Räumliche und zeitliche Analyse von Active ERK in der<em> C. elegans</em> Germline

Das hier beschriebene Protokoll ist in erster Linie für die wirbellosen Modellsystem C. elegans, und folgt den ethischen Richtlinien her durch die Institution. 1. Tierpflege Pflegen C. elegans Arbeitsstammkulturen auf Nematode Growth Medium 20,21 (NGM, siehe Materialien Tabelle) Agar mit E. ausgesät coli OP50. Pflegen Wurm Bestände bei Temperaturen zwischen 16 ° C und 25 ° C. HINWEIS: Würmer bei höheren Temperaturen führt zu einer schnelleren Wachstumsrate Anzucht, oft anomale Keimbahnentwicklung und niedriger Brut Größen. Zusätzlich temperaturempfindliche Genotypen werden verschiedene Phänotypen bei verschiedenen Temperaturen anzeigen. Übertragen Sie Würmer auf neue Platten NGM alle 2 – 3 Tage in Abhängigkeit von ihrer Wachstumsrate, um eine konstante Versorgung mit gut genährten Würmern zu halten. HINWEIS: Bei jedem Experiment mit dpERK Ebenen, Würmer sollten nicht von einem verhungert oder Masse erhalten werdened Platte. Crowding oder Insulin Verhungern Auswirkungen Signalisierung in Würmern 22 und Insulin – Signal regelt ERK 12 Aktivität. So Würmer aus verhungert oder überfüllten Platten werden in variabel und schwer zu reproduzierende führen Färbungsmuster. 2. Dissektion der erwachsenen Würmer Gonaden zur Gewinnung von Pick – 100-150 WT (N2) oder gewünschten Genotyp von Würmern an der gewünschten und spezifischen Entwicklungsstufe (L1, L2, L3, L4, Erwachsene, etc.) In 100 & mgr; l M9 – Puffer in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Füllen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit 900 & mgr; l M9 – Puffer (siehe Materialien Tabelle). Zentrifugiere die Röhrchen bei 1000 · g in einer Mikrozentrifuge für 1 min bei Raumtemperatur. Sanft 900 ul der M9-Puffer entfernen und entsorgen. Entfernen Sie die Puffer unter einem Präpariermikroskop zu gewährleisten, dass die Würmer nicht versehentlich entfernt werden. Wiederholen Sie die Schritte 2,2-2,3 zwei weitere Male mit frischen M9 jedesmal puffern.Dadurch wird sichergestellt, dass alle Bakterien, die wurden mit den Würmern übertragen werden entfernt effektiv gewaschen. Nach dem letzten Waschen 900 & mgr; l M9-Puffer von dem Rohr und Verwerfen entfernen. Übertragen Sie die restlichen 100 & mgr; l M9-Puffer, die 100 enthält – 150 Würmer mit einem 200 & mgr; l-Mikropipettenspitze zu einem flachen Boden Glas Uhr Teller. Stellen Sie sicher, dass die Mikropipettenspitze an der vor der Verwendung Marke 10 & mgr; l geschnitten wird. Nicht schneiden die Spitze in Scherung der Würmer führen. In 1-3 & mgr; l von 0,1 M Levamisol auf die Glas Uhr Schale die Würmer in M9-Puffer enthält. wirbeln Sie leicht die Levamisol und die M9 sogar zu ermöglichen, Mischen, bis die Würmer bewegen zu stoppen. HINWEIS: Levamisol Bestände können bei -20 ° C zur Langzeitlagerung gelagert werden. Hier verwenden die höhere Konzentration von 1 – 3 mM als das, was in der Literatur 23 von 0,2 beschrieben worden – 0,25 mM Levamisol zu erhalten , um einen schnellen Verlust der Mobilität in den Tieren. Wenn die Tiere zu l schinden umOng in der flüssigen Suspension können die resultierenden Muster der dpERK in den Gonaden variabel sein (aufgrund von Stress oder mangelnde Ernährung oder beides). 3 mM Levamisol für die Präparation – reproduzierbarer Färbemustern mit 1 erreicht wurden. Befestigen Sie zwei 25 G Nadeln auf zwei 1 ml-Spritzen (die Größe der Spritze spielt keine Rolle, die Lehre der Nadel kritisch ist). Positionieren Sie eine Spritze in jeder Hand (Abbildung 2). Unter einem Binokular, positionieren Sie jede Nadel unter und über jeder Wurm , wie in Abbildung 2 und legen Sie eine Feinschnitt an der Schnecke in der Nähe des zweiten Schlund Glühbirne in einer scherenartigen Bewegung gezeigt. Nach einem Schnitt in der Schnecke auf das nächste Tier zu bewegen, bis alle Tiere in der Schale mindestens einmal geschnitten worden. HINWEIS: Denken Sie, dass 2.8 Schritte – 2.9 sind zeitempfindlich. Präparieren Sie alle Würmer in der Schale in weniger als fünf Minuten für eine reproduzierbare dpERK Muster. Längere Dissektion Zeiten wird aus der Signal dpERK in einem Wende führen, vor allem in Zein 1. Stellen Sie die Anzahl der Würmer pro Runde Dissektion (dh 50 Würmer vs. 150) bei Bedarf in der vorgegebenen Zeitrahmen zu bleiben. Falls ein extrudierter Gonaden ist während der Präparation nicht sichtbar, nicht versuchen, einen anderen Schnitt im gleichen Tier. Normalerweise werden, dass nur das Tier scheren und nicht in der Extrusion der Gonaden führen. Stattdessen gehen Sie zum nächsten Tier auf. Worms, wo die Gonaden nicht extrudieren, werden als solche auf den Folien angezeigt werden, die in Abschnitt gestellt werden 6 und kann während der Bildgebung ignoriert werden HINWEIS: Durch all die Dissektion und Verarbeitungsschritte ist es wichtig, im Auge zu behalten, dass die Gonaden an den Körper / Karkasse befestigt bleiben. Sie nicht die Gonaden zwingen und den Körper auseinander mit der Nadel. Oft eine aberrant Riss im Gonadengewebe in einem Versuch, die Gonade von dem Körper zu trennen, können in unechten Antikörper Signal führen. Die Körper / Karkasse während der Abbildungsschritte (Abschnitt 6), und nur die Gonaden abgebildet ignoriert werden. Zusätzlich sometimes die Darmzellen auch als interne Kontrollen / somatische Kontrollen für den Antikörper, der getestet dienen kann. 3. Gonad Fixation Nachdem die Präparation abgeschlossen ist, fügen Sie 2 ml 3% Paraformaldehyd (PFA) direkt auf das Glas Uhr Schüssel, die die 100 & mgr; l M9 und den sezierten Tiere und Deckel mit Parafilm enthält. Legen Sie die bedeckte Uhrglas in einer chemischen Abzugshaube. Achtung: PFA ist eine gefährliche Chemikalie. Somit sollte die Fixierung in der chemischen Laborabzug durchgeführt werden. 10 min bei RT inkubiert. Eine Einweg – 9 "Pasteur – Glaspipette 3 ml 1x PBS-T hinzufügen (Werkstoff – Tabelle zu sehen) an das Uhrglas die sezierten Tiere. Mix durch die PFA – Lösung zeichnen und die 1x PBS-T mit den sezierten Tiere in das Pasteur enthält Pipette und sanft zurück in die Uhrglas freigibt. verwirbeln Sie nicht die Rohre während der Wäschen. Mit Hilfe eines fresh Glas Pasteur Pipette die 5 ml Flüssigkeit (enthaltend seziert Würmer, PFA und 1x PBS-T) aus dem Uhrglas in die Pasteurpipette zu ziehen und den Inhalt in ein frisches 5-ml-Glas konischen Röhrchen übertragen. Zentrifuge die konischen Röhrchen für 30 sec in einer klinischen Zentrifuge bei 1.000 x g. Verwenden Sie Glas Pasteur Pipetten und konische Röhrchen wie seziert Gonaden halten Sie sich an Kunststoff. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand darauf zu achten, um nicht die sezierten Tiere zu stören. Entfernen Sie die Flüssigkeit nach jeder Wäsche von der konischen Röhre unter einem Binokular, um nicht die seziert Gonaden zu beeinflussen, und minimieren den Verlust. Mit einer frischen Pasteurpipette 5 ml 1x PBS-T auf die konische Röhrchen. Zentrifuge die konischen Röhrchen in einer klinischen Zentrifuge für 30 s bei 1.000 x g. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand darauf zu achten, um nicht die sezierten Tiere zu stören. Wiederholen Sie Schritt 3.7 für insgesamt dreimal. Mit einer frischen Pasteurpipette 2 mL 100%Methanol zu den Rohren, und sanft die Gonaden mit dem Methanol mischen, indem sie in der Pasteurpipette aufzustellen. Inkubieren der Röhrchen bei -20 ° C für mindestens 1 h. HINWEIS: Dissected Gonaden kann für bis zu 2 Tage für dpERK Färbung in Methanol gelagert werden. Lagerung für länger als 2 Tage und bis zu 2 Wochen ist kompatibel mit anderen Antikörperfärbung von Anwendungen, wie beispielsweise anti-Lamin-Antikörper, aber nicht mit dem Antikörper dpERK. Nach der gewünschten Inkubationszeit wiederholen Schritt 3.7 für insgesamt drei Mal, um die Gonaden zu waschen. Sie nicht die Rohre während der Wäschen verwirbeln. Nach dem letzten Waschen 500 ul 1x PBS-T in dem konischen Rohr 5 mL verlassen. Mit einem frischen Pasteur-Pipette, den Inhalt des konischen Glasrohr in eine frische 1-ml-Glasrohr (6 mm x 50 mm) übertragen. Lassen Sie die sezierten Tiere durch Schwerkraft absetzen 5 – 10 min. Mit einer frischen Pasteurpipette und unter einem Binokular, entfernen Sie so viel von der Wäsche wie möglich aus dem 1 ml Glasröhrchen without Störung der sezierten Gonaden. 4. Sperren und primärer Antikörper-Behandlung Je 100 & mgr; l 30% normalem Ziegenserum (NGS) , verdünnt in 1x PBS-T (siehe Materialien Tabelle) zu den sezierten Tiere in den 1 – ml – Glasröhrchen. 30% NGS dient als Blockierungspuffer. Decken das Rohr mit Parafilm Verdampfung der Flüssigkeit zu vermeiden. bei RT inkubieren 1 h oder bei 4 ° C über Nacht. Nach der gewünschten Zeit der Inkubation, entfernen Sie den Blockierungspuffer eine frische Pasteur-Pipette, die Beseitigung so viel Flüssigkeit wie möglich zu verwenden. Verwenden Sie ein Binokular, um sicherzustellen, dass Gonaden sind nicht in der Pasteurpipette erstellt. Verdünne die MAPKYT Antikörper (siehe Materialien Tabelle, in diesem Verfahren als dpERK bezeichnet) bei 1: 400 in 30% NGS. Bereiten Sie genügend Antikörper Verdünnung zu verwenden, 100 & mgr; l pro Röhrchen. Nicht verwendete, verdünnte Antikörper kann für eine Woche bei 4 ° C gelagert werden. Geben Sie 100 ul der Antikörper anti-dpERK verdünnt, solution auf die 1 Glasröhrchen ml die sezierten Tiere enthalten. Verschließen Sie die Röhrchen mit Parafilm. Inkubieren der Röhrchen bei 4 ° C über Nacht. Nach Inkubation über Nacht, fügen 800 ul 1x PBST auf die Röhrchen bei RT. Zeichnen Sie die Probe in einem frischen Glas Pasteur Pipette auf und lassen Sie sanft, um sicherzustellen, dass die Gonaden gleichmäßig in der 1x PBS-T suspendiert sind. Lassen Sie die Gonaden auf den Boden mit der Schwerkraft absetzen. Entfernen Sie den Überstand. Dies stellt sicher, dass die sezierten Gonaden gewaschen werden, aber nicht während des Verfahrens beschädigt wird. Wiederholen Sie die Schritte 4,5-4,6 für insgesamt drei Waschungen. Sie nicht die Rohre während der Wäschen verwirbeln. Nach dem dritten Waschen sicher sein, wie viel Überstand wie möglich zu entfernen und zu entsorgen, ohne die sezierten Tiere zu stören. Stellen Sie sicher, dass eine frische Pasteur-Pipette jedes Mal verwendet wird. 5. Sekundäre Antikörper-Behandlung Während der primären Antikörper herzustellen wäscht die Verdünnung für den sekundären Antikörper. Verdünnen Sie die Anti-Maus-sedäre Antikörper bei 1: 500 in 30% NGS. Wie bei dem primären Antikörper, verwenden 100 & mgr; l pro Röhrchen. Nicht verwendete Antikörper kann für eine Woche bei 4 ° C gelagert werden. 100 l sekundären Antikörperlösung auf die 1-ml-Glasröhrchen, die sezierten Tiere enthält. Decken Sie jedes Röhrchen mit Parafilm, und dann wickeln die Röhrchen in Aluminiumfolie, um den Inhalt des Rohrs in dunkel halten. Inkubieren der Röhrchen bei RT für 2 h oder alternativ bei 4 ° C über Nacht. Nach der gewünschten Zeit der Inkubation, fügen 800 ul 1x PBS-T mit den Rohren und wiederholen Sie die Schritte 4,5-4,6 für insgesamt dreimal. Nach dem letzten Waschen, zu entfernen und so viel von der Überstand wie möglich unter einem Präpariermikroskop mit einem frischen Pasteur pipette verwerfen. Bereiten Sie die DAPI-Lösung während der Waschungen für den sekundären Antikörper. Verdünnen Sie 1 ul DAPI (von 1,000x Lager von 1 mg / ml bei -20 ° C gelagert) in-1 ml 1x PBST. Hinzufügen 800 & mgr; l der verdünnten DAPI-Lösung auf die Rohre enthält, dieseziert Tiere. Decken Sie den Mund des Rohrs mit Parafilm und wickeln jedes Röhrchen in Aluminiumfolie. 20 min bei RT inkubiert. Nach der Inkubation mit DAPI, entfernen, so viel von der DAPI-Lösung wie möglich mit einer frischen Pasteurpipette unter einem Binokular, um nicht die sezierten Tiere zu stören. 1 Tropfen Lösung auf die Rohre montieren. Wickeln Sie jedes Röhrchen in Aluminiumfolie. HINWEIS: Für die Visualisierung dpERK Färbung gefärbt Gonaden sollte sofort für die Mikroskopie montiert werden. Für andere Antikörperanwendungen wie phosphoryliertes Serin 10 Histone H3, Gonaden können in Befestigungsmedium für bis zu 2 Wochen bei 4 ° C im Dunkeln gehalten werden. 6. Montage von Folien und Imaging Eine Schicht Labor Band der Länge nach , oben, aus zwei Glasobjektträger (25 mm x 75 mm x 1 mm) , wie in Abbildung 3 zu sehen. Legen Sie eine frische , saubere Objektträger aus Glas zwischen den beiden verklebten Folien. HINWEIS: Die Dickedes Bandes hilft, eine Agarose-Pad auf dem Mittelschlitten erzeugen. Dicke der Agarose-pad ist fast gleich derjenigen des Bandes, wenn das Band als Abstandshalter dient, um ein Agarose-Pad zu schaffen. Drop ~ 200 & mgr; l 2% geschmolzener Agarose auf dem Objektträger in der Mitte (in destilliertem Wasser). Schnell legen Sie eine frische, saubere Rutsche, die senkrecht zu und auf der Oberseite, der Agarose. Lassen Sie die Agarose solidify (1 – 2 min). Entfernen Sie die obere Objektträger sehr sanft, so dass die Agarose-Pad nicht zerstört wird. Die Agarose-Pad kann entweder an der oberen oder unteren Schlitten befestigt bleiben. Es ist egal, welche gleiten die Agarose-Pad bleibt an, solange es sich um eine glatte Oberfläche von Agarose ist. Unter Verwendung einer Pasteur-Pipette die sezierten Tiere auf dem Agarose-Pad übertragen. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit aus der Folie mit einer Pasteurpipette unter einem Binokular mit. Mit einem Wimpernhaar oder fein gezeichnet Kapillare, drücken Sie die Gonaden und Darm einArt und Weise voneinander, um die Gonaden aus auf der Folie zu verbreiten. Decken Sie den Mikroskop-Objektträger mit einem 24 mm x 50 mm Größe Deckglas. Achten Sie darauf, daß die Deckplättchen sanft auf den Objektträger mit minimaler Luftblasen zwischen dem Deckglas ausgebildet ist, und dem Schlitten abgesenkt wird. Lagerung bei 4 ° C über Nacht in einer Dia-Box (eine undurchsichtige Gleitkastens mit den Folien flach liegen, das Deckglas nach oben) um überschüssige Flüssigkeit zu verdampfen lassen und Gonaden etwas abgeflacht werden (aufgrund des Gewichts des Deckglases auf die Gonaden). Die leichte Abflachung der Gonaden ermöglicht eine bessere Bildgebung eines ansonsten runden Gonaden-Rohr. Sobald das Deckglas montiert ist, keinen Druck auf die Oberseite des Deckglases mit den Fingern anzuwenden. Häufig führt dies zu Verzerrungen der Gonaden und der Verlust des dpERK Signals. Flatten die Gonaden über Nacht nur für eine effektivere Bildgebung. Die Objektträger werden bereit betrachtet werden, sobald sie zusammengebaut sind. Um sofort Bilder nehmen, sanft aufnehmendie überschüssige Flüssigkeit zwischen dem Deckglas und dem Objektträger aus den Ecken eines sauberen Labor Gewebe verwendet wird. Nach der über Nacht Zeit, versiegeln Sie die Folie und das Deckglas mit transparentem Nagellack Deckschicht an den vier Ecken des Deckglases und der Schiebe Grenze. Der Nagellack / Deckdichtung sorgt dafür, dass das Deckglas nicht während Bildgebung bewegt und schützt vor Zerstörung der Proben. Bild die Gonaden mit einer Verbindung Mikroskop bei 63X. Jedoch ist die Objektivlinse und Mikroskop kann auf der Basis der Verfügbarkeit von Mikroskopen und Benutzeranwendung variiert werden. Da die Größe des gesamten Gonade von der proliferative Bereich zu den Oozyten größer ist als in einem Bild erfasst werden, werden die Bilder als Montage mit überlappenden Grenzen genommen , wie in 4 gezeigt. 11-14, 18. In vielen Fällen bearbeiten, um die Karkasse nach dem letzten Imaging und Montage, solange keine größeren Veränderungen der Keimbahn-Bild gemacht werden. Speicher ter Rohbilder entlang der zusammengesetzten Bildvergleich der "vor" Montage / Bearbeitung und "nach" Montage / Bearbeitung der Bilder zu ermöglichen. HINWEIS: Die Mikroskopiebilder dürfen nicht für die Signalstärke oder Sättigung bei der Montage der Montage verändert werden.