腸ホルモン分泌の研究と腸内分泌細胞の生細胞イメージングを対象ネズミ小腸の混合初代培養

すべての動物の手順は、ケンブリッジ動物福祉の大学と倫理レビューボディによって承認され、（科学的処置）法1986年改正規則（SI 3039分の2012）を動物に適合しました。 予め1.準備解凍する氷の上基底膜マトリックスの一部（BMM）（〜200μL）を配置します。 注：BMMは、室温（RT）で凝固します。 プレ暖かい50mLの無菌高グルコースのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）（添加なしで）及び〜10％ウシ胎児血清（FBSを補充した40mLの滅菌培地（高グルコースDMEM）、100 U / mLペニシリン及び0.1mg / mlのストレプトマイシン（P / S）、および2mM L-グルタミン）37 O℃で水浴中で50mLの遠心管にプレ冷却カルシウム及びマグネシウムを含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）。 15 mgのコラゲナーゼ（XI粗製）を秤量、50mLの遠心管に加え、氷上に保ちます。 <lI>注意：コラゲナーゼは有害です。これは、皮膚刺激（H315）と強い眼刺激（H319）を引き起こします。 （H334）吸入する場合には、アレルギー、喘息または、呼吸困難を引き起こす可能性があります。これは、呼吸器への刺激（H335）を引き起こす可能性があります。 、適切な個人保護具を使用するダスト形成を避け、ほこりの吸入を避けます。十分な換気を確認してください。 2.組織収集 50 mLの遠心分離管に〜20mLのL-15培地を追加し、氷の上に置きます。 頸椎脱臼、またはその他の承認されたスケジュール1の方法により、マウスを安楽死させます。 注：腸組織は、通常C57BL6背景上のマウスから得られます。しかし、他の遺伝的背景はまた、129 / SvEv 15 例えば使用されています。イメージング実験は、 例えば GLU-金星1蛍光レポーターマウスを使用する必要があります。組織は、両性の成体マウス（2-6ヶ月）から取得されます。マウスはindividua内に収容されています水と通常の飼料に自由摂取アクセス LLY-換気ケージ。プロジェクトのライセンスでサポートされている場合は、腸内分泌細胞機能16に、例えば、高脂肪食の効果をテストするための実験を行うことができます。 解剖穏やか鉗子と解剖ハサミを使用して（直腸開始する幽門から）マウスの腸を除去します。使用する準備ができるまで氷上にL-15培地中に保管してください。 3.組織調製組織をカバーするのに十分なPBSを含有する10cmのペトリ皿に腸組織を置きます。 （幽門から遠位例えば上部小腸、上位10 cmの）所望の組織10センチ取ります。 プラスチック製パスツールピペット、冷却PBSを用いて腸内容物を洗い流します。 微妙グリップ、腸のセグメントの一端を鉗子を使用して、そこにパスツールピペットの先端を配置します。冷却PBSとの内容をフラッシュします。魔女になるまで両端から繰り返し内容のrityが出てフラッシュされています。新鮮なチルドPBSを含む清潔なペトリ皿に移します。 鉗子を使用して、同時に筋層をやってのけるないように注意しながら、脂肪組織および腸間膜を削除します。 ピール筋肉が細かい鉗子の2セットを使用して解剖顕微鏡下で、「靴下のように」オフ層。 注：この手順は必須ではないが、強くお勧めします。ここで説明したものに、筋層を除去する別の方法があります。例えば、腸前筋層の除去に、長手方向に第一切開することができます。 筋肉の可視フラップが存在する組織のより近位端に開始点を見つけます。静かに腸の周りのすべての道筋層の少量を引き離します。 注：筋層または腸上皮の引き裂きを回避するために、より大きな表面積をクランプするのではなく、Tを使用して張力を減少させます細かい鉗子のIPS。 引き離すと腸の周りの筋肉層を剥離開始優しく、腸をクランプし、可能な限り筋肉フラップの同じくらい。筋層と上皮の両方を引き裂く回避するために、一緒に閉じそれらを保つために鉗子の位置を再調整キープ。このようにして、腸のセグメント及び廃棄の全体の長さから筋肉層を除去します。 縦方向に開いた腸を切断し、新鮮な冷蔵PBSで清潔なペトリ皿に旋回することによって洗浄します。必要に応じて、残りの消化粥や粘液を取り除くために繰り返します。 〜1〜2ミリメートル2の正方形を達成し、〜20 mLにこれらを追加するために外科用メスの刃でミンチ組織をパスツールピペットを用いて50mLの遠心管中でPBSを冷却しました。ピペットに付着組織片を回避するために、先端部を切断し、PBSを用いて粉砕することによりピペットを濡らします。 静かに、さらに組織片を洗浄するためにチューブを振ります。組織が落ち着くと注ぐことを許可またはpPBSの大部分をオフipetteし、PBSが明確に見えるまで、新鮮なPBSで繰り返します。 BBMコートプレート/皿、消化中の4の調製注：以下の手順は、（37℃の水浴中でインキュベーション工程を有する）組織培養フード内で行われるべきです。 （無添加で）冷却されたDMEM中2％BMM溶液を調製します。仕事をしながら、氷の上で解決策を維持します。 2％溶液のために、140μLを加える7 mLのDMEM（単一の24ウェルプレートを調製するのに十分）にBMMを解凍しました。 250μLの2％BMMウェルあたり溶液（24ウェルプレート）またはガラスボトム撮像皿当たり加えます。 BMMの十分な重合を可能にするために37℃のインキュベーター内に少なくとも30分間コーティングしたプレート/皿をインキュベートします。 0.3 mg / mlとの溶液を形成し、溶解させるために反転させる（ステップ1.2および1.4からの）15 mgのコラゲナーゼに（無添加で）50mLの予め温めておいたDMEMを加えます。 にCEは、完全に新しい無菌50mL遠心管に0.2μmの無菌フィルターを通してコラゲナーゼ溶液を濾過、20mlの注射器を使用して、溶解しました。消化媒体として、このラベルを付けます。 5.組織消化 10mLの血清学的ピペットを用いてPBSから組織片を除去し、（無添加で）冷蔵滅菌DMEMを含有する無菌の50mLの遠心管に追加し、旋回した後、DMEMを除去します。 注：組織との接触前にDME​​Mで粉砕して、それを濡らし、血清ピペットに付着した組織を避けるために。 「ダイジェスト」1と2：細胞破片の除去および単一細胞 組織片に7 mLの消化培地を追加し、チューブにスワールを与えます。 37°Cの水浴中で5分間インキュベートします。 優しく（旋回ない）〜3秒のためのチューブを振ります。 予約、組織を消化培地を解決し、破棄することを許可します顕微鏡で見て、小容量。 注：始めたときに特に、非常に消化プロセスの進捗状況を測定するために顕微鏡下で各「ダイジェスト」（〜30μL）の少量を検査することが推奨されます。多くの陰窩は、この段階で観察されている場合は、振とうしながらも活発かもしれません。異なる「ダイジェスト」のステージは、一般的にどのように見えるかの代表的な画像については、 図1を参照してください。 （新鮮な消化培地で）ステップ5.2.-5.2.4を繰り返します。 「ダイジェスト」3〜5：暗号断片のコレクション 組織に7 mLの消化培地を追加します。 37℃で10分間インキュベートします。 インキュベーションの間、10〜12秒ごとに5分を振ります。 注：に振盪は「ダイジェスト」1と2振とうよりも活発です。 未消化組織は15mLの遠心分離管に消化培地を解決し、収集することを可能にします。もし組織が誤って媒体と共に、それは、沈降10mLの血清学的ピペットを使用して除去し、未消化組織を含む50mLの遠心分離管に戻ってそれを転送することを可能に収集されます。 遠心分離は、100×gで3分間RTで培地/上清を収集しました。 上清を捨て、穏やかな粉砕及び取り分けによって5mLの予め温めた培地に細胞ペレットを再懸濁。 顕微鏡下での細胞懸濁液の少量を検査する（ステップ5.2.4からの注を参照）。 注：理想的には、暗号の断片は「ダイジェスト」3細胞の破片や単一細胞と一緒に表示されるように始めます。 「ダイジェスト」4及び5は、低減細胞破片と陰窩フラグメントの有意に大きな数を含む（ 図1）。組織が消化されていないと暗号フラグメントが表示されない場合は、より積極的に振るすなわち 、必要に応じて強度を振って調整します。 手順を繰り返し5.3.1-5.3.6 5まで、「ダイジェスト」はされています完了または組織の大部分が消化されるまで（6 番目のダイジェストが必要とされ得ます）。 一度「ダイジェスト」3-5（又は3-6）収集された、遠心機から全ての上清を100×gで3分間RTで上清を消化します。 分泌実験のために、遠心分離の前に「ダイジェスト」3-5（または3-6）からの上清を兼ね備えています。 注：あまり組織をイメージング実験のために必要とされ、したがって、暗号フラグメントの数が多いクリーン（細胞デブリと単一細胞の非存在下）でダイジェスト上清を選択してください。これは典型的には4または5「ダイジェスト」。 上清を捨て、穏やかない塊が見えなくなるまで粉砕することによりペレットを再懸濁。再懸濁10μMのY-27632二塩酸塩を補充予め温めた培地にペレットを（アノイキス17を防ぐため）。イメージング実験のために分泌実験のために5 mLおよび2mLの培地を使用します。 フィルタ100-μmのフィルターを通して細胞懸濁液（任意の未消化組織を除去するため）。 （：それぞれ、分泌および画像化のために7 mLおよび4mLの総容量）を洗浄するためのフィルターを通して予め温めた培地のさらなる2mLの実行。 注：フィルタリングは必須ではないが、しかし、より大きな組織片は、プレート/皿に付着しない傾向があります。 図1：プライマリ小腸培養法から「ダイジェスト」の代表的な画像。 「ダイジェスト」1および2は、主に単一の細胞および細胞残屑を含むから、（A）は、典型的な材料。 （B）黒矢印3.「ダイジェスト」から製品の例は、ダイジェスト材料に現れる陰窩の断片を示します。 「ダイジェスト」4または5パネル（D）の代表的な（C）は、から材料を消化プール表します「ダイジェスト」3-5（C）に見られる大きな望ましくない組織片を除去するために100μmのフィルターに通しました。すべての画像は20X対物レンズを備えたデジタル倒立顕微鏡を用いて撮影しました。スケールバー=100μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 前記メッキ腸培養（陰窩細胞について富化） プレートまたは皿から過剰BMM溶液を除去し、ウェル分泌あたり250μLの予め温めた培地を加えます。 注：イメージング料理はとても迅速に次のステップに進んで乾燥から皿を防止するために、媒体なしで残されます。 プレート250μLの細胞懸濁液をウェルあたり（24ウェルプレート）またはガラスボトムディッシュあたり。 プレート滴下遅い「ジグザグ」を運動でも越え。暗号フラグメントが目にプレートを移動する前に〜5分間沈降することを許可します電子インキュベーター。 注：これはウェル内陰窩/細胞の均一な分布を奨励すべきです。 37℃で一晩プレート又は皿をインキュベートし、5％CO 2。 注：「まだら」単層が形成されている必要があります。 3回の洗浄の後に培養物の代表的な画像のために、 図2Aを参照。 皿当たり2mLの予め温めた培地と「洪水」撮像料理。 注：これらの料理は、メッキ以下まで〜72時間イメージングのために適しているであろう。結腸培養は、通常、7日までに、長く続きます。付着しなかった細胞は洗浄工程によって除去することができます。初代培養は、今の実験のために使用される準備ができています。