Espaciais e temporais Análise do Active ERK na<em> C. elegans</em> germinativa

O protocolo aqui descrito é essencialmente para o sistema de modelo de invertebrado C. elegans, e segue todas as diretrizes éticas estabelecidas pela instituição. 1. Manutenção animal Manter C. elegans trabalhando culturas de sobre Nematóides Meio de Crescimento 20,21 (NGM, veja Materiais Tabela) agar semeado com E. coli OP50. Manterem um nível sem-fim, a temperaturas entre 16 ° C e 25 ° C. NOTA: A cultura de vermes em temperaturas mais altas resulta em taxa mais rápida de crescimento, muitas vezes, o desenvolvimento da linha germinativa aberrante e tamanhos de cria mais baixos. Além disso, a temperatura genótipos sensíveis irão exibir diferentes fenótipos a diferentes temperaturas. Transferir vermes para novas placas NGM cada 2 – 3 dias, dependendo da sua taxa de crescimento, de modo a manter um fornecimento constante de vermes bem alimentados. NOTA: Para qualquer experimento envolvendo níveis dpERK, vermes não deve ser obtido a partir de uma fome ou multidãoplaca ed. Apinhamento ou impactos de fome insulina sinalização em vermes 22, e sinalização de insulina regula ERK 12 actividade. Assim vermes de placas em jejum ou superlotadas resultará em padrões de coloração variáveis ​​e difíceis de reproduzir. 2. Dissecção de vermes adultos para Obtenção Gonads Escolha 100-150 WT (N2) ou genótipo desejado de vermes no estádio de desenvolvimento desejado e específico (L1, L2, L3, L4, adultos, etc.) Em 100 uL de tampão M9 num tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Encher o tubo de microcentrífuga com 900 jil de tampão M9 (ver Tabela Materiais). Centrifugar os tubos a 1000 x g numa microcentrífuga durante 1 minuto à temperatura ambiente. Remova cuidadosamente 900 l do tampão M9 e descarte. Remover o tampão sob um microscópio de dissecação para assegurar que os vermes são não acidentalmente removido. Repita os passos 2.2 – 2.3 mais duas vezes com M9 fresco tampão de cada vez.Isso garante que todas as bactérias que foram transitadas com os vermes são efetivamente lavados. Após a lavagem final remover 900 mL de tampão M9 a partir do tubo e descarte. Transfira a 100 mL de M9 buffer restante contendo os 100 – 150 vermes com uma ponta de 200 mL-micropipeta para um prato de vidro de relógio de fundo plano. Certifique-se de que a ponta da micropipeta é cortado na marca de 10 uL antes da utilização. Não corte da ponta vai resultar em ruptura dos vermes. Adicione 1 – 3 mL de levamisol 0,1 M para o prato relógio de vidro contendo os vermes em tampão M9. Agite suavemente o levamisol eo M9 para permitir a mistura ainda até que os vermes parar de se mover. NOTA: existências levamisol podem ser armazenadas a -20 ° C para armazenamento a longo prazo. Aqui, utilizar a maior concentração de 1 – 3 mm mais que tem sido descrita na literatura 23 de 0,2 – 0,25 mM de levamisol, a fim de obter uma rápida perda de mobilidade nos animais. Se os animais esfolar em torno de demasiado long na suspensão líquida, os padrões resultantes de dpERK nas gónadas pode ser variável (devido ao stress ou falta de alimentação, ou ambos). padrões de coloração mais reprodutíveis foram alcançados com 1-3 levamisol mM para dissecção. Anexar duas agulhas 25 G para duas seringas de 1 mL (o tamanho da seringa, não importa, o calibre da agulha é crítica). Posição uma seringa em cada lado (figura 2). Sob um microscópio de dissecação, a posição de cada agulha por baixo e por cima de cada verme, como mostrado na Figura 2 e colocar um corte fino sobre o verme perto da segunda lâmpada da faringe num movimento do tipo tesoura. Depois de um corte no verme passar para o próximo animal até que todos os animais no prato foram cortados pelo menos uma vez. NOTA: Esteja consciente de que as etapas 2,8-2,9 são sensíveis ao tempo. Dissecar todos os vermes no prato em menos de cinco minutos para um padrão dpERK reprodutível. vezes dissecação mais longos irá resultar em uma desligar do sinal dpERK, especialmente em Zum 1. Ajuste o número de vermes por rodada de dissecção (ou seja, 50 vermes vs. 150) se necessário para permanecer no prazo estipulado. No caso de um gonad extrudido não é visível durante a dissecção, não tente outro corte no mesmo animal. Normalmente, isso só vai cortar o animal e não resultar na extrusão da gônada. Em vez disso, passar para o próximo animal. Worms, onde as gônadas não expulsar aparece como tal nos slides que serão feitas na secção 6 e podem ser ignorados durante o exame NOTA: através de todas as etapas de dissecção e processamento, é importante ter em mente que a gônada permanecerá ligado ao corpo / carcaça. Não force a gônada eo corpo distante com a agulha. Muitas vezes uma lágrima no tecido aberrante gonadal em uma tentativa de cortar a gónada do corpo podem resultar em anticorpos sinal espúrio. O corpo / carcaça pode ser ignorado durante os passos de imagem (secção 6), e apenas a gônada trabalhada. Além disso, Sometimes as células intestinais podem também servir como controlos internos / controlos somáticas para o anticorpo a ser ensaiado. 3. Gonad Fixation Após a dissecção está completa, adicionar 2 ml de 3% de paraformaldeído (PFA) directamente para o prato de vidro contendo o relógio 100 mL de M9 e os animais dissecados e cobrir com Parafilm. Coloque o prato de vidro de relógio coberto por uma Cobertura de vapores químicos. Cuidado: PFA é um produto químico perigoso. Assim, a fixação deve ser realizada na hotte química. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min. Usando um descartável pipeta 9 "Pasteur de vidro adicionar 3 mL de 1x PBS-T (ver Materiais Tabela) para o prato de vidro de relógio contendo os animais dissecados. Mistura, extraindo a solução PFA e o 1x PBS-T com os animais dissecados no Pasteur pipeta e liberando o suavemente para o prato de vidro de relógio. não vortex os tubos durante as lavagens. Usando uma frepipeta Pasteur sh vidro chamar a 5 ml de líquido (contendo vermes dissecados, PFA e 1x PBS-T) do prato de vidro de relógio para a pipeta Pasteur e transferir o conteúdo em um 5 ml tubo cônico de vidro fresco. Centrifugar os tubos cónicos de 30 segundos em uma centrífuga clínica a 1000 x g. Use pipetas Pasteur de vidro e tubos cônicos como gônadas dissecados ficar com plástico. Remova e descarte o sobrenadante tendo o cuidado de modo a não perturbar os animais dissecados. Remover o líquido após cada lavagem do tubo cónico sob um microscópio de dissecação, de modo a não afectar as gónadas dissecados, e minimizar a sua perda. Com uma pipeta Pasteur fresca, adicione 5 mL de 1x PBS-T aos tubos cônicos. Centrifugar os tubos cónicos em uma centrífuga clínica durante 30 segundos a 1000 x g. Remova e descarte o sobrenadante tendo o cuidado de modo a não perturbar os animais dissecados. Repetir o passo 3.7 para um total de três vezes. Com uma pipeta Pasteur fresca, adicione 2 mL de 100%metanol para os tubos, e misture delicadamente as gônadas com o metanol através da elaboração para a pipeta Pasteur. Incubar o tubo à temperatura de -20 ° C durante um mínimo de 1 h. NOTA: dissecado gónadas pode ser armazenado em metanol durante 2 dias para coloração dpERK. Armazenamento durante mais de 2 dias e até 2 semanas é compatível com outras aplicações de coloração de anticorpo, tais como anticorpo anti-Lamin, mas não com o anticorpo dpERK. Após o tempo de incubação desejado, repetir o passo 3.7 para um total de três vezes, a fim de lavar as gónadas. Não vortex dos tubos durante as lavagens. Após a lavagem final sair 500 ul de 1x PBS-T no tubo cónico de 5 mL. Usando uma pipeta de Pasteur fresco transferir o conteúdo do tubo de vidro cónico para um novo tubo de vidro de 1 mL (6 mm x 50 mm). Permitir que os animais dissecados para resolver pela força da gravidade para 5 – 10 min. Usando uma pipeta de Pasteur fresco e sob um microscópio de dissecação, remover tanto da lavagem como possíveis a partir de 1 ml a tubos de vidro witHout perturbar as gônadas dissecados. 4. Bloqueio e Antibody Tratamento Primário Adicionar 100 uL de 30% de Soro normal de cabra (NGS) diluído em 1x PBS-T (ver Tabela Materiais) para os animais dissecados nos tubos de vidro de 1 ml. 30% NGS serve como o tampão de bloqueio. Cobrir o tubo com Parafilm para evitar a evaporação do líquido. Incubar à temperatura ambiente durante 1 h ou a 4 ° C durante a noite. Após o tempo desejado de incubação, remover o tampão de bloqueio usando uma pipeta de Pasteur fresco, removendo tanto líquido quanto possível. Use um microscópio de dissecação para garantir que as gônadas não estiver redigido na pipeta Pasteur. Diluir o anticorpo MAPKYT (ver Materiais Tabela, que se refere este método como dpERK) a 1: 400 em 30% NGS. Prepare diluição do anticorpo suficiente para usar 100 mL por tubo. anticorpo não utilizado, diluído pode ser armazenado a 4 ° C durante uma semana. Adicionar 100 ul do anticorpo anti-dpERK diluída assimlução para os tubos de vidro de 1 ml contendo os animais dissecados. Selar os tubos com Parafilm. Incubar os tubos a 4 ° C durante a noite. Após incubação durante a noite, adicionar 800 ul de 1x PBST para os tubos à TA. Desenhar a amostra em uma pipeta de Pasteur de vidro frescos e libertar suavemente para assegurar que as gónadas estão uniformemente suspensos no 1x PBS-T. Deixe as gônadas para liquidar o fundo com a gravidade. Remover o sobrenadante. Isso garante que as gónadas dissecados são lavadas mas não danificado durante o processo. Repita os passos de 4,5-4,6 para um total de três lavagens. Não vortex dos tubos durante as lavagens. Após a terceira lavagem certifique-se de remover e descartar o máximo possível sobrenadante sem perturbar os animais dissecados. Certifique-se que uma pipeta Pasteur fresco é usado cada vez. 5. Tratamento Secundário Anticorpo Durante o anticorpo primário lavagens preparar a diluição para o anticorpo secundário. Diluir o anti-rato seanticorpo cundária a 1: 500 em 30% NGS. Tal como acontece com o anticorpo primário, utilizar 100 uL por tubo. anticorpo não utilizados podem ser armazenados a 4 ° C durante uma semana. Adicionar 100 uL solução de anticorpo secundário para os tubos de vidro de 1 ml contendo os animais dissecados. Cobrir cada tubo com parafilme, e, em seguida, enrolar os tubos em papel de alumínio para manter o conteúdo do tubo no escuro. Incubar os tubos à temperatura ambiente durante 2 h, ou, alternativamente, a 4 ° C durante a noite. Após o tempo desejado de incubação, adicionar 800 ul de 1x PBS-T para os tubos e repetir os passos 4,5-4,6 para um total de três vezes. Após a lavagem final, remover e descartar o máximo do sobrenadante quanto possível sob um microscópio de dissecação com uma pipeta de Pasteur fresco. Preparar a solução de DAPI durante as lavagens para o anticorpo secundário. Dilui-se 1 mL de DAPI (a partir de uma 1.000x estoque de 1 mg / ml armazenadas a -20 ° C) in- 1 mL de 1x PBST. Adicionar 800 ul da solução diluída DAPI para os tubos contendo oanimais dissecados. Cubra a boca do tubo com parafilme, e enrole cada tubo em papel alumínio. Incubar à temperatura ambiente durante 20 min. Após a incubação com DAPI, remover o máximo da solução DAPI quanto possível, com uma pipeta de Pasteur fresco, sob um microscópio de dissecação, de modo a não perturbar os animais dissecados. Adicionar uma gota de solução para os tubos de montagem. Enrole cada tubo em papel alumínio. NOTA: Para visualizar a coloração dpERK, gônadas coradas devem ser montadas para microscopia imediatamente. Para outras aplicações de anticorpos, tais como serina fosforilada 10 Histona H3, gónadas pode ser mantido em meio de montagem para um máximo de 2 semanas a 4 ° C no escuro. 6. Montagem Slides e imagem Coloque uma camada de fita de laboratório longitudinalmente, na parte superior, de duas lâminas de microscópio de vidro (25 mm x 75 mm x 1 mm) como pode ser visto na Figura 3. Coloque uma lâmina de microscópio de vidro limpa fresca, entre as duas lâminas gravadas. NOTA: A espessurada fita ajuda a gerar uma almofada de agarose sobre a lâmina secundária. A espessura da almofada de agarose é quase igual à da fita, tal como a fita serve como um espaçador para criar a almofada de agarose. Gota ~ 200 uL de derretido agarose a 2% (feito em água destilada) na lâmina de microscópio em meio. colocar rapidamente uma lâmina limpa fresca, perpendicular e em cima, do agarose. Deixe o Solidify de agarose (1-2 min). Remover a lâmina de microscópio topo muito suavemente, de modo que o bloco de agarose não é destruída. A almofada de agarose pode permanecer ligado quer ao topo ou o slide inferior. Não importa qual deslizar o bloco de agarose permanece ligado a, contanto que é uma superfície lisa de agarose. Usando uma pipeta de Pasteur, transferir os animais dissecados para a almofada de agarose. Remover qualquer excesso de líquido a partir da lâmina utilizando uma pipeta de Pasteur sob um microscópio de dissecação. Usando um cabelo cílios ou capilar finamente desenhadas, empurre o gônadas e intestinos de umcaminho um do outro, a fim de espalhar as gônadas fora no slide. Cobrir a lamela de microscópio com um tamanho de lamela de 24 milímetros x 50 milímetros. Ter o cuidado de assegurar que a lamela é abaixado delicadamente sobre a lâmina com o mínimo de bolhas de ar que está sendo formada entre as lamelas e a corrediça. Armazenar a 4 ° C durante a noite numa caixa de corrediça (uma caixa corrediça opaca com as lâminas encontra-se plana, lamela acima) para permitir que o excesso de líquido a evaporar e das gónadas para tornar-se um pouco achatada (devido ao peso da lamela sobre as gónadas). O ligeiro achatamento das gônadas permite uma melhor imagem de um tubo gonadal de outra forma redonda. Uma vez que a lamela está montado, não se aplicar pressão sobre a parte superior da lamela com os dedos. Muitas vezes, isso resulta em distorção da gônadas e perda do sinal dpERK. Achate as gônadas durante a noite apenas para uma imagem mais eficaz. As lâminas estão prontos para ser visto, logo que eles são montados. Para tirar fotografias imediatamente, absorver suavementeo excesso de líquido entre a lamela eo slide a partir dos cantos usando um tecido laboratório limpo. Após o período durante a noite, selar o slide e lamela com unha transparente acabamento polonês sobre os quatro cantos da lamela eo limite slide. A / selo lamela unha polonês garante que a lamela não se mover enquanto imagem e protege contra a destruição das amostras. Imagem das gônadas com um microscópio composto em 63X. No entanto, a lente objectiva e o microscópio pode ser variado em função da disponibilidade de microscópios e aplicação do utilizador. Uma vez que o tamanho de todo o gónada da região proliferativa para os oócitos é maior do que pode ser capturado em uma imagem, as imagens são tomadas como uma montagem com limites de sobreposição, como mostrado na Figura 4. 11-14, 18. Em muitos casos, editar a carcaça após a imagem e montagem final, contanto que não há grandes alterações são feitas à imagem da linha germinativa. loja tele imagens brutas ao longo da imagem montada para permitir a comparação entre o 'antes' montagem / edição e 'depois' de montagem / edição das imagens. NOTA: As imagens de microscopia não devem ser alteradas por força do sinal ou a saturação durante a montagem da montagem.