maus. Das Protokoll kann leicht für die Untersuchung von Kolon-Zellen modifiziert werden, indem Aufschlusszeiten zu erhöhen und Collagenase Konzentration.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultur von gemischten murine Dünndarmzellen die Untersuchung von Darmpeptid Sekretion und Einzelzellen-Bildgebung von markierten enteroendokrinen Zellen zu ermöglichen.
Um die Wahrscheinlichkeit der kleinen intestinalen Kulturen, erfolgreich zu erhöhen, ist es wichtig, dass das Protokoll so schnell wie möglich durchgeführt wird (idealerweise innerhalb von 3 h der Gewebeernte), und dass das Gewebe wird in eiskaltem Medium gehalten oder Puffer vor auf die Verdauung, den Zelltod zu begrenzen. Zwar ist es nicht unbedingt notwendig, vor allem für Kolon-Kulturen ist, die Entfernung von der Muskelschicht aus dem Dünndarm wird stark gefördert. Das kleine Darm-Kultur-Protokoll wird so weit wie möglich standardisiert. Allerdings ist es wichtig, dass kein Verdauungsprozess ist identisch zu beachten. Es gibt viele Schritte in diesem Protokoll wo Variabilität kann zum Beispiel des Grades des Muskelabbaus, die Größe von t an einem Tag zu Tag eingeführt werdener Gewebestücke ‚gehackt‘, um die Stärke des Schüttelns, um die Wirksamkeit einer bestimmten Charge von Kollagenase etc. Es ist daher von größter Bedeutung, Teilmengen von jedem der verschiedenen ‚verdaut‘ unter dem Mikroskop zu untersuchen den Fortschritt der Verdauung und Schneider das Schütteln und die Zahl der ‚Digests‘ entsprechend zu bewerten. Es wird empfohlen, mehr sanft zu schütteln und zu beginnen, wenn Krypta Fragmente aus nicht offensichtlich sind ‚verdauen‘ 3 ab, zu beginnen mehr heftiges Schütteln.
Aus unserer Erfahrung nicht in Kultur enteroendokrinen Zellen vermehren sich und werden in der Regel von kleinen Darm Kulturen innerhalb von 4 Tagen verloren. Dennoch ermöglicht diese genügend Zeit gut Peptid-Sekretion Experimente (in der Regel mehr als 2 h, 18-24 h nach Plattieren) auszuführen physiologischen Stimuli und / oder pharmakologische Mittel zu testen. Versuche vor dem Experiment Sekretion einer Inkubation über Nacht erfordern , sind auch denkbar , zum Beispielim Fall der Vorbehandlung mit Pertussistoxin 15.
Die primäre Kulturtechnik präsentiert hier ist ein gut etabliertes Verfahren, wie durch das Volumen der Forschungsergebnisse belegen sie im Laufe der Jahre hervorgebracht hat. Das primäre Kulturmodell wird verwendet, um die Sekretion einer Vielzahl von gut Peptide zu untersuchen, einschließlich GLP-1 1, GIP 18 und PYY 19, in Reaktion auf diverse Nährstoff- und nicht-Nährstoff 14, 20 Stimuli und Inhibitoren. Darüber hinaus hat die gleiche Technik , 21 zu der Kultur von menschlichen Darmzellen erfolgreich eingesetzt worden. Oft wird eine Kombination aus dem primären Zellkultur – Verfahren zusammen mit einem zusätzlichen experimentellen Modell zB. ex vivo oder in vivo können die meisten Einblick 6 liefern. Insbesondere und im Gegensatz zu anderen Methoden, diese Technik hat important Anwendungen, die über die Messung von Darmpeptidfreisetzung. Wir haben gezeigt , dass primäre Kulturen aus Dünndarm – transgenen Mäusen reporter leistungsfähige Werkzeuge gekoppelt , um die Abfrage von intrazellulären Signalwege sind abgeleitetes Peptid – Sekretion darm, beispielsweise unter Verwendung der Ca 2+ und cAMP – Sensoren, GCaMP3 11, 13 und 14 Epac2camps jeweils sowie elektrophysiologische Techniken 12.
Wie bei allen in vitro – Modellen, die primären intestinalen Kulturen bestimmte inhärente Beschränkungen einschließlich dem Verlust der Polarität der Epithelzellen in Kultur, sowie der Verlust der Blutversorgung und Innervation. Es ist schwierig, die potenziellen Auswirkungen dieser künstlichen Bedingungen auf enteroendokrinen Zellfunktion zu schätzen. Doch aus Primärkulturen gewonnenen Daten oft übersetzbar waren in dem in vivo setting (zB Wirkungen von kurzkettigen Fettsäuren auf die GLP-1 – Sekretion 15).
Die primären Darm-Kulturen sind eine vielseitige Technik mit vielen Anwendungsmöglichkeiten. Sie haben bereits wichtige mechanistische Einblicke in die Regulation des Darms Peptid Sekretion zur Verfügung gestellt.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
GLP-1-Immunoassays wurde von dem Core Biochemische Assay Laboratory am Addenbrooke Hospital durchgeführt.
Diese Arbeit hat, im Laufe der Jahre durch den Wellcome Trust (derzeit aktiv Zuschüsse 106262 / Z / 14 / Z und 106263 / Z / 14 / Z) und das Medical Research Council (MRC) (Zuschüsse MRC_MC_UU_12012 / 3 und MRC_MC_UU_12012 unterstützt / 5).
Materials
| 24-well plates | Costar | 3524 | For secretion experiments |
| Bombesin | Sigma-Aldrich | B4272 | Positive control (calcium imaging experiment) |
| Centrifuge tubes, 15 ml, sterile | Greiner bio-one | 188261 | For tissue preperation/ digestion |
| Centrifuge tubes, 50 ml, sterile | Corning | 430828 | For tissue preperation/ digestion |
| Collagenase XI (Crude) | Sigma-Aldrich | C9407 | For making up digestion medium |
| Dichroic mirror | Cairn Research | – | For imaging experiments |
| DMEM High glucose (4500 mg) | Sigma-Aldrich | D6546 | For dissolving matrigel (keep at 4 oC). For making up digestion medium, pre-warm to 37 oC. |
| Emission Filter (Bandwidth 510-560 nm) | Cairn Research | – | For imaging experiments |
| Foetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | For making up culture medium |
| Forceps/Tweezers | Agar Scientific | AGT520 | For dissection/removal of intestine |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | Positive control (secretion experiment) |
| Glass-bottomed dishes (35 mm) | MatTek | P35G-0-14-C | For imaging experiments |
| High precision tweezer (110 mm) | IDEAL-TEK | 3480641 (5 SA) | For removing muscle layer |
| High resolution digital CCD camera | Hamamatsu | ORCA-ER | For imaging experiments |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Positive control (secretion experiment) |
| L-15 Medium (Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L1518 | For collecting tissue, keep on ice |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For making up culture medium |
| Matrigel | Corning | 354234 | Basement Membrane Matrix, for coating plates and dishes |
| MetaFluor | Molecular Devices (supplied by Cairn Research) | – | Fluorescence ratio imaging software |
| Mice (C57BL6) | Charles River Laboratories | C57BL/6J | Background mice used for breeding. Can also be used for secretion experiments |
| Mice (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3) | in house | – | For calcium imaging and secretion experiments |
| Microscope (EVOS XL Core) | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | For photomicrographs of cultures |
| Microscope | Olympus | IX71 | Inverted microscope with 40x oil objective used for imaging experiments |
| Monochromator | Cairn Research | – | For imaging experiments |
| Pasteur pipettes | Alpha Laboratories | LW4234 | For cleaning tissue |
| PBS containing Ca2+ and Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8662 | For washing tissue, keep on ice |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | For making up culture medium |
| Petri dishes (100 mm x 20 mm) | Corning | CLS430167 | For cleaning tissue and removing muscle layer |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P/4280/53 | Positive control (calcium imaging experiment) |
| Scissors | Agar Scientific | AGT554 | For dissection/removal of intestine |
| Sterile cell strainer 100 µm | Fisher Scientific | 22363549 | For filtering crypt cell suspension prior to plating |
| Surgical scalpel blade No.22 (sterile, stainless) | Swann Morton | 0308 | For dicing tissue |
| Syringe filters, Minisart NML (0.2 µm pore size) | Sartorius | 16534-K | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
| Syringes, 20 ml, disposable, sterile, Luer slip | BD | 300613 | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
| Xenon arc lamp 75W | Cairn Research | – | For imaging experiments |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | ROCK inhibitor, prepare 10 mM stock solution in sterile water (use 1:1000 in final culture medium) |
References
- Reimann, F., Habib, A. M., Tolhurst, G., Parker, H. E., Rogers, G. J., Gribble, F. M. Glucose sensing in L cells: A primary cell study. Cell Metab. 8, 532-539 (2008).
- Psichas, A., Reimann, F., Gribble, F. M. Gut chemosensing mechanisms. J Clin Invest. 125 (3), 908-917 (2015).
- Lovshin, J. A., Drucker, D. J. Incretin-based therapies for type 2 diabetes mellitus. Nat Rev Endocrinol. 5 (5), 262-269 (2009).
- Svendsen, B., Holst, J. J. Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines. Peptides. 77, 47-53 (2016).
- Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine. Diabetes. 64 (2), 370-382 (2015).
- Brighton, C. A., et al. Bile acids trigger GLP-1 release predominantly by accessing basolaterally located G protein-coupled bile acid receptors. Endocrinology. 156 (11), 3961-3970 (2015).
- Petersen, N., et al. Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids. Diabetes. 63 (2), 410-420 (2014).
- Brubaker, P. L., Vranic, M. Fetal rat intestinal cells in monolayer culture: a new in vitro system to study the glucagon-like immunoreactive peptides. Endocrinology. 120 (5), 1976-1985 (1987).
- Kuhre, R. E., et al. Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716, and STC-1 cells: a comparison to native L-cells. J Mol Endocrinol. 56 (3), 201-211 (2016).
- Gerbe, F., et al. Distinct ATOH1 and Neurog3 requirements define tuft cells as new secretory cell type in the intestinal epithelium. J Cell Biol. 192 (5), 767-780 (2011).
- Pais, R., Gribble, F. M., Reimann, F. Signalling pathways involved in the detection of peptones by murine small intestinal enteroendocrine L-cells. Peptides. 77, 9-15 (2016).
- Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. J Physiol. 589 (Pt 5), 1081-1093 (2011).
- Emery, E. C., et al. Stimulation of GLP-1 secretion downstream of the ligand-gated ion channel TRPA1. Diabetes. 64 (4), 1202-1210 (2015).
- Psichas, A., Glass, L. L., Sharp, S. J., Reimann, F., Gribble, F. M. Galanin inhibits GLP-1 and GIP secretion via the GAL1 receptor in enteroendocrine L and K cells. Br J Pharmacol. 173 (5), 888-898 (2016).
- Tolhurst, G., et al. Short-chain fatty acids stimulate glucagon-like peptide-1 secretion via G-protein-coupled receptor FFAR2. Diabetes. 61 (2), 364-371 (2012).
- Richards, P., et al. High fat diet impairs the function of glucagon-like peptide-1 producing L-cells. Peptides. 77, 21-27 (2016).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Parker, H. E., Habib, A. M., Rogers, G. J., Gribble, F. M., Reimann, F. Nutrient-dependent secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from primary murine K cells. Diabetologia. 52 (2), 289-298 (2009).
- Pais, R., Rievaj, J., Larraufie, P., Gribble, F. M., Reimann, F. Angiotensin II type 1 receptor-dependent GLP-1 and PYY secretion in mice and humans. Endocrinology. 157 (10), 3821-3831 (2016).
- Moss, C. E., et al. Somatostatin receptor 5 and cannabinoid receptor 1 activation inhibit secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from intestinal K cells in rodents. Diabetologia. 55 (11), 3094-3103 (2012).
- Habib, A. M., Richards, P., Rogers, G. J., Reimann, F., Gribble, F. M. Co-localisation and secretion of glucagon-like peptide 1 and peptide YY from primary cultured human L cells. Diabetologia. 56 (6), 1413-1416 (2013).
