Spaziale e temporale Analisi di attiva ERK nel<em> C. elegans</em> Linea germinale

Il protocollo qui descritto è in primo luogo per il sistema modello invertebrati C. elegans, e segue tutte le linee guida etiche stabilite dall'istituzione. 1. Manutenzione degli animali Mantenere C. elegans di lavoro stock culture sul nematode crescita a medio 20,21 (NGM, vedi Materiali Tavolo) agar seminato con E. coli OP50. Mantenere gli stock a vite senza fine a temperature comprese tra 16 ° C e 25 ° C. NOTA: La coltura vermi alle più alte temperature si traduce in maggiore velocità di crescita, spesso, lo sviluppo della linea germinale aberranti e dimensioni covata inferiori. Inoltre, genotipi sensibili alla temperatura mostreranno fenotipi diversi a diverse temperature. Trasferire i vermi a nuove piastre NGM ogni 2 – 3 giorni a seconda sul loro tasso di crescita in modo da mantenere una fornitura costante di vermi ben nutriti. NOTA: Per ogni esperimento che coinvolge i livelli dpERK, vermi NON devono essere ottenuti da un morto di fame o di follapiatto ed. Affollamento o impatti fame segnalazione dell'insulina nei vermi 22, e segnalazione dell'insulina regola ERK 12 attività. Così i vermi da lastre Starved o sovraffollate si tradurrà in modelli di marcatura variabili e difficili da riprodurre. 2. La dissezione di vermi adulti per ottenere Gonadi Raccogliere 100 – 150 WT (N2) o genotipo desiderato di vermi allo stadio di sviluppo desiderato e specifico (L1, L2, L3, L4, adulti, ecc.) In 100 ml di tampone M9 in una provetta da microcentrifuga da 1,5. Riempire la provetta con 900 ml di tampone M9 (vedi Materiali Tavolo). Centrifugare le provette a 1000 xg in una microcentrifuga per 1 min a temperatura ambiente. Rimuovere delicatamente 900 ml del buffer M9 e scartare. Rimuovere il buffer sotto un microscopio da dissezione per garantire che i vermi non vengano accidentalmente rimossi. Ripetere i punti 2.2 – 2.3 altre due volte con fresca M9 tampone ogni volta.Ciò garantisce che tutti i batteri che sono stati riportati con i vermi sono effettivamente lavati via. Dopo l'ultimo lavaggio rimuovere 900 ml di tampone M9 dal tubo e degli scarti. Trasferire il restante 100 ml di M9 tampone contenente i 100 – 150 vermi con una punta di 200 microlitri-micropipetta ad un fondo piatto piatto di orologio di vetro. Assicurarsi che la punta micropipetta viene tagliato in corrispondenza del segno 10 ml prima dell'uso. Non tagliare la punta comporterà tranciatura dei vermi. Aggiungere 1 – 3 ml di 0,1 M levamisolo al piatto orologio di vetro contenente i vermi nel buffer M9. Agitare delicatamente il levamisolo e la M9 per consentire anche mescolare fino a quando i vermi si fermano. NOTA: le scorte levamisolo può essere conservato a -20 ° C per una conservazione a lungo termine. Qui, utilizzare la maggiore concentrazione di 1 – 3 mM quello che è stato descritto in letteratura 23 0,2 – 0,25 mm di levamisolo per ottenere una rapida perdita di mobilità negli animali. Se gli animali Flay giro per troppo long in sospensione liquida, i modelli risultanti dpERK nelle gonadi possono essere variabile (a causa di stress o di mancanza di alimentazione o di entrambi). pattern di colorazione Ulteriori riproducibili sono stati raggiunti con 1 – 3 mM levamisolo per la dissezione. Fissare due aghi 25 G a due siringhe 1 mL (la dimensione della siringa non importa, il calibro dell'ago è critica). Posizionare una siringa in ogni mano (Figura 2). Sotto un microscopio da dissezione, posizionare ciascun ago sotto e sopra ogni vite senza fine, come mostrato in Figura 2 e posizionare un taglio sottile sul verme vicino alla seconda lampadina faringea con un movimento a forbice. Dopo un taglio nel verme passare al successivo animali finché tutti gli animali nel piatto sono stati tagliati almeno una volta. NOTA: essere consapevoli che i passaggi 2,8-2,9 sono momento delicato. Sezionare tutti i vermi nel piatto in meno di cinque minuti per un modello dpERK riproducibile. tempi di dissezione più lunghi si tradurrà in un spegnimento del segnale dpERK, soprattutto in Zuno 1. Regolare il numero di vermi per ogni turno di dissezione (vale a dire, 50 vermi vs 150), se necessario, per rimanere nel lasso di tempo assegnato. Nel caso in cui una gonade estruso non è visibile durante la dissezione, non tentare un altro taglio nello stesso animale. Solitamente che si tosare solo l'animale e non provocare l'estrusione della gonade. Invece, passare al successivo animali. Worms dove le gonadi non estrudere appariranno come tali le diapositive che verranno fatte nella sezione 6 e possono essere ignorati durante l'imaging NOTA: Attraverso tutte le fasi di dissezione e di trasformazione, è importante ricordare che gonade rimarrà attaccato al corpo / carcassa. Non forzare la gonade e il corpo senza con l'ago. Spesso una lacerazione aberrant nel tessuto gonadico nel tentativo di recidere gonade dal corpo possono causare segnale spurio anticorpi. Il corpo / carcassa può essere ignorato durante le fasi di imaging (sezione 6), e solo il gonade ripreso. Inoltre, SOMetimes le cellule intestinali possono anche servire come controlli interni / controlli somatiche per l'anticorpo essere analizzati. 3. Fissazione gonadi Dopo la dissezione è completa, aggiungere 2 ml di 3% paraformaldeide (PFA) direttamente al piatto orologio di vetro contenente 100 ml di M9 e gli animali sezionati e coprire con Parafilm. Posizionare il piatto di vetro dell'orologio coperto in una cappa. Attenzione: PFA è una sostanza chimica pericolosa. Così, il fissaggio deve essere eseguita nella cappa. Incubare a temperatura ambiente per 10 min. Usando una usa e getta pipetta 9 "Pasteur di vetro aggiungere 3 ml di 1x PBS-T (vedi Materiali tabella) per il piatto di vetro orologio che contiene gli animali sezionati. Mix disegnando la soluzione PFA e 1x PBS-T con gli animali sezionati nel Pasteur pipetta e rilasciando delicatamente nuovamente dentro il piatto di vetro dell'orologio. non vortice i tubi durante i lavaggi. Utilizzando un frevetro sh pipetta Pasteur disegnare il 5 ml di liquido (contenente vermi sezionati, PFA e 1x PBS-T) dal piatto di vetro dell'orologio nella pipetta Pasteur e trasferire il contenuto in un nuovo 5 ml tubo di vetro conica. Centrifugare le provette coniche per 30 secondi in una centrifuga clinica a 1.000 x g. Utilizzare pipette Pasteur in vetro e tubi conici come gonadi sezionati aderisce alla plastica. Rimuovere e scartare il surnatante facendo attenzione in modo da non disturbare gli animali sezionati. Rimuovere il liquido dopo ogni lavaggio dal tubo conico sotto un microscopio da dissezione modo da non alterare le gonadi sezionato, e minimizzare la loro perdita. Usando una pipetta Pasteur fresco, aggiungere 5 ml di 1x PBS-T per i tubi conici. Centrifugare le provette coniche in una centrifuga clinica per 30 s a 1.000 x g. Rimuovere e scartare il surnatante facendo attenzione in modo da non disturbare gli animali sezionati. Ripetere passaggio 3.7 per un totale di tre volte. Usando una pipetta Pasteur fresco, aggiungere 2 ml di 100%metanolo per i tubi, e mescolare delicatamente le gonadi con il metanolo elaborando nella pipetta Pasteur. Incubare la provetta a -20 ° C per almeno 1 ora. NOTA: dissecato gonadi possono essere memorizzati in metanolo per un massimo di 2 giorni per dpERK colorazione. Bagagli per più di 2 giorni e fino a 2 settimane è compatibile con altre applicazioni di anticorpi di colorazione, come anticorpo anti-Lamin, ma non con l'anticorpo dpERK. Dopo il tempo di incubazione desiderato, ripetere il passaggio 3.7 per un totale di tre volte per lavare gonadi. Non vortice i tubi durante i lavaggi. Dopo l'ultimo lavaggio lasciare 500 ml di 1x PBS-T nel tubo conico 5 ml. Utilizzando trasferire una pipetta Pasteur il contenuto della provetta conica in una provetta 1 fresco mL (6 mm x 50 mm). Consentire agli animali sezionati di stabilirsi per gravità per 5 – 10 minuti. Usando una pipetta Pasteur fresco e sotto un microscopio da dissezione, rimuovere la maggior quantità di lavaggio possibile dal 1 ml tubi di vetro di spiritoHout disturbare le gonadi sezionati. 4. Blocco e trattamento Anticorpo primario Aggiungere 100 ml di 30% Normal Goat Serum (NGS) diluito in 1x PBS-T (vedi Materiali tabella) agli animali sezionati nei tubi di vetro da 1 ml. 30% NGS serve come tampone di bloccaggio. Coprire il tubo con Parafilm per evitare l'evaporazione del liquido. Incubare a temperatura ambiente per 1 h oppure a 4 ° C durante la notte. Dopo il tempo desiderato di incubazione, rimuovere il tampone bloccante con una pipetta Pasteur fresco, eliminando quanto più liquido possibile. Utilizzare un microscopio da dissezione per garantire che le gonadi non sia redatto nella pipetta Pasteur. Diluire l'anticorpo MAPKYT (vedi Materiali Tavolo, cui questo metodo come dpERK) a 1: 400 nel 30% NGS. Preparare la diluizione degli anticorpi sufficiente per utilizzare 100 ml per provetta. Inutilizzato, anticorpo diluito può essere conservato a 4 ° C per una settimana. Aggiungere 100 ml di anticorpo anti-dpERK diluita in modoluzione ai tubi di vetro 1 ml contenente gli animali sezionati. Sigillare i tubi con Parafilm. Incubare le provette a 4 ° C durante la notte. Dopo incubazione durante la notte, aggiungere 800 ml di 1x PBST per le provette a RT. Prelevare il campione in una nuova pipetta Pasteur di vetro e rilasciare delicatamente per garantire che le gonadi siano uniformemente sospesi in 1x PBS-T. Lasciate che le gonadi depositano sul fondo con la gravità. Rimuovere il surnatante. Questo assicura che le gonadi sezionato vengono lavati ma non danneggiate durante il processo. Ripetere i passaggi 4,5-4,6 per un totale di tre lavaggi. Non vortice i tubi durante i lavaggi. Dopo il terzo lavaggio assicurarsi di rimuovere ed eliminare quanto più surnatante possibile senza disturbare gli animali sezionati. Assicurarsi che una pipetta Pasteur fresco viene utilizzato ogni volta. 5. Il trattamento anticorpo secondario Durante l'anticorpo primario lava Preparare la diluizione per l'anticorpo secondario. Diluire il anti-topo SEanticorpo condary a 1: 500 nel 30% NGS. Come con l'anticorpo primario, utilizzare 100 ml per provetta. anticorpo non utilizzato può essere conservato a 4 ° C per una settimana. Aggiungere 100 ml soluzione anticorpo secondario per i tubi di vetro 1 ml contenente gli animali sezionati. Coprire ciascun tubo con parafilm e poi avvolgere i tubi in alluminio per mantenere il contenuto della provetta nel buio. Incubare le provette a RT per 2 h, oppure a 4 ° C durante la notte. Dopo il tempo desiderato di incubazione, aggiungere 800 ml di PBS 1x-T ai tubi e ripetere i passaggi 4,5 – 4.6 per un totale di tre volte. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere ed eliminare la maggior quantità di surnatante possibile sotto un microscopio da dissezione con una pipetta Pasteur fresco. Preparare la soluzione DAPI durante i lavaggi per l'anticorpo secondario. Diluire 1 ml di DAPI (da un 1,000x magazzino di 1 mg / mL conservati a -20 ° C) in- 1 ml di 1x PBST. Aggiungere 800 microlitri della soluzione diluita DAPI ai tubi contenenti laanimali sezionati. Coprire la bocca del tubo con parafilm e avvolgere ogni tubo in alluminio. Incubare a temperatura ambiente per 20 min. Dopo l'incubazione con DAPI, rimuovere la maggior quantità della soluzione DAPI possibile con una pipetta Pasteur, sotto un microscopio da dissezione per non disturbare gli animali sezionati. Aggiungere 1 goccia di soluzione ai tubi di montaggio. Avvolgere ogni tubo in un foglio di alluminio. NOTA: Per visualizzare dpERK colorazione, gonadi macchiati deve essere montato per la microscopia immediatamente. Per altre applicazioni anticorpali come fosforilazione della serina 10 istone H3, gonadi possono essere tenuti in mezzi di montaggio per fino a 2 settimane a 4 ° C al buio. 6. Assemblaggio diapositive e Imaging Posizionare uno strato di nastro laboratorio longitudinale, sulla parte superiore, di due vetrini per microscopio (25 millimetri x 75 mm x 1 mm) come si vede nella figura 3. Inserire una fresca pulita vetrino per microscopio tra le due slitte nastrate. NOTA: Lo spessoredel nastro aiuta a generare un pad agarosio sul vetrino centrale. Spessore del pad agarosio è quasi uguale a quella del nastro, come il nastro serve come distanziatore per creare il pad agarosio. Goccia ~ 200 ml di fuso 2% agarosio (effettuate in acqua distillata) sul vetrino da microscopio in mezzo. Introdurre rapidamente una diapositiva fresca pulita, perpendicolare e sulla parte superiore, della agarosio. Lasciate che il Solidifica agarosio (1 – 2 min). Rimuovere il vetrino superiore molto delicatamente, tale che il pad agarosio non viene distrutta. Il pad agarosio può rimanere attaccato sia alla parte superiore o la diapositiva in basso. Non importa quale scorrere il pad agarosio rimane attaccato, fintanto che è una superficie liscia di agarosio. Usando una pipetta Pasteur trasferire gli animali sezionati sul pad agarosio. Rimuovere il liquido in eccesso dal vetrino usando una pipetta Pasteur sotto un microscopio da dissezione. L'utilizzo di un capelli ciglia o capillare finemente disegnati, spingere il gonadi e intestino unamodo tra loro per diffondere gonadi sul vetrino. Coprire il vetrino da microscopio con un coprioggetto misura 24 mm x 50 mm. Fare attenzione per garantire che il vetrino si abbassa dolcemente sul vetrino con bolle d'aria minimo in formazione tra il vetrino e lo scivolo. Conservare a 4 ° C per una notte in una scatola di presentazione (una casella di scorrimento opaco con le diapositive in posizione orizzontale, coprivetrino up) per consentire il liquido in eccesso di evaporare e gonadi a diventare un po 'appiattito (a causa del peso del vetrino sulle gonadi). Il lieve appiattimento delle gonadi permette una migliore immagine di un tubo gonadica altrimenti tondo. Una volta che il vetrino è montato, non per esercitare una pressione verso l'alto del vetrino con le dita. Spesso questo si traduce in una distorsione di gonadi e perdita del segnale dpERK. Appiattire le gonadi durante la notte solo per l'imaging più efficace. I vetrini sono pronti per essere visualizzati non appena vengono assemblati. Per prendere immediatamente le immagini, assorbire delicatamentel'eccesso di liquido tra il vetrino e il vetrino dagli angoli utilizzando un tessuto laboratorio pulito. Dopo il periodo notturno, sigillare il vetrino e applicare il coprioggetto con chiodo trasparente topcoat smalto sulle quattro angoli del coprioggetto e il confine diapositiva. Il / sigillo smalto vetrino assicura che il vetrino non si muove mentre l'imaging e protegge contro la distruzione dei campioni. Immagine le gonadi con un microscopio composto a 63X. Tuttavia la lente obiettivo e microscopio possono essere variati sulla base della disponibilità di microscopi e dell'applicazione utente. Poiché la dimensione dell'intero gonadi dalla regione proliferativa ai ovociti è più grande può essere catturata in una immagine, le immagini sono presi come un montaggio con contorni sovrapposti come mostrato in Figura 4. 11-14, 18. In molti casi, modificare la carcassa dopo la formazione immagine finale e assemblaggio, purché non importanti alterazioni sono fatti all'immagine linea germinale. Conservare tegli immagini crude lungo l'immagine assemblato per consentire il confronto della 'prima' di montaggio / editing e 'dopo' il montaggio / editing delle immagini. NOTA: Le immagini di microscopia non devono essere alterati per l'intensità del segnale o la saturazione durante il montaggio del montaggio.