תרבויות עיקריות מעורבות של Murine מעי דק המיועד לחקר הפרשת הורמון גוט וההדמיה של תא חי תאי Enteroendocrine
Summary
פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והתרבות של תאי מעי דק בעכברים מעורבים. תרבויות מעיים העיקריות אלה מאפשרות החקירה של מסלולי איתות שבבסיס הפרשת פפטיד בטן באמצעות מספר הטכניקות.
Abstract
המעי הוא האיבר האנדוקרינית הגדול ביותר בגוף, עם תאים enteroendocrine מפרישי ההורמון ממוקמים לאורכה של האפיתל של הקיבה והמעיים. למרות החשיבות הפיזיולוגית שלהם, תאי enteroendocrine מייצגים רק חלק קטן של אוכלוסיית התא האפיתל ובעבר, אפיונם הציג אתגר משמעותי וכתוצאה מכך הסתמכות על מודלי קו התא. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור הבידוד וההתרבות של תאי מעי דק בעכברים מעורבים. תרבויות העיקריות אלה שמשו לזיהוי מסלולי האיתות שבבסיס הגירוי והעיכוב של הפרשת פפטיד בטן בתגובת מספר החומרים מזינים נוירופפטידים כמו גם סוכנים תרופתיים. יתר על כן, בשילוב עם שימוש עכברי כתב ניאון מהונדסים, הוכחנו כי התרבויות העיקריות אלה הופכים כלי רב עצמה עבור הבדיקה של תאי enteroendocrine fluorescently-tagged בבית ברמת tracellular, באמצעות שיטות כגון הידוק תיקון וסידן תא בודד הדמית cAMP-סריג.
Introduction
המטרה הכוללת של שיטה זו היא לבודד תאי מעי בעכברים מעורב תרבות כדי לאפשר לימוד הפרשת פפטיד במעי הדמית תא חי של תאי enteroendocrine. גרסה מוקדמת של הליך זה פורסם במקור ב- 2008 על ידי ריימן ואח. 1 ומאז היווה את הבסיס של 20 פרסומים נוספים מהקבוצה שלנו. עבור כתב היד הזה, בחרנו להתמקד תרבויות מעי דק כפי שהם יותר מאתגרים להקים מ תרבויות גסות.
תאים Enteroendocrine להפריש מערך של פפטידים הבטן כולל פפטיד גלוקגון דמוי 1 (GLP-1), גלוקוז-תלויים insulinotropic פפטיד (GIP), כולציסטוקינין (CCK) ו פפטיד YY (PYY) 2. יש פפטידים המעיים אלו תפקידים פיזיולוגיים חשובים ובארגון התגובות postprandial כגון האטת המעבר במעי, הגברה של שחרור אינסולין מגורה הגלוקוז אינדוקציה של שובע. GLP-1 mimeticsnd תרופות אשר מעכבים השפלה שלה מורשים כיום לטיפול בסוכרת מסוג 2 קיימת הערכה מתמשכת של הפוטנציאל הטיפולי של המרצת הפרשת אנדוגניים של פפטיד זה 3. הבנה טובה יותר של פיזיולוגית enteroendocrine ואת המנגנונים שבאמצעותם הפרשה או מגורה או עכבות הן, אפוא, חשיבות קריטית.
גוט הפרשת פפטיד ניתן ללמוד באמצעות מגוון של במבחנה לשעבר vivo מודלים ניסיוניים, כל אחד עם יתרונות וחסרונות (לסקירה מקיפה האחרונות גם מכסה את השימוש במודלים vivo לראות סוונדסן et al. 4). Ex vivo טכניקות כגון לתאי Ussing המעי 5 ו perfused המבודד 6 כרגע בשימוש לחקור הפרשת פפטיד בטן בתגובה לחומרים שונים. היתרון העיקרי של שיטות אלה, כמולעומת תרבויות עיקריות, הוא שהסביבה המיידית של תאי enteroendocrine נותרת שלמה ברובו וחשובה, את הקוטביות של התאים נשמרה. לכן, אפשר לשאוב מידע לגביהם תא משטח secretagogue פועל 6. עם זאת, אלה הם בדרך כלל טכניקות נמוכה התפוקה ואיכות הנתונים הנגזרים מהם מסתמכת במידה רבה על היושרה ואת הכדאיות של רקמת המעי, אשר בהכרח ירידה לאורך זמן.
Organoids מעיים כיום יותר ויותר בשימוש כמודלים חוץ גופית לחקר תפקוד התא enteroendocrine ופיתוח 7. Organoids, אשר יכול לנבוע הוא בעכברים ורקמות אדם, יש את היתרון של יצירת "דמוית הקריפטה" 3D מבנים המקיימים קוטבי בתא בתרבות. עם זאת, תאי enteroendocrine organoid הנגזרת טרם לאפיין באופן מלא דמיונם cel L מקורהls נשאר ברובו לא ידוע. יש תרבויות ראשיות היתרון של להיות צעד אחד קרוב יותר את ההגדרה הפיזיולוגית, כמו תאי enteroendocrine אינם מתוחזקים בדיל בתנאים מלאכותיים לתקופות זמן ממושכות.
שיטת תרבות העיקרית חלופה אשר הועסקה על ההערכה של הפרשת פפטיד בטן היא הבידוד של תאים במעי עכברוש עוברי (FRICs) 8. עם זאת, התרבות של רקמת מעי מבוגרת זוכה להצלחה פחות כמה הבדלים נצפו על היענות FRICs לעומת תאי מעי בעכברים בוגרים (למשל גלוקוז 8).
Enteroendocrine דמוי קווים סלולריים (למשל GLUTag, STC-1 ו- NCI-H716) שימשו באופן מסורתי להבחין vs ישיר. השפעות עקיפות על תאי enteroendocrine ולבתר מנגנונים מולקולריים שבבסיס צימוד גירוי ההפרשה; לראות Kuhre ואח </em>. 9 לייצור והפרשת פפטיד ידי שורות תאי "L תא דמוי" הונצחו. זה כבר צורך כתאי enteroendocrine, הפזורים לאורך מערכת העיכול, מהווים רק תחת 1% של תאי האפיתל במעי 10 ו תאים ממוינים, בידיים שלנו, אינם שורדים בתרבות 1. קווים סלולריים להישאר כלים שימושיים בשל העובדה כי הם אוכלוסייה הומוגנית בעיקרה תא שבו היא תורמת מניפולציות גנטיות כגון-להשתקת גנים. כתוצאה מכך, קל לחקור את התפקיד של חלבונים אשר לא יכול להיות ממוקד פרמקולוגית, כאשר עכברים מהונדסים אינם זמינים. עם זאת, שורות תאים אינן מודלים תמיד תקפים של תאים ראשוניים. אמנם יש קווי דמיון רבים, ממצאים מתרבויות ראשיות בהזדמנות הדגישו הבדלי מסלולי האיתות מופעלים על ידי חומרים מזינים מסוימים בתאי L העיקריים לעומת תאי GLUTag, למשל (למשל. Peptones <sup class = "Xref"> 11). באופן מכריע, בשילוב עם עכברי כתב ניאון מהונדסים, מודל התרבות העיקרי מאפשר בחינה מפורטת של תאי enteroendocrine העיקרי בודדים ברמת תאיים. Fluorescently- מתויגים בתאי L בתוך תרבויות עיקריות כבר בשימוש על ידי הקבוצה שלנו עבור תיקון clamping 1, 12 מחקרים, וסידן תא בודד 11, 13 ו הדמית monophosphate סריג אדנוזין מחזורי 14 מחקרים, אשר הניבו התקדמות משמעותית בתחום enteroendocrine פִיסִיוֹלוֹגִיָה.
הפרוטוקול הבא מותאם לביצוע ניסויי הפרשה, באמצעות צלחת 24-היטב או לעריכה של עד 16 מנות הדמיה, מן קטע 10 סנטימטרים של המעי הדק בין עכבר מבוגר יחיד. הפרוטוקול ניתן לשנות בקלות לחקר תאי המעי הגס על ידי הגדלת פעמים עיכול ושיתוףריכוז llagenase.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את הבידוד והתרבות של תאי מעי דק בעכברים מעורבים כדי לאפשר לימוד הפרשת פפטיד במעי הדמית תא בודד של תאי enteroendocrine שכותרתו.
כדי להגדיל את הסיכוי של תרבויות המעי דק להיות מוצלחות, חשוב כי הפרוטוקול מתבצע מהר ככל האפשר (רצוי, בתוך 3 שעות של קצירת הרקמות) וכי הרקמות נשמרות במדיום קר כקרח או חיץ לפני לתהליך העיכול, להגביל מוות של תאים. אמנם זה לא הכרחי, במיוחד עבור תרבויות גסות, הסרת שכבת השריר מן המעי הדק הוא מעודדים. פרוטוקול תרבות המעי הדק כבר טופל ככל האפשר. עם זאת, חשוב לציין כי אין תהליך העיכול הוא זהה. ישנם צעדים רבים במהלך הפרוטוקול הזה שבו השתנות ניתן הציגו על בסיס יום-יומי למשל מידת הסרת שריר, בגודל של t"טחון" הוא חתיכות רקמה, עוצמת רועדת, את העוצמה של קבוצה מסוימת של collagenase וכו. לכן, חשיבות עליונה לבחון aliquots של כל אחד שונה "מעכל" תחת מיקרוסקופ כדי להעריך את התקדמות תהליך העיכול חייט טלטול ומספר "מעכל" בהתאם. מומלץ ללחוץ יותר בעדינות מלכתחילה, ואם שברי הקריפטה אינם ברורות מן "לעכל" 3 ואילך, מתחיל לרעוד יותר בתקיפות.
מניסיוננו, תאי enteroendocrine לא להתרבות בתרבות ובדרך כלל הולכים לאיבוד מתרבויות קטנות מעי תוך 4 ימים. אף על פי כן, זה מאפשר מספיק זמן כדי לבצע ניסויי הפרשת פפטיד בטן (בדרך כלל מתבצע מעל 2 h, 18-24 ציפוי פוסט h) כדי לבדוק גירויים פיסיולוגיים ו / או סוכנים תרופתיים. ניסויים הדורשים דגירה לילה לפני הניסוי הפרשה גם למשל ריאליבמקרה של טיפול מקדים עם רעלן השעלת 15.
טכניקת התרבות העיקרית המוצגת כאן היא שיטה מבוססת היטב, כפי שמעיד היקף תפוקת מחקר זה פיק לאורך השנים. מודל התרבות העיקרי נעשה שימוש כדי ללמוד את הפרשת מגוון של פפטידים בטן, כולל GLP-1 1, GIP 18 ו PYY 19, בתגובה המזינה מגוון ולא מזין 14, 20 גירויים ומעכבים. יתר על כן, באותה הטכניקה יושמה בהצלחה לתרבות של תאים אנושיים מעיים 21. לעתים קרובות, שילוב של שיטת תרבית תאים ראשונית יחד עם למשל מודל ניסיוני נוסף. vivo לשעבר או in vivo יכול לספק את רוב תובנה 6. יש לציין, ובניגוד לשיטות אחרות, הטכניקה הזו יש imיישומים הנסב מעבר למדידה של שחרור פפטיד המעיים. הוכחנו כי תרבויות מעי דק עיקריות נגזרו עכברי כתב מהונדסים הם כלים רבים עצמה עבור החקירה של מסלולי איתות תאיים המצמידים בבטן הפרשת פפטיד, באמצעות למשל Ca 2+ וחיישנים מחנים, 11 GCaMP3, 13 ו Epac2camps 14, בהתאמה, כמו גם טכניקות אלקטרו 12.
כמו בכל הדגמים במבחנה, תרבויות המעיים העיקריות יש מגבלות מובנות מסוימות, לרבות אובדן הקוטביות של תאי האפיתל בתרבות, כמו גם האובדן של היצע עצבוב דם. קשה לאמוד את ההשפעות האפשריות של תנאים מלאכותיים אלה על תפקוד התא enteroendocrine. עם זאת, נתונים המתקבלים מתרבויות עיקריות עמדו פעמים רבות לתרגום ב in vivo settiננוגרם (למשל ההשפעות של חומצות שומן קצרות שרשרת על GLP-1 הפרשת 15).
תרבויות המעיים העיקריות הן טכניקה תכליתית עם יישומים פוטנציאליים רבים. הם כבר סיפקו תובנות מכניסטית חשוב אל תקנה של הפרשת פפטיד המעיים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
GLP-1-מבחנים חיסוניים בוצעו על ידי מעבדת assay ביוכימיים Core בבית חולי Addenbrooke.
עבודה זו, לאורך השנים, היה נתמך על ידי קרן Wellcome (כיום מענקים פעילים 106,262 / Z / 14 / Z ו- 106,263 / Z / 14 / Z) ואת המועצה למחקר רפואי (MRC) (מענקים MRC_MC_UU_12012 / 3 ו MRC_MC_UU_12012 / 5).
Materials
| 24-well plates | Costar | 3524 | For secretion experiments |
| Bombesin | Sigma-Aldrich | B4272 | Positive control (calcium imaging experiment) |
| Centrifuge tubes, 15 ml, sterile | Greiner bio-one | 188261 | For tissue preperation/ digestion |
| Centrifuge tubes, 50 ml, sterile | Corning | 430828 | For tissue preperation/ digestion |
| Collagenase XI (Crude) | Sigma-Aldrich | C9407 | For making up digestion medium |
| Dichroic mirror | Cairn Research | – | For imaging experiments |
| DMEM High glucose (4500 mg) | Sigma-Aldrich | D6546 | For dissolving matrigel (keep at 4 oC). For making up digestion medium, pre-warm to 37 oC. |
| Emission Filter (Bandwidth 510-560 nm) | Cairn Research | – | For imaging experiments |
| Foetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | For making up culture medium |
| Forceps/Tweezers | Agar Scientific | AGT520 | For dissection/removal of intestine |
| Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | Positive control (secretion experiment) |
| Glass-bottomed dishes (35 mm) | MatTek | P35G-0-14-C | For imaging experiments |
| High precision tweezer (110 mm) | IDEAL-TEK | 3480641 (5 SA) | For removing muscle layer |
| High resolution digital CCD camera | Hamamatsu | ORCA-ER | For imaging experiments |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I7018 | Positive control (secretion experiment) |
| L-15 Medium (Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L1518 | For collecting tissue, keep on ice |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | For making up culture medium |
| Matrigel | Corning | 354234 | Basement Membrane Matrix, for coating plates and dishes |
| MetaFluor | Molecular Devices (supplied by Cairn Research) | – | Fluorescence ratio imaging software |
| Mice (C57BL6) | Charles River Laboratories | C57BL/6J | Background mice used for breeding. Can also be used for secretion experiments |
| Mice (GLU-cre x ROSA26 GCaMP3) | in house | – | For calcium imaging and secretion experiments |
| Microscope (EVOS XL Core) | Thermo Fisher Scientific | AMEX1000 | For photomicrographs of cultures |
| Microscope | Olympus | IX71 | Inverted microscope with 40x oil objective used for imaging experiments |
| Monochromator | Cairn Research | – | For imaging experiments |
| Pasteur pipettes | Alpha Laboratories | LW4234 | For cleaning tissue |
| PBS containing Ca2+ and Mg2+ | Sigma-Aldrich | D8662 | For washing tissue, keep on ice |
| Penicillin & Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | For making up culture medium |
| Petri dishes (100 mm x 20 mm) | Corning | CLS430167 | For cleaning tissue and removing muscle layer |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P/4280/53 | Positive control (calcium imaging experiment) |
| Scissors | Agar Scientific | AGT554 | For dissection/removal of intestine |
| Sterile cell strainer 100 µm | Fisher Scientific | 22363549 | For filtering crypt cell suspension prior to plating |
| Surgical scalpel blade No.22 (sterile, stainless) | Swann Morton | 0308 | For dicing tissue |
| Syringe filters, Minisart NML (0.2 µm pore size) | Sartorius | 16534-K | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
| Syringes, 20 ml, disposable, sterile, Luer slip | BD | 300613 | For filter-sterilising collagenase solution (digestion medium) |
| Xenon arc lamp 75W | Cairn Research | – | For imaging experiments |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | ROCK inhibitor, prepare 10 mM stock solution in sterile water (use 1:1000 in final culture medium) |
References
- Reimann, F., Habib, A. M., Tolhurst, G., Parker, H. E., Rogers, G. J., Gribble, F. M. Glucose sensing in L cells: A primary cell study. Cell Metab. 8, 532-539 (2008).
- Psichas, A., Reimann, F., Gribble, F. M. Gut chemosensing mechanisms. J Clin Invest. 125 (3), 908-917 (2015).
- Lovshin, J. A., Drucker, D. J. Incretin-based therapies for type 2 diabetes mellitus. Nat Rev Endocrinol. 5 (5), 262-269 (2009).
- Svendsen, B., Holst, J. J. Regulation of gut hormone secretion. Studies using isolated perfused intestines. Peptides. 77, 47-53 (2016).
- Kuhre, R. E., Frost, C. R., Svendsen, B., Holst, J. J. Molecular mechanisms of glucose-stimulated GLP-1 secretion from perfused rat small intestine. Diabetes. 64 (2), 370-382 (2015).
- Brighton, C. A., et al. Bile acids trigger GLP-1 release predominantly by accessing basolaterally located G protein-coupled bile acid receptors. Endocrinology. 156 (11), 3961-3970 (2015).
- Petersen, N., et al. Generation of L cells in mouse and human small intestine organoids. Diabetes. 63 (2), 410-420 (2014).
- Brubaker, P. L., Vranic, M. Fetal rat intestinal cells in monolayer culture: a new in vitro system to study the glucagon-like immunoreactive peptides. Endocrinology. 120 (5), 1976-1985 (1987).
- Kuhre, R. E., et al. Peptide production and secretion in GLUTag, NCI-H716, and STC-1 cells: a comparison to native L-cells. J Mol Endocrinol. 56 (3), 201-211 (2016).
- Gerbe, F., et al. Distinct ATOH1 and Neurog3 requirements define tuft cells as new secretory cell type in the intestinal epithelium. J Cell Biol. 192 (5), 767-780 (2011).
- Pais, R., Gribble, F. M., Reimann, F. Signalling pathways involved in the detection of peptones by murine small intestinal enteroendocrine L-cells. Peptides. 77, 9-15 (2016).
- Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. J Physiol. 589 (Pt 5), 1081-1093 (2011).
- Emery, E. C., et al. Stimulation of GLP-1 secretion downstream of the ligand-gated ion channel TRPA1. Diabetes. 64 (4), 1202-1210 (2015).
- Psichas, A., Glass, L. L., Sharp, S. J., Reimann, F., Gribble, F. M. Galanin inhibits GLP-1 and GIP secretion via the GAL1 receptor in enteroendocrine L and K cells. Br J Pharmacol. 173 (5), 888-898 (2016).
- Tolhurst, G., et al. Short-chain fatty acids stimulate glucagon-like peptide-1 secretion via G-protein-coupled receptor FFAR2. Diabetes. 61 (2), 364-371 (2012).
- Richards, P., et al. High fat diet impairs the function of glucagon-like peptide-1 producing L-cells. Peptides. 77, 21-27 (2016).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Parker, H. E., Habib, A. M., Rogers, G. J., Gribble, F. M., Reimann, F. Nutrient-dependent secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from primary murine K cells. Diabetologia. 52 (2), 289-298 (2009).
- Pais, R., Rievaj, J., Larraufie, P., Gribble, F. M., Reimann, F. Angiotensin II type 1 receptor-dependent GLP-1 and PYY secretion in mice and humans. Endocrinology. 157 (10), 3821-3831 (2016).
- Moss, C. E., et al. Somatostatin receptor 5 and cannabinoid receptor 1 activation inhibit secretion of glucose-dependent insulinotropic polypeptide from intestinal K cells in rodents. Diabetologia. 55 (11), 3094-3103 (2012).
- Habib, A. M., Richards, P., Rogers, G. J., Reimann, F., Gribble, F. M. Co-localisation and secretion of glucagon-like peptide 1 and peptide YY from primary cultured human L cells. Diabetologia. 56 (6), 1413-1416 (2013).
