Mezcla de cultivos primarios de murino intestino delgado previstos para el Estudio de Gut Hormone secreción y Imágenes de células vivas de células enteroendocrinas
Summary
Este protocolo describe el aislamiento y cultivo de células del intestino delgado murino mixtos. Estos cultivos primarios intestinales permiten la investigación de vías de señalización subyacentes secreción de péptido intestinal usando un número de técnicas.
Abstract
El intestino es el mayor órgano endocrino del cuerpo, con las células enteroendocrinas secretoras de hormonas situados a lo largo de la longitud del epitelio gastrointestinal. A pesar de su importancia fisiológica, las células enteroendocrinas representan sólo una pequeña fracción de la población de células epiteliales y en el pasado, su caracterización ha presentado un reto considerable que resulta en una dependencia de los modelos de línea celular. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento y cultivo de células del intestino delgado murino mixtos. Estos cultivos primarios se han utilizado para identificar las vías de señalización que subyacen a la estimulación y la inhibición de la secreción de péptido intestinal en respuesta a una serie de nutrientes y neuropéptidos, así como agentes farmacológicos. Además, en combinación con el uso de ratones transgénicos indicadores fluorescentes, hemos demostrado que estos cultivos primarios se convierten en una herramienta poderosa para el examen de las células enteroendocrinas fluorescentemente etiquetado en el ennivel intracelulares, utilizando métodos tales como fijación de parche y de calcio de una sola célula y formación de imágenes cAMP-FRET.
Introduction
El objetivo general de este método consiste en aislar y cultivar células intestinales mixta murinos para permitir el estudio de la secreción del péptido intestinal y imágenes de células vivas de las células neuroendocrinas. Una primera versión de este procedimiento se publicó originalmente en 2008 por Reimann et al. 1 y desde entonces ha formado la base de otras 20 publicaciones de nuestro grupo. Para este manuscrito, se optó por centrarse en pequeños cultivos intestinales, ya que son más difíciles de establecer que las culturas del colon.
Células enteroendocrinas secretan una gran variedad de péptidos intestinales incluyendo péptido similar al glucagón 1 (GLP-1), dependiente de la glucosa péptido insulinotrópico (GIP), colecistoquinina (CCK) y el péptido YY (PYY) 2. Estos péptidos intestinales tienen importantes papeles fisiológicos en la orquestación de las respuestas posprandial como la ralentización de tránsito intestinal, la potenciación de la liberación de insulina estimulada por la glucosa y la inducción de saciedad. GLP-1 miméticos unand fármacos que inhiben su degradación actualmente tienen licencia para el tratamiento de diabetes tipo 2 y hay evaluación continua del potencial terapéutico de la estimulación de la secreción endógena de este péptido 3. Una mejor comprensión de la fisiología enteroendocrina y los mecanismos por los que la secreción es ya sea estimulado o inhibido es, por lo tanto, de importancia crítica.
Gut secreción del péptido puede ser estudiada usando una variedad de in vitro y ex vivo modelos experimentales, cada uno con ventajas y desventajas (para una revisión integral reciente también cubre el uso de modelos in vivo ver Svendsen et al. 4). Técnicas ex vivo tales como el intestino 5 y cámaras de Ussing aislados y perfundidos 6 Actualmente se están utilizando para explorar la secreción de péptido intestinal en respuesta a varias sustancias. La principal ventaja de estos métodos, comoen comparación con los cultivos primarios, es que el entorno inmediato de las células enteroendocrinas permanece en gran parte intacta y de manera importante, se conserva la polaridad de las células. Por lo tanto, es posible obtener información con respecto a qué celda superficie un secretagogo está actuando en 6. Sin embargo, estos son típicamente técnicas de bajo rendimiento y la calidad de los datos derivados de ellos depende en gran medida de la integridad y viabilidad del tejido intestinal, lo que inevitablemente disminuirá con el tiempo.
Organoides intestinales ahora están siendo cada vez más utilizados como modelos in vitro para el estudio de la función celular enteroendocrina y desarrollo 7. Organoides, que pueden ser derivados de ambos murino y el tejido humano, tienen la ventaja de formar estructuras 'cripta-como' 3D que mantienen la polaridad celular en cultivo. Sin embargo, las células enteroendocrinas-organoides derivados tienen todavía que ser completamente caracterizados y su similitud con L cel nativols sigue siendo en gran parte desconocido. Los cultivos primarios tienen la ventaja de ser un paso más cerca de la configuración fisiológica, como células enteroendocrinas no se mantienen y se diferencian en condiciones artificiales para períodos prolongados de tiempo.
Un método de cultivo primario alternativo que ha sido empleado para la evaluación de la secreción de péptido intestinal es el aislamiento de las células intestinales de rata fetal (SCIIF) 8. Sin embargo, la cultura de tejido intestinal de adultos se ha reunido con menos éxito y se han observado algunas diferencias en la capacidad de respuesta de SCIIF vs células intestinales murinos adultos (por ejemplo, glucosa 8).
Líneas celulares Enteroendocrinas-como (por ejemplo GluTAG, STC-1 y NCI-H716) se han utilizado tradicionalmente para distinguir directo vs. efectos indirectos sobre las células enteroendocrinas y para diseccionar los mecanismos moleculares subyacentes de acoplamiento estímulo para la secreción; ver Kuhre et al </em>. 9 para la producción de péptido y la secreción por las líneas celulares inmortalizadas 'similares a células L'. Esto ha sido necesario como células neuroendocrinas, dispersos a lo largo del tracto gastrointestinal, constituyen menos del 1% de las células epiteliales intestinales 10 y células clasificadas, en nuestras manos, no sobreviven en la cultura 1. Las líneas celulares se mantienen herramientas útiles debido al hecho de que son una población de células en gran medida homogénea que es propicio para manipulaciones genéticas tales como la silenciación del gen. En consecuencia, es fácil para investigar el papel de las proteínas que no se pueden orientar farmacológicamente, cuando los ratones transgénicos no están disponibles. Sin embargo, las líneas celulares no siempre son modelos válidos de células primarias. Si bien hay muchas similitudes, los resultados de los cultivos primarios en ocasiones han resaltados diferencias en las vías de señalización activadas por ciertos nutrientes en las células L primaria en comparación con células GluTAG, por ejemplo (por ejemplo. Peptonas <SUP = "xref"> 11). Fundamentalmente, en combinación con ratones transgénicos indicadores fluorescentes, el modelo de cultivo primario permite el examen detallado de células enteroendocrinas primarios individuales en el nivel intracelular. Células L etiquetados fluorescentemente en cultivos primarios se han utilizado por nuestro grupo para el parche de sujeción 1, 12 estudios, y de una sola célula de calcio 11, 13 y de formación de imágenes monofosfato-FRET de adenosina cíclico 14 estudios, que han dado avances significativos en el campo de enteroendocrina fisiología.
El siguiente protocolo se ha optimizado para la realización de experimentos de secreción, utilizando una placa de 24 pocillos o para la preparación de hasta 16 platos de formación de imágenes, a partir de una sección de 10 cm del intestino delgado a partir de un solo ratón adulto. El protocolo puede ser modificado fácilmente para el estudio de las células del colon mediante el aumento de los tiempos de digestión y coconcentración llagenase.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe el aislamiento y cultivo de células del intestino delgado murino mixtos para permitir el estudio de la secreción de péptido intestinal y formación de imágenes de células individuales de células enteroendocrinas etiquetados.
Para aumentar la probabilidad de los pequeños cultivos intestinales tener éxito, es importante que el protocolo se lleva a cabo lo más rápidamente posible (idealmente, a menos de 3 h de cosechar el tejido) y que el tejido se mantiene en un medio enfriado con hielo o tampón antes con el proceso de la digestión, para limitar la muerte celular. Si bien no es esencial, especialmente para culturas del colon, se recomienda encarecidamente la eliminación de la capa muscular en el intestino delgado. El protocolo de cultivo del intestino delgado se ha normalizado tanto como sea posible. Sin embargo, es importante tener en cuenta que ningún proceso de digestión es idéntico. Hay muchos pasos durante este protocolo donde la variabilidad se puede introducir en una base de día a día por ejemplo, el grado de eliminación de músculo, el tamaño de tél 'picada' piezas de tejido, la fuerza de agitación, la potencia de un lote particular de colagenasa etc. Es por lo tanto, de suma importancia para inspeccionar alícuotas de cada uno de los diferentes 'digiere' bajo el microscopio para evaluar el progreso del proceso de digestión y adaptar la agitación y el número de consecuencia 'digiere'. Se recomienda agitar con más suavidad, para empezar y, en caso de restos de la cripta no son evidentes a partir de 'digerir' 3 en adelante, para empezar a temblar con más fuerza.
A partir de nuestra experiencia, las células neuroendocrinas no proliferan en cultivo y por lo general se pierden de pequeños cultivos intestinales dentro de 4 días. Sin embargo, esto permite el tiempo suficiente para llevar a cabo experimentos de secreción de péptido intestinal (típicamente lleva a cabo durante 2 h, 18-24 h después de la galvanoplastia) para probar estímulos fisiológicos y / o agentes farmacológicos. Los experimentos que requieren una incubación durante la noche antes del experimento secreción también son factibles por ejemplo,en el caso de pre-tratamiento con toxina pertussis 15.
La técnica de cultivo primario que se presenta aquí es un método bien establecido, como lo demuestra el volumen de producción de la investigación que se ha producido en los últimos años. El modelo de cultivo primario se ha utilizado para estudiar la secreción de una variedad de péptidos intestinales, incluyendo GLP-1 1, GIP 18 y PYY 19, en respuesta a diversa de nutrientes y no nutrientes 14, 20 estímulos e inhibidores. Además, la misma técnica se ha aplicado con éxito para el cultivo de células intestinales humanas 21. A menudo, una combinación del método de cultivo celular primario junto con un modelo experimental adicional, por ejemplo. ex vivo o in vivo pueden proporcionar la mayor penetración 6. En particular y en contraste con otros métodos, esta técnica tiene imaplicaciones portantes más allá de la medición de la liberación de péptido intestinal. Hemos demostrado que pequeños cultivos intestinales primarios derivados de reportero ratones transgénicos son herramientas poderosas para el interrogatorio de vías de señalización intracelular acoplados a destripar la secreción del péptido, usando por ejemplo los sensores de AMPc Ca 2 + y, GCaMP3 11, 13 y Epac2camps 14, respectivamente, así como técnicas electrofisiológicas 12.
Como con todos los modelos in vitro, los cultivos intestinales primarias tienen ciertas limitaciones inherentes, incluyendo la pérdida de la polaridad de las células epiteliales en cultivo, así como la pérdida de suministro de sangre y la inervación. Es difícil estimar el impacto potencial de estas condiciones artificiales en la función de las células enteroendocrinas. Sin embargo, los datos obtenidos a partir de cultivos primarios a menudo han sido traducible en el in vivo setting (por ejemplo, efectos de los ácidos grasos de cadena corta en GLP-1 secreción 15).
Los cultivos primarios intestinales son una técnica versátil con muchas aplicaciones potenciales. Ya han proporcionado una visión mecanicista importante en la regulación de la secreción del péptido intestinal.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
GLP-1 inmuno-ensayos se realizaron por el Laboratorio de Ensayo Core bioquímica en el Hospital de Addenbrooke.
Este trabajo, a lo largo de los años, ha apoyado por el Wellcome Trust (actualmente subvenciones activas 106262 / Z / 14 / Z y 106263 / Z / 14 / Z) y el Consejo de Investigación Médica (MRC) (subvenciones MRC_MC_UU_12012 / 3 y MRC_MC_UU_12012 / 5).
Materials
| 24-well plates | Costar | 3524 | For secretion experiments |
| Bombesin | Sigma-Aldrich | B4272 | Positive control (calcium imaging experiment) |
| Centrifuge tubes, 15 ml, sterile | Greiner bio-one | 188261 | For tissue preperation/ digestion |
| Centrifuge tubes, 50 ml, sterile | Corning | 430828 | For tissue preperation/ digestion |
| Collagenase XI (Crude) | Sigma-Aldrich | C9407 | For making up digestion medium |
| Dichroic mirror | Cairn Research | – | For imaging experiments |
| DMEM High glucose (4500 mg) | Sigma-Aldrich | D6546 | For dissolving matrigel (keep at 4 oC). For making up digestion medium, pre-warm to 37 oC. |
| Emission Filter (Bandwidth 510-560 nm) | Cairn Research | – | For imaging experiments |
| Foetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | For making up culture medium |
| Forceps/Tweezers | Agar Scientific | AGT520 | For dissection/removal of intestine |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | Positive control (secretion experiment) |
| Glass-bottomed dishes (35 mm) | MatTek | P35G-0-14-C | For imaging experiments |
| High precision tweezer (110 mm) | IDEAL-TEK | 3480641 (5 SA) | For removing muscle layer |
| High resolution digital CCD camera | Hamamatsu | ORCA-ER | For imaging experiments |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Positive control (secretion experiment) |
| L-15 Medium (Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L1518 | For collecting tissue, keep on ice |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For making up culture medium |
| Matrigel | Corning | 354234 | Basement Membrane Matrix, for coating plates and dishes |
| MetaFluor | Molecular Devices (supplied by Cairn Research) | – | Fluorescence ratio imaging software |
| Mice (C57BL6) | Charles River Laboratories | C57BL/6J | Background mice used for breeding. Can also be used for secretion experiments |
| Mice (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3) | in house | – | For calcium imaging and secretion experiments |
| Microscope (EVOS XL Core) | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | For photomicrographs of cultures |
| Microscope | Olympus | IX71 | Inverted microscope with 40x oil objective used for imaging experiments |
| Monochromator | Cairn Research | – | For imaging experiments |
| Pasteur pipettes | Alpha Laboratories | LW4234 | For cleaning tissue |
| PBS containing Ca2+ and Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8662 | For washing tissue, keep on ice |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | For making up culture medium |
| Petri dishes (100 mm x 20 mm) | Corning | CLS430167 | For cleaning tissue and removing muscle layer |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P/4280/53 | Positive control (calcium imaging experiment) |
| Scissors | Agar Scientific | AGT554 | For dissection/removal of intestine |
| Sterile cell strainer 100 µm | Fisher Scientific | 22363549 | For filtering crypt cell suspension prior to plating |
| Surgical scalpel blade No.22 (sterile, stainless) | Swann Morton | 0308 | For dicing tissue |
| Syringe filters, Minisart NML (0.2 µm pore size) | Sartorius | 16534-K | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
| Syringes, 20 ml, disposable, sterile, Luer slip | BD | 300613 | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
| Xenon arc lamp 75W | Cairn Research | – | For imaging experiments |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | ROCK inhibitor, prepare 10 mM stock solution in sterile water (use 1:1000 in final culture medium) |
References
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