تحليل المكاني والزماني لأحدث إرك في<em> C. ايليجانس</em> الخط الجرثومي
Summary
نقدم طريقة القائم على التصوير المناعي للتوطين المكاني والزماني لإرك نشط في C. تشريح ايليجانس الغدد التناسلية. بروتوكول صفها هنا يمكن تكييفها لرؤية أي إشارة أو البروتين الهيكلي في C. ايليجانس الغدد التناسلية، شريطة الضد كاشف مناسب هو متاح.
Abstract
إشارة الخلية الحفظ تطويريا transducing RTK-RAS-إرك المسار هو سلسلة مما يشير كيناز الهامة التي تسيطر على العديد من العمليات الخلوية والتنموية أساسا عن طريق تنشيط إرك، كيناز النهائية للمسار. تنظيم محكم من النشاط إرك ضروري للتطور الطبيعي والتوازن. النتائج إرك نشطة بشكل مفرط في انتشار الخلوي المفرط، في حين الدرقية إرك يسبب موت الخلايا. C. ايليجانس هو نظام نموذجي القوية التي ساعدت توصيف وظيفة وتنظيم RTK-RAS-إرك يشير المسار خلال التنمية. على وجه الخصوص، وطريقة RTK-RAS-إرك ضروري لC. ايليجانس تطوير سلالة الجرثومية، التي هي محور هذا الأسلوب. عن طريق الاجسام المضادة المحددة لشكل نشط، diphosphorylated من إرك (dpERK)، ونمط التعريب النمطية يمكن تصور داخل الخط الجرثومي. لأن هذا النمط هو مكانيا وزمانيا وسيطرواالطبعه، والقدرة على مقايسة بتكاثر dpERK مفيد لتحديد المنظمين من المسار الذي يؤثر على dpERK مدة إشارة والسعة والتنمية وبالتالي سلالة الجرثومية. نحن هنا لشرح كيفية تشريح بنجاح، وصمة عار، وdpERK الصورة داخل C. ايليجانس الغدد التناسلية. ويمكن تكييف هذه الطريقة لتوطين المكاني للأي إشارات أو البروتين الهيكلي في C. ايليجانس الغدد التناسلية، قدم الأجسام المضادة متوافق مع المناعي هو متاح.
Introduction
ومستقبلات التيروزين كيناز (RTK) -RAt اللحمي (RAS) -Extracellular إشارة ينظم كيناز (إرك) مسار التتابع إشارات خارج الخلية من خلال سلسلة كيناز الحفظ الذي ينتج في الفسفرة وتفعيل إرك 1-3. البروتينات إرك أعضاء في الموجه البرولين الحفظ سيرين / ثريونين MAP (Mitogen المنشط البروتين) عائلة كيناز، وتفعيلها مباشرة من قبل منظمة مجاهدي خلق عبر الفسفرة المزدوجة على ثريونين (T) والتيروزين (Y) من عزر TEY محفوظ. إرك نشط (المشار إليها باسم diphosphorylated إرك، أو dpERK) ثم ينظم العديد من العمليات الخلوية والتنموية من خلال الفسفرة للبطارية من ركائز المصب 1-3. وهكذا النشاط إرك غير طبيعي يؤدي إلى العديد من الخلايا والعيوب التنموية 4-7.
تنظيم صارم من النشاط إرك هو أمر حاسم لتنمية العادية: في أنظمة الثدييات الكثير من النشاط إرك يؤدي إلى الإفراط الرائدة انتشار الخليويإلى نمو أنكجنيك. النشاط القليل جدا يؤدي إلى موت الخلايا 4،6. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تؤدي التغيرات في مدة النشاط إرك يؤدي أيضا إلى نتائج مختلفة: في الخلايا PC12، وتفعيل إرك لمدة 30 دقيقة أو أقل الحث تكاثر الخلايا، ولكن تفعيل إرك لمدة 60 دقيقة أو أكثر الحث تمايز الخلايا العصبية 8،9. تنظيم محكم من النشاط إرك وبالتالي من الضروري بشكل واضح عن التطور الطبيعي والتوازن.
C. ايليجانس هي قوية، ومرن وراثيا نظام نموذجي لتشريح وظيفة وتنظيم RTK-RAS-إرك يشير مسار 3،10-15. بالنسبة لأنظمة الثدييات، والتي تحتوي على جينات متعددة لRAS وإرك، C. يحتوي ايليجانس جين واحد RAS (السماح-60) والجينات إرك واحد (MPK – 1)، مما يجعله نظاما وراثيا أكثر سطحي التي لتشريح وظيفة هذا المسار 3،10-14. وC. ايليجانس الخط الجرثومي هو في الأساس الأنبوب الذي يتكون من الإنقساميةالخلايا الجذعية في نهايته البعيدة والبويضات الناضجة في نهاية القريبة لها (الشكل 1) 16. الخلايا الجرثومية الشروع الانقسام الاختزالي فقط القريبة إلى منطقة الإنقسامية البعيدة، والتقدم من خلال الطور التمهيدي الموسع الانتصافي (طور التثخن)، وبعد ذلك البدء في تشكيل البويضات في المنطقة حلقة، تمر أخيرا بويضة النضوج في المنطقة القريبة 16.
وقد أظهرت الدراسات الجينية من مختبرات متعددة، بما في ذلك منطقتنا، أن مسار RTK-RAS-إرك أمر ضروري لتطوير سلالة الجرثومية في C. ايليجانس 12،13،15،17-19. على وجه التحديد، وجدنا أن الضوابط إرك وينسق لا يقل عن تسعة العمليات البيولوجية متميزة خلال تطوير سلالة الجرثومية، بدءا من مفاتيح التنموية مثل جرثومة خلية موت الخلايا المبرمج للخلية العمليات البيولوجية مثل 11،18 نمو البويضة. يشبه إلى حد كبير في أنظمة الثدييات، والكثير من النشاط إرك في C. ايليجانس النتائج سلالة الجرثومية في إنتاج البويضات صغيرة متعددة، في حين لى أيضانتائج النشاط ttle في واحدة بويضة كبيرة (11). وبالتالي تنظيم محكم من dpERK أمر ضروري لتطوير سلالة الجرثومية الطبيعية. النموذج النشط من إرك، كما تصور من قبل الأجسام المضادة المحددة لdpERK، يعرض النمطية، ودينامية، النسقين نمط التعريب: dpERK مرتفعة خلال منتصف طور التثخن (المنطقة 1، الشكل 1)، وانخفاض في المنطقة حلقة وارتفاع مرة أخرى في ناضجة البويضات (المنطقة 2، الشكل 1). مؤخرا، وجدنا أن التغذية تعمل من خلال عامل النمو الذي يشبه الانسولين مستقبلات 1 (داف-2) لتنشيط إرك في المنطقة 1 12؛ وأظهر العمل قبل أن إشارة الحيوانات المنوية (عبر Ephrin مستقبلات التيروزين كيناز) ينشط إرك في المنطقة 2 13.
وبالنظر إلى أن وظائف إرك النشطة بمثابة مقاومة متغيرة في سلالة الجرثومية لتنظيم نمو البويضة، توطين المكاني والزماني، فضلا عن اتساع dpERK، هو المفتاح لفهم نتائج الإشارات العادية. باستخدام الطريقة الموصوفة هنا، والتغيرات فيتوطين النمطي للdpERK يمكن رصدها بسهولة والتنبؤات المستمدة من تأثير الاضطرابات البيئية أو الوراثية على النشاط إرك وبالتالي وظيفة. وهكذا، يعاير لdpERK يتيح فهم شامل لدورها خلال تطوير سلالة الجرثومية.
Protocol
Representative Results
Discussion
إرك النشط (dpERK) يتبع المكاني وديناميكية نمط التعريب النمطية في C. ايليجانس سلالة الجرثومية. هذه النمطية dpERK النمط المكاني (الشكل 5)، والسعة في مرحلة البلوغ C. ايليجانس الغدد التناسلية، ويمكن أن تكون مرتبطة بشكل فعال مع العديد من العمليات البيولوجية التي تنظم إرك. على سبيل المثال، عدم القدرة على تفعيل إرك في المنطقة 2 النتائج في الاعتقال في البويضات في الطور الأول من الانقسام الاختزالي، النمط الظاهري لوحظ في germlines الإناث التي لا تحدد الحيوانات المنوية، وبالتالي لم تقم بتنشيط إرك في البويضات الناضجة (الشكل 5). التزاوج مع نتائج الذكور في تراكم الفعال للdpERK في المنطقة 2 في germlines الإناث 11،13، إلى جانب ظهور نضوج البويضة والإباضة. وهكذا تحليل الأنماط المكانية والزمانية تفعيل من dpERK على بعض الاضطرابات الوراثية (مثل تدخل الجيش الملكي النيبالي تثبيط الجين بوساطة) أو العلاجات الكيميائية يسمح لتحديد العوامل التي reguأواخر إشارات إرك والعمليات البيولوجية وبالتالي إرك التي تعتمد على. هذه التحليلات أيضا تمكين اكتشاف التفاعلات وراثية جديدة بين مسارات إشارات.
وعنق الزجاجة للأي تحليل التصوير القائم هو توافر الكواشف وظيفية مثل الأجسام المضادة التي تخص التطبيق. في حالة وجود مثل هذا كاشف ثم طرق مثل تلك المذكورة أعلاه يمكن أن تتكيف بسهولة لتحليل نمط التعريب لأي بروتين من الفائدة. وبالتالي يحد من الطلب من قبل توافر الأجسام المضادة عمل. بالإضافة إلى ذلك، لأن أسلوب يصف تشريح وتلطيخ في وقت تنموي معين، لا يمكننا إلا التقاط المعلومات في إطار زمني واحد، ولا تسليط الضوء على ديناميات أو تنظيم البروتين في الوقت الحقيقي أو معدل دوران البروتين.
ويتم تكييف الطريقة الموصوفة أعلاه من فرانسيس وآخرون. 23، والذي يختلف من سيدو ودان مethod 24 البثق الغدد التناسلية وتلوين الأجسام المضادة. وسوف يطلق على الأسلوب على أساس فرانسيس وآخرون. "طريقة تعليق" وطريقة سيدو ودان يسمى "تجميد تكسير طريقة" للمقارنة. وكانت طريقة تعليق فعالة جدا في أيدينا للحصول على أنماط توطين استنساخه من الجزيئات مما يشير مثل dpERK، التي هي بطبيعتها أكثر حساسية لظروف معالجة قاسية. في حالة dpERK التعريب، في تجربتنا، والإشارة في منطقة 1 غير قابل للكشف عمليا مع أسلوب تجميد تكسير. بالإضافة إلى ذلك، عينة التجفيف، والتي يمكن أن تحدث في كثير من الأحيان مع طريقة التجميد تكسير، والنتائج في إشارات الأجسام المضادة زائفة. طريقة تعليق يقلل عينة التجفيف، حيث يتم تعليق الغدد التناسلية في السائل طوال العملية. نجد أيضا أن الطريقة تعليق مفيد لتصوير متعددة الأنماط الجينية المختلفة على شريحة واحدة. على سبيل المثال، إذا كان اثنان المورثات، مثل المنحرفين مقابلالإناث إلى أن مباشرة مقارنة لdpERK التوطين، والمورثات اثنين يمكن أن تكون مختلطة معا ومعالجتها. وهذا ممكن لأن الظواهر تختلف ويمكن تمييزها عن طريق الأشكال التضاريسية دابي. تلطيخ في نفس أنبوب تليها التصوير على نفس الشريحة يسمح للمقارنة مباشرة بين الغدد التناسلية من المورثات مختلفة. بدلا من ذلك، إذا كانت الأشكال التضاريسية دابي ليست مميزة، ثم على بعد خطوتين تلوين الأجسام المضادة يمكن اعتمادها. لأول مرة يتم التعامل مع كل الوراثي الفردي مع اثنين من الأجسام المضادة متميزة، الجسم المضاد ألف لWT والجسم المضاد B لمتحولة (سواء الأجسام المضادة تحتاج إلى أن تثار في مجموعة متميزة من الأجسام المضادة dpERK). مرة واحدة وقد تم ملطخة المورثات مع اثنين من الأجسام المضادة الأولية، وغسلها، وأنها يمكن أن تكون مختلطة معا في أنبوب واحد وملطخة الآن مع الأجسام المضادة dpERK، تليها علاج الأجسام المضادة الثانوية إلى تصور كل الأجسام المضادة في الأنبوب. القدرة على المقارنة بين الأنماط الجينية المختلفة على شريحة واحدة، وخصوصا عندما دوتبذل eductions من أنماط تنشيط يضمن تفسيرات دقيقة لا يتأثر الظروف تلطيخ متميزة.
في حين مفيد، وهناك خطوات متعددة في جميع أنحاء طريقة تعليق تتطلب المعالجة المتأنية. ومن الأهمية بمكان أن تحدث تشريح في الوقت بكفاءة. الأهم من ذلك، ينبغي أن تشريح لا تأخذ أكثر من 5 دقائق. مرات تشريح الأطول تؤدي في إشارة dpERK المتغيرة، التي غالبا ما يساء فهمها على أنها تغييرات ينظم في تفعيل إرك، وليس الفشل كما الفنية. ومن الأهمية بمكان أن تبدأ مع أكثر من 100-150 الحيوانات لكل تشريح لجميع أنحاء غسل مختلف الخطوات التي يمكن بسهولة الغدد التناسلية تضيع من الأنابيب بسبب أخطاء pipetting ل. فقدان الغدد التناسلية يمكن تخفيض إما عن طريق تشريح في دفعات صغيرة متعددة (مثل ثلاث دفعات من 50 الحيوانات لكل منهما) التي يمكن دمجها، أو عن طريق تشريح دفعة واحدة كبيرة من 150. وهناك تحد آخر هو الحصول على الغدد التناسلية للكذب في-متباعدة بشكل جيد تشكيلعلى الشريحة بحيث الغدد التناسلية البعيدة بأكمله ولا يمكن تصوير. لتمكين هذا، استخدم رمش على عود ثقاب أو ماصة سحبت إلى الفضاء خارج الغدد التناسلية. ومع ذلك، ينبغي توخي الحذر حتى لا تتلف الغدد التناسلية أثناء هذه العملية. في كثير من الأحيان مع هذه التقنيات يستغرق عدة محاولات السيطرة على تشريح وكذلك الترتيبات من الغدد التناسلية على الشرائح.
بمجرد يتقن هذه التقنية، وهي بمثابة وسيلة قوية للتحاليل البيولوجية المتنوعة، ويمكن استخدامها لدراسة أكثر من مستويات dpERK فقط. على سبيل المثال هذه الطريقة يمكن استخدامها لتصور مستويات النشطة P38، أو مستويات معلمين النشطة، أو أي البروتين الذي يوجد كاشف الأجسام المضادة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يقترن الأسلوب مع شاشة تثبيط الكيميائية في الحيوانات كلها لفحص لمثبطات جديدة أو تفعيل للمسار، عبر يعاير لمستويات dpERK. وهذا سوف يسمح لقراءات في الجسم الحي من كل من رد الفعل والحساسية تجاه أي من مثبطات التي قد كثافة العملياتeract مع إشارات الطريق RTK-RAS-إرك. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم في تركيبات الأجسام المضادة مع مخرجات الإشارات المتعددة التي يمكن لجميع استخدامها، وتصور في وقت واحد. باستخدام الأجسام المضادة متعددة يسمح ارتباط بين مسارات متعددة، وحالة تفعيلها، ونتائج كل داخل الأنسجة نفسها، مما يتيح فهم أفضل لهذه التفاعلات. هذه ليست سوى أمثلة قليلة على مزيد من التطبيقات لهذه الطريقة، ولكن هذا النظام يمكن تعديلها لدراسة اهتمامات بحثية متعددة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work in the Arur Lab is supported by grants from the National Institutes of Health, NIHGM98200; Cancer Prevention Research Institute of Texas, CPRIT RP160023; the American Cancer Society Research Scholar Award (ACS RSG014-044-DDC); and by the Anna Fuller Funds.
Materials
| Agarose | Sigma Inc. | A9539 | Dissolve 2 g in 100 ml to make the 2% agarose |
| Flat bottom glass watch dish | Agar Scientific | AGL4161 | We use glass, because dissected gonads often stick to plastic |
| 25 gauge needles | BD PrecisionGlide | 305122 | |
| Syringes (could be 1 or 5 ml) | BD Syringes | 1 ml: BD 309659 | |
| Microscope slides (25mm x 75mm x 1.0mm) | Fisherbrand | 12-550-343 | |
| Coverslips (24x50mm) | Corning | 2935-245 | |
| 5ml glass conical tube | Corning | 8060-5 | |
| 9" disposable Pasteur pipette | Fisherbrand | 13-678-20D | |
| Clinical bench top centrifuge | |||
| Glass tubes (6x50mm) | Fisherbrand | 14-958-A | |
| *M9 solution | |||
| Levamisole | Sigma | L9756 | |
| 3% Paraformaldehyde | Electron microscopy services | 17500 | Obtained as 16% solutions in ampoules, and diluted to 3% in Potassium Phosphate Buffer |
| **PBS | |||
| 1X PBST | 1X PBS with 0.1% Tween 20 | ||
| Methanol | Electron microscopy services | 18510 | |
| Normal goat serum (NGS) | Cell Signaling | 5425 | Diluted to 30% in 1x PBST |
| MAPKYT (dpERK) antibody | Sigma Inc. | M9692 | Dilution 1:400 in 30% NGS |
| Secondary antibody | Invitrogen | A-11005 | Dilution 1:500 in 30% NGS |
| DAPI | Sigma | D9542 | |
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| *M9 Buffer Recipe | 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. | ||
| **PBS (1X) | 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, 0.133 g CaCl2.2H2O, 0.10 g MgCl2.6H2O, H2O to 1 litre | ||
| Nematode Growth Medium (NGM) | 3 g NaCl, 17 g Agar, 2.5 g Peptone, 975 mL of water in 2 L Erlenmayer Flask. Autoclave for 50 minutes. Cool, and add 1 mL of 1M CaCl2, 1 mL of 5 mg/mL cholesterol, 1 mL of 1M MgSO4 and 25 mL of 1M KPO4. |
References
- Chang, L., Karin, M. Mammalian MAP kinase signalling cascades. Nature. 410, 37-40 (2001).
- McKay, M. M., Morrison, D. K. Integrating signals from RTKs to ERK/MAPK. Oncogene. 26, 3113-3121 (2007).
- Sundaram, M. V. Canonical RTK-Ras-ERK signaling and related alternative pathways. WormBook. , 1-38 (2013).
- Fabregat, I., Roncero, C., Fernandez, M. Survival and apoptosis: a dysregulated balance in liver cancer. Liver Int. 27, 155-162 (2007).
- Hackett, A., Rowe, L. FGFR1 Pfeiffer syndrome without craniosynostosis: an additional case report. Clin Dysmorphol. 15, 207-210 (2006).
- Murphy, L. O., Blenis, J. MAPK signal specificity: the right place at the right time. Trends Biochem Sci. 31, 268-275 (2006).
- Vogels, A., Fryns, J. P. Pfeiffer syndrome. Orphanet J Rare Dis. 1, 19 (2006).
- Klesse, L. J., Meyers, K. A., Marshall, C. J., Parada, L. F. Nerve growth factor induces survival and differentiation through two distinct signaling cascades in PC12 cells. Oncogene. 18, 2055-2068 (1999).
- Marshall, C. J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell. 80, 179-185 (1995).
- Chang, C., Sternberg, P. W. C. elegans vulval development as a model system to study the cancer biology of EGFR signaling. Cancer Metastasis Rev. 18, 203-213 (1999).
- Lee, M. H., et al. Multiple functions and dynamic activation of MPK-1 extracellular signal-regulated kinase signaling in Caenorhabditis elegans germline development. Genetics. 177, 2039-2062 (2007).
- Lopez, A. L., et al. DAF-2 and ERK couple nutrient availability to meiotic progression during Caenorhabditis elegans oogenesis. Dev Cell. 27, 227-240 (2013).
- Miller, M. A., et al. A sperm cytoskeletal protein that signals oocyte meiotic maturation and ovulation. Science. 291, 2144-2147 (2001).
- Ohmachi, M., et al. C. elegans ksr-1 and ksr-2 have both unique and redundant functions and are required for MPK-1 ERK phosphorylation. Curr Biol. 12, 427-433 (2002).
- Church, D. L., Guan, K. L., Lambie, E. J. Three genes of the MAP kinase cascade, mek-2, mpk-1/sur-1 and let-60 ras, are required for meiotic cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Development. 121, 2525-2535 (1995).
- Hubbard, E. J., Greenstein, D. The Caenorhabditis elegans gonad: a test tube for cell and developmental biology. Dev Dyn. 218, 2-22 (2000).
- Arur, S., et al. MPK-1 ERK controls membrane organization in C. elegans oogenesis via a sex-determination module. Dev Cell. 20, 677-688 (2011).
- Arur, S., et al. Multiple ERK substrates execute single biological processes in Caenorhabditis elegans germ-line development. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4776-4781 (2009).
- Mattingly, H. H., Chen, J. J., Arur, S., Shvartsman, S. Y. A Transport Model for Estimating the Time Course of ERK Activation in the C. elegans Germline. Biophys J. 109, 2436-2445 (2015).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Dorman, J. B., Albinder, B., Shroyer, T., Kenyon, C. The age-1 and daf-2 genes function in a common pathway to control the lifespan of Caenorhabditis elegans. Genetics. 141, 1399-1406 (1995).
- Francis, R., Barton, M. K., Kimble, J., Schedl, T. gld-1, a tumor suppressor gene required for oocyte development in Caenorhabditis elegans. Genetics. 139, 579-606 (1995).
- Seydoux, G., Dunn, M. A. Transcriptionally repressed germ cells lack a subpopulation of phosphorylated RNA polymerase II in early embryos of Caenorhabditis elegans and Drosophila melanogaster. Development. 124, 2191-2201 (1997).
