Mixed colture primarie di murino tenue finalizzate allo studio di Gut secrezione dell'ormone e imaging cellulare dal vivo di celle enteroendocrine

Tutte le procedure di animali sono stati approvati dalla University of Cambridge Animal Welfare ed etico organo di valutazione ed adeguato alle Animali (Procedure Scientifiche) Act del 1986 Emendamento regolamenti (SI 2012/3039). 1. Preparazione in anticipo Mettere un'aliquota di matrice di membrana basale (BMM) (~ 200 mL) sul ghiaccio a sciogliersi. NOTA: Il BMM solidifica a temperatura ambiente (RT). Preriscaldare 50 mL sterile ad alta glucosio Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) (senza aggiunte) e ~ 40 mL cultura sterile media (DMEM high-glucosio supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS), 100 U / mL di penicillina e 0,1 mg / mL di streptomicina (P / S), e 2 mM L-glutammina) in 50 mL provette da centrifuga in un bagno d'acqua a 37 ° C. Pre-freddo calcio e magnesio contenenti salina tamponata con fosfato (PBS). Pesare 15 mg di collagenasi (XI greggio), aggiungere un tubo da 50 ml centrifuga e tenerlo in ghiaccio. <li> ATTENZIONE: Collagenasi è nocivo. Esso provoca irritazione della pelle (H315) e grave irritazione oculare (H319). Può provocare sintomi allergici o asmatici o difficoltà respiratorie se inalato (H334). Essa può causare irritazione respiratoria (H335). Utilizzare dispositivi di protezione adeguati, evitando la formazione di polvere e inalare polvere. Assicurare una adeguata ventilazione. 2. Tissue Collection Aggiungere 20 ml di L-15 di media ~ ad un tubo da 50 ml per centrifuga e posizionarlo sul ghiaccio. Eutanasia un topo per dislocazione cervicale, o altro metodo approvato pianificazione 1. NOTA: intestinale tessuto è tipicamente ottenuto da topi su uno sfondo C57BL6. Tuttavia, altri sfondi genetici sono stati utilizzati anche per esempio 129 / SvEv 15. Esperimenti di imaging richiedono l'uso di topi indicatori fluorescenti es GLU-Venere 1. Il tessuto è ottenuto da topi adulti (2-6 mesi) di entrambi i sessi. I topi sono alloggiati in individuagabbie con ad libitum accesso all'acqua e chow regolare lly ventilato. Tuttavia, gli esperimenti per testare l'effetto di una dieta ricca di grassi, ad esempio, sulla funzione delle cellule enteroendocrine 16 può essere eseguita se supportato da una licenza del progetto. Sezionare e rimuovere delicatamente intestino mouse (dal piloro dell'inizio della retto) con pinze e forbici dissezione. Conservarlo in media L-15 sul ghiaccio fino al momento dell'uso. 3. Preparazione del tessuto Posizionare tessuto intestinale in una capsula di Petri 10 centimetri contenente PBS sufficiente a coprire il tessuto. Prendere 10 cm di tessuto desiderato (es superiore dell'intestino tenue, primi 10 cm, distali al piloro). Lavare contenuto intestinale usando una pipetta Pasteur di plastica e rilassato PBS. Utilizzando pinze, delicatamente presa un'estremità del segmento intestinale e posizionare la punta di una pipetta Pasteur in esso. Lavare contenuti con refrigerata PBS. Ripetere da entrambe le estremità fino a quando il majorezza dei contenuti è stato stanato. Trasferimento in una capsula di Petri pulito contenente fresche, refrigerate PBS. Utilizzando pinze, rimuovere il tessuto adiposo e mesentere, avendo cura di non tirare fuori lo strato muscolare allo stesso tempo. Sbucciare il muscolo strato off "come un calzino" sotto un microscopio da dissezione utilizzando due set di pinza sottile. NOTA: Questo passaggio non è essenziale, ma è altamente raccomandato. Ci sono modi alternativi di rimozione dello strato muscolare a quello descritto qui. Ad esempio, l'intestino può essere sezionato longitudinalmente prima, prima della rimozione dello strato muscolare. Trovare un punto di partenza al termine più prossimale del tessuto in cui c'è un lembo visibile del muscolo. Delicatamente tirare via una piccola quantità di tessuto muscolare tutto intorno l'intestino. NOTA: per evitare la lacerazione dello strato muscolare o l'epitelio intestinale, ridurre la forza di tensione serrando una superficie maggiore anziché utilizzare il tips delle belle pinze. Bloccare l'intestino e tanto del lembo muscolo possibile estrarre lentamente a parte e iniziare staccava lo strato muscolare intorno l'intestino. Per evitare di strappare sia lo strato muscolare ed epitelio, mantenere reimpostato la posizione della pinza per tenerli ravvicinati. In questo modo, rimuovere lo strato muscolare della intera lunghezza del segmento intestinale e scarti. Tagliare l'intestino aperta longitudinalmente e lavare agitando in un piatto pulito Petri con fresche refrigerate PBS. Ripetere, se necessario, per rimuovere ogni residuo di chimo o muco. Tessuto tritare con una lama di bisturi chirurgico per raggiungere piazze di ~ 1-2 mm 2 e aggiungere questi per ~ 20 mL raffreddato PBS in una provetta da centrifuga da 50 ml con una pipetta Pasteur. Per evitare pezzi di tessuto che attaccano alla pipetta, tagliare la punta e bagnare la pipetta triturando con PBS. Agitare delicatamente il tubo per lavare ulteriormente i pezzi di tessuto. Lasciare che il tessuto di stabilirsi e di versare o pipette fuori la maggior parte della PBS e ripetere con PBS fresco fino a quando la PBS sembra chiaro. 4. Preparazione di BBM-rivestito Piastra / Piatti e digestione Media NOTA: Le seguenti operazioni devono essere eseguite in una cappa coltura tissutale (con fasi di incubazione a 37 ° C bagnomaria). Preparare una soluzione BMM 2% in DMEM freddo (senza aggiunte). Mentre si lavora, tenere la soluzione su ghiaccio. Per una soluzione al 2%, aggiungere 140 microlitri scongelato BMM a 7 ml DMEM (sufficiente per preparare una singola piastra da 24 pozzetti). Aggiungere 250 microlitri 2% soluzione BMM per pozzetto (24-pozzetti) o al bicchiere fondo piatto imaging. Incubare rivestiti piatti / piatti per almeno 30 minuti in un incubatore a 37 ° C per consentire un'adeguata polimerizzazione della BMM. Aggiungere il DMEM 50 mL pre-riscaldato (senza aggiunte) alla collagenasi 15 mg (da Piazza di 1.2 e 1.4) per formare una soluzione di 0,3 mg / ml e invertire a dissolversi. Soprace completamente sciolto, utilizzando una siringa da 20 ml, filtrata la soluzione di collagenasi attraverso un filtro sterile da 0,2 pm in una nuova provetta sterile 50 centrifuga. Etichettare questo come mezzo di digestione. 5. Tessuto Digestione Rimuovere i pezzi di tessuto dalla PBS usando una pipetta 10 ml sierologica e aggiungere un sterile provetta da centrifuga da 50 mL contenente DMEM sterile raffreddata (senza aggiunte), turbolenza e quindi rimuovere DMEM. NOTA: per evitare tessuto attaccare alla pipetta sierologica, bagnò mediante triturazione con DMEM prima del contatto con il tessuto. 'Digest' 1 e 2: rimozione di detriti cellulari e cellule singole Aggiungere 7 ml di medio digestione per i pezzi di tessuto e dare il tubo di un vortice. Incubare per 5 minuti in un bagno d'acqua a 37 ° C. Agitare delicatamente (non agitare) il tubo per ~ 3 s. Lasciare che il tessuto di stabilirsi ed eliminare il mezzo di digestione, riservando unpiccolo volume a guardare sotto il microscopio. NOTA: Soprattutto quando si inizia, si consiglia vivamente di ispezionare un piccolo volume di ogni 'digerire' (~ 30 mL) sotto il microscopio per valutare lo stato di avanzamento del processo di digestione. Se molti cripte sono osservati in questa fase, l'agitazione può essere troppo vigorosa. Per le immagini rappresentative di ciò fasi diversa 'digest' tipicamente assomigliano, fare riferimento alla Figura 1. Ripetere i punti 5.2.-5.2.4 (con media digestione fresco). 'Digest' 3-5: raccolta di frammenti cripta Aggiungere 7 ml di medio digestione al tessuto. Incubare per 10 minuti a 37 ° C. Durante l'incubazione, agitare ogni 5 minuti per 10-12 s. NOTA: L'agitazione è più vigorosa rispetto al agitazione per 'digest' 1 e 2. Lasciare che il tessuto non digerito di stabilirsi e raccogliere il mezzo di digestione in una provetta 15 centrifuga. Seil tessuto viene raccolto accidentalmente e il mezzo, permettono di risolvere, rimuoverlo usando una pipetta sierologica 10 mL e le trasferisce di nuovo al tubo da centrifuga da 50 mL contenente il tessuto non digerito. Centrifuga raccolto medio / supernatante a RT per 3 min a 100 x g. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 5 ml di terreno di coltura pre-riscaldato mediante triturazione dolce e messo da parte. Ispezionare un piccolo volume di sospensione cellulare al microscopio (vedi nota dal punto 5.2.4). NOTA: Idealmente, frammenti cripta iniziano a comparire in 'digerire' 3 insieme a detriti cellulari e singole cellule. 'Digest' 4 e 5 contengono un numero significativamente maggiore di frammenti cripta con ridotta detriti cellulari (Figura 1). Regolare scuotendo intensità come necessità, ossia se il tessuto non è digerire e frammenti cripta non stanno comparendo, agitare più vigorosamente. Ripetere passaggi 5.3.1-5.3.6 fino al 5 'digest' sono staticompletato o finché è stato digerito la maggior parte del tessuto (a 6 ° digest può essere richiesto). Una volta che tutti i supernatanti da 'digest' 3-5 (o 3-6) sono state raccolte, centrifugare la digerire sopranatanti a temperatura ambiente per 3 min a 100 x g. Per gli esperimenti di secrezione, combinare i surnatanti da 'digest' 3-5 (o 3-6) prima della centrifugazione. NOTA: meno tessuto è necessaria per esperimenti di imaging, quindi scegliere il surnatante digest che è il più pulito (assenza di detriti cellulari e cellule singole) con il maggior numero di frammenti cripta. Questo è in genere 'digerire' 4 o 5. Eliminare il supernatante e delicatamente risospendere il pellet triturando fino grumi sono visibili. Risospendere il precipitato in mezzo di coltura pre-riscaldato supplementato con 10 pM Y-27632 dicloridrato (per evitare anoikis 17). Utilizzare 5 mL per esperimenti di secrezione e 2 mL di terreno di coltura per esperimenti di imaging. Filtrosospensione cellulare attraverso un filtro da 100 micron (per rimuovere qualsiasi tessuto non digerito). Eseguire un ulteriore 2 ml di terreno di coltura pre-riscaldato attraverso il filtro di lavare (volume totale: 7 ml e 4 ml di secrezione e di imaging, rispettivamente). NOTA: Il filtro non è essenziale, tuttavia, frammenti di tessuto grandi non tendono ad aderire alle piastre / stoviglie. Figura 1: Immagini rappresentative di 'digest' dal piccolo metodo di coltura intestinale primitiva. (A) materiale tipica dalla 'digest' 1 e 2 contenente cellule principalmente singole e detriti cellulari. (B) Un esempio di prodotti di 'digerire' 3. Le frecce nere indicano frammenti cripta appaiono nel materiale digerire. (C) tipica di 'digerire' 4 o 5. Pannello (D) rappresenta pooled digerire materiale da'digest' 3-5 fatta passare attraverso un filtro 100 micron per rimuovere i frammenti di tessuto indesiderate grandi visto in (C). Tutte le immagini sono state scattate con un microscopio invertito digitale con un obiettivo 20X. Barre di scala = 100 um. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura. 6. Culture placcatura intestinali (arricchito da crypt cellule) Rimuovere la soluzione in eccesso dalla BMM piatto o piatti, e aggiungere 250 microlitri terreno di coltura pre-riscaldato per secrezione bene. NOTA: Imaging piatti sono lasciati senza prodotto così procedere al passo successivo rapidamente per impedire il piatto si secchi. Piastra 250 microlitri di sospensione cellulare per pozzetto (24-pozzetti) o per vetro piatto inferiore. Piastra goccia a goccia in un movimento lento 'zig-zag' tutto il bene. Consentire frammenti cripta di stabilirsi per ~ 5 minuti prima di passare la piastra a the incubatore. NOTA: Questo dovrebbe incoraggiare una distribuzione uniforme delle cripte / cellule all'interno del pozzo. Incubare la piastra o piatti notte a 37 ° C e 5% CO 2. NOTA: un monostrato 'macchia di leopardo' avrebbe dovuto formata. Per un'immagine rappresentativa di culture seguenti tre lavaggi, vedere la Figura 2A. 'inondazione' piatti di imaging con 2 mL di terreno di coltura pre-riscaldato a piatto. NOTA: Questi piatti saranno adatti per l'imaging fino a ~ 72 ore dopo la placcatura. culture del colon in genere durano più a lungo, fino a 7 giorni. Le cellule che non hanno aderito possono essere rimossi da una fase di lavaggio. Colture primarie sono ora pronti per essere utilizzati per gli esperimenti.