Aktif ERK Mekansal ve Zamansal Analizi<em> C. elegans</em> Germline

Burada açıklanan protokol omurgasız bir model sistem C için öncelikle elegans ve kurum tarafından belirlenen tüm etik kuralları takip eder. 1. Hayvan Bakım C koruyun E. ile tohumlanan agar nematodu Büyüme Ortamı 20,21 (NGM, bkz Malzeme Tablosu) hisse senedi kültürleri çalışan elegans E. coli OP50. 16 ° C ve 25 ° C arası bir sıcaklıkta solucan stokları koruyun. NOT: genellikle hızlı büyüme oranı, anormal germ geliştirme ve alt kuluçka boyutlarda yüksek sıcaklıklar sonuçlara solucanlar kültüre. Ayrıca, ısıya duyarlı genotip farklı sıcaklıklarda farklı fenotipleri gösterecektir. besili solucanlar sabit bir kaynağı sağlamak amacıyla büyüme oranına bağlı 3 gün – her 2 yeni NGM plakalar solucanlar aktarın. NOT: dpERK seviyelerini kapsayan herhangi bir deney için, solucanlar bir hasret veya kalabalık elde olmaMAlıdıred plaka. Kalabalık ya da açlık etkileri insülin solucanlar 22 sinyalizasyon ve insülin sinyal ERK 12 aktivitesini düzenler. Böylece açlıktan veya kalabalık plakalardan solucanlar değişken ve zor Yeniden boyanma neden olacaktır. Gonadlar Elde Yetişkin Worms 2. Diseksiyon 150 WT (N2) ya da bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpü içinde M9 tampon 100 uL arzu edilen ve belirli bir gelişim aşamasında (L1, L2, L3, L4, yetişkin vb.) Solucanlar istenen genotip – 100 al. M9 tampon 900 mcL ependorf tüp doldurun (Malzeme Tablo). çevre sıcaklığında 1 dakika boyunca bir mikrosantrifüj içinde 1000 x g'de santrifüjleyin tüpler. Yavaşça M9 tampon 900 mcL çıkarın ve atın. solucanlar kazara kaldırılmaz emin olmak için bir mikroskop altında tamponu çıkarın. Taze M9 ile 2.3 iki kez daha her zaman tampon – yineleyin 2.2 adımları.Bu solucanlar üzerinde gerçekleştirilmiştir bir bakteri için etkili yıkanır sağlar. Son yıkamadan sonra tüp ve ıskarta gelen M9 tampon 900 mcL çıkarın. düz dipli cam izle çanak 200 ul-mikropipet ucu ile 150 solucanlar – 100 içeren kalan 100 uL M9 tampon aktarın. Mikropipet ucu kullanılmadan önce 10 uL işaretine kesilmiş olduğundan emin olun. ucu solucanlar makaslama neden olur kesme değil. M9 tampon solucanları içeren cam izle çanak 0.1 M levamisolün 3 mcL – 1 ekleyin. Yavaşça solucanlar hareketli durdurana kadar karıştırma bile etkinleştirmek için levamizol ve M9 girdap. NOT: Levamisole stokları, uzun süreli depolama için -20 ° C'de muhafaza edilebilir. Hayvanlarda hareket hızla kaybolmasına elde etmek amacıyla levamizol 0.25 mM – 0.2 arasında, literatürde 23'te tarif edilmiştir ne 3 mm'den – Al, 1 daha yüksek konsantrasyonda kullanmak. Hayvanlar da l etrafında soymak halindeOng sıvı süspansiyon olarak, yumurtalıklarda dpERK elde edilen desenler (stres veya beslenme ya da her ikisi olmaması) değişken olabilir. diseksiyon için 3 mM levamizol – Daha tekrarlanabilir boyanma 1 ile elde edilmiştir. İki 1 ml şırınga (iğne göstergesi kritik önemi yoktur şırınga boyutu) iki 25 G iğne takın. Her el pozisyonu bir şırınga (Şekil 2). Şekil 2'de görüldüğü gibi bir mikroskop altında altında ve her solucan üzerinde her iğne yerleştirin ve bir makas hareketi ikinci faringeal ampul yakın solucan ince bir kesim yerleştirin. çanak tüm hayvanlar en az bir kez kesilmiş kadar solucan bir kesintisinden sonra bir sonraki hayvana hareket. NOT: – 2.9 Zaman duyarlı 2.8 adımları dikkatli olun. tekrarlanabilir dpERK desen için beş dakika altında çanak tüm solucanları teşrih. Daha uzun diseksiyon süreleri özellikle Z, dpERK sinyalinin kapalı bir dönüm neden olacaktırbir 1. ayrılan zaman dilimi içinde kalmak diseksiyon (yani, 50 solucanlar vs 150) gerekirse tur başına solucan sayısını ayarlayın. durumunda bir ekstrüde gonad diseksiyonu sırasında, aynı hayvanda başka kesim girişimi yok görünür değil. Genellikle sadece hayvan kesme ve gonad ekstrüzyon neden olmaz. Bunun yerine, bir sonraki hayvana geçmek. a'ya yok gonadlar 6. bölümde yapılacak ve görüntüleme sırasında göz ardı edilebilir slaytlar üzerinde gibi görünecektir solucanlar NOT: Diseksiyon ve işleme tüm adımları sayesinde, gonad beden / karkas bağlı kalacaktır akılda tutmak önemlidir. gonad ve dışında iğne ile vücuda zorlamayın. vücuttan gonad ayırmak için bir girişim Genellikle gonadal dokuda anormal bir gözyaşı sahte antikor sinyali neden olabilir. beden / karkas görüntüleme adımları (bölüm 6) sırasında göz ardı edilebilir, ve sadece gonad görüntülenmiş. Buna ek olarak, SOmbağırsak hücreleri de antikor tahlil için de olsa iç kontroller / somatik kontrolleri hizmet edebilir etimes. 3. Gonad Fixation Diseksiyon tamamlandıktan sonra, M9, 100 uL içeren cam takip çanak ve çıkartılan hayvanlara doğrudan% 3 paraformaldehit (PFA) 2 ml ilave edilir ve Parafilm ile kaplayın. Kimyasal bir davlumbaz kaplı izle cam tabak yerleştirin. Dikkat: PFA tehlikeli bir kimyasaldır. Bu durumda, sabitleme kimyasal davlumbaz yapılmalıdır. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Tek kullanımlık 9 "cam Pasteur pipeti kullanarak disseke hayvanların bulunduğu izle cam tabak 3 ml 1x PBS-T (bkz Malzeme Tablo) ekleyin. Mix Pasteur içine disseke hayvanlarla PFA çözüm ve 1x PBS-T çizerek pipet ve yavaşça izle cam tabak içine serbest. yıkama sırasında vorteks tüpleri etmeyin. Bir frekansları kullanansh cam Pasteur pipeti Pasteur pipeti içine izle cam tabak 5 (disseke solucanları içeren, PFA ve 1x PBS-T) sıvı ml çizin ve taze bir 5 ml cam konik tüp içine içeriğini aktarmak. Santrifüj 1,000 x g'de bir klinik santrifüj cihazında 30 saniye boyunca konik boru. cam Pasteur pipetler ve konik tüpler kullanın olarak disseke gonadlar plastik sopa. Çıkarın ve disseke hayvanların rahatsız etmeyecek şekilde özen süpernatant atın. parçalara gonadlar etkiler olmayacak şekilde bir mikroskop altında konik tüp, her bir yıkamadan sonra sıvı çıkarın ve bunların kaybını en aza indirir. taze Pasteur pipeti kullanarak, konik tüplere 5 ml 1x PBS-T ekleyin. Santrifüj 1,000 x g'de 30 saniye boyunca bir klinik santrifüj konik tüp. Çıkarın ve disseke hayvanların rahatsız etmeyecek şekilde özen süpernatant atın. üç kez olmak üzere toplam için yineleyin 3.7. taze bir Pasteur pipeti kullanılarak,% 100 2 mL ekleyintüplere metanol ve yavaşça Pasteur pipeti içine çizerek metanol ile gonadlar karıştırın. 1 saat en az 20 ° C 'de tüp inkübe edin. Not: Dissected gonadlar dpERK boyama için en fazla 2 gün boyunca metanol içinde saklanabilir. en fazla 2 gün 2 hafta kadar depolama ancak dpERK antikoru ile anti-Lamin antikoru gibi antikor boyama uygulamalar ile uyumludur. İstenilen kuluçka süresinden sonra, gonadlar yıkamak için üç kez olmak üzere toplam adım 3.7 tekrarlayın. yıkama sırasında vorteks tüpleri yok. Son yıkamadan sonra 5 ml konik bir tüp içinde 1 x PBS-T 500 uL bırakın. Taze Pasteur pipeti taze bir 1 ml cam tüp (6 mm x 50 mm) içine konik cam tüp içeriğini aktarmak kullanma. 10 dakika – disseke hayvanların 5 için yerçekimi ile yerleşmek için izin verin. taze bir Pasteur pipeti kullanılarak ve mikroskop altında, 1 ml cam borular WIT mümkün yıkama kadar kaldırmahout disseke gonadlar rahatsız. 4. Bloklama ve birincil antikor tedavisi % 30 100 uL 1x PBS-T ile inceltilmiş normal keçi serumu (NGS); 1 ml cam tüplerde parçalara hayvanlara (Malzeme Tablo). % 30 NGS engelleme tampon görevi görür. sıvının buharlaşmasını önlemek için Parafilm ile tüp örtün. 1 saat ya da gece boyunca 4 ° C'de oda sıcaklığında inkübe edin. inkübasyon istenen süreden sonra, mümkün olduğu kadar çok sıvıyı, taze bir Pasteur pipeti kullanılarak Bloklama tamponunu çıkarın. gonadlar Pasteur pipeti olarak hazırlanan emin olmak için bir diseksiyon mikroskobu kullanın. % 30 NGS 400: 1'de (dpERK olarak bu yöntemde anılan malzemeler Tablo, bakınız) MAPKYT antikor sulandırmak. tüp başına 100 uL kullanmak için yeterli antikor seyreltme hazırlayın. Kullanılmayan seyreltilmiş antikor, bir hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir. seyreltilmiş anti-dpERK antikoru 100 mcL yüzdendisseke hayvanların bulunduğu 1 mL cam tüplere dökülmesinden. Parafilm ile tüpler mühür. 4 ° C sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin. Gece boyunca inkübasyondan sonra, oda sıcaklığında tüplere 1x PBST 800 uL ekleyin. taze cam Pasteur pipeti numune çizin ve gonadlar eşit 1x PBS-T içinde süspanse olmasını sağlamak için hafifçe bırakın. gonadlar yerçekimi ile dibe edelim. süpernatantı. Bu disseke gonadlar yıkanmış ancak işlem sırasında hasar görmemesi sağlar. Üç yıkar toplam 4.6 – Tekrar 4.5 adımları. yıkama sırasında vorteks tüpleri yok. Üçüncü yıkamadan sonra çıkarın ve disseke hayvanların bozmadan mümkün olduğunca süpernatant atın emin olun. Taze Pasteur pipeti her zaman kullanıldığından emin olun. 5. ikincil antikor tedavisi primer antikor sırasında yıkar ikincil antikor için seyreltme hazırlamak. Anti-fare sulandırmak se1 de condary antikor: 500% 30 NGS. Primer antikor gibi, tüp başına 100 uL kullanın. Kullanılmayan antikor, bir hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir. disseke hayvanların bulunduğu 1 mL cam tüplere 100 uL ikincil antikor çözüm ekleyin. Parafilm ile her tüp Kapak ve karanlıkta tüp içeriğini korumak için alüminyum folyo ile tüpler sarın. 2 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin, ya da seçenek olarak bir gece boyunca 4 ° C 'de. inkübasyon istenen süreden sonra, tüpler 1 x PBS-T 800 ul ekleyin ve tekrar 4.5 adım – üç kez olmak üzere toplam 4.6. Son yıkamadan sonra, kaldırma ve yeni bir Pasteur pipeti kullanılarak bir mikroskop altında mümkün olduğu süpernatant kadar atın. sekonder antikor için yıkama sırasında DAPI çözeltisi hazırlayın. 1x PBST 1 mL in (-20 ° C'de saklanan 1 mg / ml'lik bir 1,000x stoktan) DAPI 1 uL seyreltilir. içeren tüplere seyreltildi DAPI çözeltisinin 800 mcLDissected hayvanlar. Parafilm ile tüp ağız Kapak ve alüminyum folyo ile her tüp sarın. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. parçalara hayvanlar rahatsız etmemek için DAPI ile inkübe edildikten sonra, bir mikroskop altında, yeni bir Pasteur pipeti ile mümkün olduğu DAPI çözeltisinin kadar çıkarın. tüplere montaj çözümü 1 damla ekleyin. alüminyum folyo her tüp sarın. NOT: dpERK boyama görselleştirmek için, lekeli gonadlar hemen mikroskopi için monte edilmelidir. Bu fosforlu serin 10 Histon H3 gibi antikor uygulamalar için, gonadlar, karanlıkta 4 ° C'de en fazla 2 hafta içinde ortam montaj tutulabilir. 6. Montaj Slaytlar ve Görüntüleme . Şekil 3'te görüldüğü gibi iki cam mikroskop lamı (25 mm x 75 mm x 1 mm), üstünde, uzunlamasına laboratuvar bant katmanı yerleştirin iki bantlanmış slaytlar arasında taze bir temiz bir cam mikroskop lamı yerleştirin. NOT: kalınlıkbandın orta slaytta bir agaroz ped oluşturmanıza yardımcı olur. Bant agaroz ped oluşturmak için bir ara parçası olarak hizmet olarak agaroz pedin kalınlığı, bandın edilene hemen hemen eşittir. orta mikroskop lamı üzerine damla erimiş% 2 agaroz ~ 200 uL (damıtılmış su içinde yapılan). Hızla Agaroz, dik ve üstünde, bir taze, temiz bir slayt yerleştirin. (- 2 dk 1) agaroz katılaşmaya edelim. agaroz ped yok edilmez şekilde, çok yavaşça üst mikroskop lamı çıkarın. agaroz ped üst veya alt slayt ya bağlı kalabilir. Agaroz pedi sürece agaroz pürüzsüz bir yüzey olarak, bağlı kalır slayt önemi yoktur. Pasteur pipet agaroz ped üzerine disseke hayvanların aktarmak kullanma. bir mikroskop altında bir Pasteur pipeti kullanarak slayt herhangi bir aşırı sıvı çıkarın. gonadlar ve bağırsaklar a itmek, bir kirpik saç veya ince çekilmiş kılcal kullanarakslayt gonadlar yaymak amacıyla birbirinden yolu. 24 mm x 50 mm boyut lamel ile bir mikroskop lamı örtün. lamel minimum hava kabarcıkları lamel ve slayt arasında oluşmakta olan ile slayt üzerine hafifçe düşürdü olduğundan emin olmak için özen gösterin. Bir slayt kutusunda bir gecede 4 ° C (slaytlar kadar lamel, düz yatan bir opak slayt kutusu) saklayın fazla sıvı buharlaşmasına ve gonadlar (nedeniyle gonadlar üzerinde lamel ağırlığına) biraz basık olmasına izin. gonadlar hafif düzleşme bir başka yuvarlak gonadal tüpün daha iyi görüntüleme için izin verir. lamel monte edildikten sonra, parmaklarınızla lamel üstüne baskı uygulamak için yok. Genellikle bu gonadlar ve dpERK sinyal kaybı bozulmasına neden olur. Sadece daha etkili görüntüleme için bir gecede gonadlar dümdüz. slaytlar kısa sürede de monte edilir olarak görülebilir hazırdır. Hemen fotoğraf çekmek için, yavaşça absorbelamel ve temiz bir laboratuar dokusu kullanılarak köşelerinden slayt arasındaki aşırı sıvı. Gecede bir süre sonra, slayt mühür ve lamel ve slayt sınır dört köşesinde şeffaf oje pardesü ile lamel. oje / lamel mühür lamel görüntüleme sırasında hareket etmez sağlar ve numunelerin yıkımına karşı korur. Görüntü 63x bir bileşik mikroskop ile gonadlar. Ancak objektif lens ve mikroskop mikroskop ve kullanıcı uygulamanın durumuna göre değiştirilebilir. Oosit proliferatif bölgeden tüm gonad büyüklüğü bir görüntüde yakalanabilir daha büyük olduğundan, Şekil 4. 11-14, 18 gösterildiği gibi, görüntüler örtüşen sınırları olan bir montaj olarak alınır. Birçok durumda, sürece hiçbir büyük değişiklikler germlin görüntüye yapılır olarak, son görüntüleme ve montajdan sonra karkas düzenleyin. Mağaza tmonte görüntünün boyunca o ham görüntüleri 'önce' montaj / düzenleme karşılaştırma ve görüntülerin montaj 'sonra' / düzenleme sağlamaktır. NOT: mikroskobu görüntüleri montaj montajı sırasında sinyal gücüne veya doygunluk için değiştirilmemelidir.