Análisis espacial y temporal de ERK en el Activo<em> C. elegans</em> línea germinal

El protocolo descrito aquí es principalmente para el sistema modelo de invertebrados C. elegans, y sigue todas las pautas éticas establecidas por la institución. 1. Mantenimiento de Animales Mantener C. elegans trabajando cultivos madre en medio de crecimiento de nematodos 20,21 (NGM, ver Tabla de Materiales) de agar sembradas con E. OP50 coli. Mantener las poblaciones de gusano a temperaturas entre 16 ° C y 25 ° C. NOTA: El cultivo de gusanos a temperaturas mayores resultados en la tasa de crecimiento más rápido, a menudo, el desarrollo de la línea germinal aberrante e inferior tamaños de cría. Además, los genotipos sensibles a la temperatura se mostrarán diferentes fenotipos a diferentes temperaturas. Transferencia de gusanos a nuevas placas de NGM cada 2 – 3 días en función de su tasa de crecimiento a fin de mantener un suministro constante de gusanos bien alimentados. NOTA: Para cualquier experimento dado que implica niveles dpERK, gusanos NO deben ser obtenidos a partir de un muerto de hambre o de la muchedumbreplaca ed. El hacinamiento o impactos de hambre señalización de la insulina en los gusanos 22, y la señalización de la insulina regula la actividad de ERK 12. Así gusanos de placas de inanición o de hacinamiento darán lugar a patrones de tinción variables y difíciles de reproducir. 2. La disección de los gusanos adultos para la obtención de las gónadas Escoja 100-150 WT (N2) o genotipo deseado de gusanos en la etapa de desarrollo deseado y específico (L1, L2, L3, L4, adultos, etc.) En 100 l de tampón de M9 en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Llenar el tubo de microcentrífuga con 900 l de tampón M9 (véase la Tabla de Materiales). Centrifugar los tubos a 1.000 xg en una microcentrífuga durante 1 min a temperatura ambiente. Retire con cuidado 900 l del tampón M9 y desechar. Retire la memoria tampón bajo un microscopio de disección para asegurarse de que los gusanos no se eliminan accidentalmente. Repita los pasos 2.2 – 2.3 dos veces más con tampón M9 fresco cada vez.Esto asegura que cualquier bacteria que se llevaron de nuevo con los gusanos se lavan con eficacia de distancia. Después del lavado final eliminar 900 l de tampón M9 del tubo y de descarte. Transferir el 100 l de buffer restante M9 que contiene los 100 – 150 gusanos con una punta de 200 l-micropipeta a un plato de vidrio de reloj de fondo plano. Asegúrese de que la punta de la micropipeta se corta en la marca de 10 l antes de su uso. No corte la punta resultará en cizallamiento de los gusanos. Añadir 1 – 3 l de 0,1 M levamisol al plato reloj de cristal que contiene los gusanos en tampón M9. Hacer girar suavemente el levamisol y la M9 para permitir la mezcla incluso hasta que los gusanos dejan de moverse. NOTA: stocks Levamisol se puede almacenar a -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo. Aquí, utilizar la mayor concentración de 1 – 3 mM de lo que se ha descrito en la literatura 23 de 0,2 a 0,25 mM de levamisol el fin de obtener una rápida pérdida de la movilidad en los animales. Si los animales Flay alrededor durante demasiado long en la suspensión líquida, los patrones resultantes de dpERK en las gónadas pueden ser variables (debido a la tensión o la falta de nutrición o ambos). patrones de tinción más reproducibles se han logrado con 1-3 levamisol mM para la disección. Adjuntar dos agujas de 25 G a dos jeringas de 1 ml (el tamaño de la jeringa no importa, el calibre de la aguja es crítico). Coloque una jeringa en cada mano (Figura 2). Bajo un microscopio de disección, la posición de cada aguja bajo y sobre cada gusano como se muestra en la Figura 2 y colocar un corte fino en el gusano cerca de la segunda bombilla de la faringe en un movimiento de tijera. Después de un corte en el gusano pasar a la siguiente animal hasta que todos los animales en el plato se han reducido al menos una vez. NOTA: tener en cuenta que los pasos 2.8 hasta 2.9 son sensibles al tiempo. Diseccionar todos los gusanos en el plato en menos de cinco minutos para un patrón dpERK reproducible. tiempos más largos de disección se traducirá en un desvío de la señal dpERK, especialmente en Zuno 1. Ajuste el número de gusanos por ronda de disección (es decir, 50 gusanos vs. 150) si es necesario para permanecer en el marco de tiempo asignado. En caso de que una de las gónadas extruido no es visible durante la disección, no intente otro corte en el mismo animal. Por lo general, eso sólo cizallar el animal y no dar lugar a la extrusión de la gónada. En su lugar, pasar a la siguiente animal. Worms, donde las gónadas no extruir aparecerán como tales en las diapositivas que se harán en el apartado 6 y pueden ser ignorados durante la exploración NOTA: A través de todos los pasos de disección y procesamiento, es importante tener en cuenta que la gónada permanecerá unido a la caja / carcasa. No fuerce la gónada y el cuerpo de separación, con la aguja. Muchas veces un desgarro aberrante en el tejido gonadal en un intento de romper la gónada del cuerpo pueden dar lugar a la señal de anticuerpo espuria. El cuerpo / carcasa pueden ser ignorados durante las etapas de formación de imágenes (sección 6), y sólo la gónada crear una imagen. Además, sometimes las células intestinales también pueden servir como controles internos / controles somáticas para el anticuerpo que se está ensayando. 3. Fijación de las gónadas Después de la disección es completa, agregar 2 ml de 3% de paraformaldehído (PFA) directamente al plato de reloj de vidrio que contiene el 100 L de M9 y los animales disecados y cubrir con Parafilm. Coloque el plato de vidrio de reloj cubierto por una campana química. Precaución: PFA es una sustancia química peligrosa. Por lo tanto, la fijación se debe realizar en la campana de humos química. Incubar a TA durante 10 min. Usando una pipeta desechable 9 "Pasteur de vidrio añadir 3 ml de 1x PBS-T (véase la Tabla de Materiales) a la placa de vidrio de reloj que contiene los animales disecados. Mix dibujando la solución PFA y el 1x PBS-T con los animales disecados en el Pasteur pipeta y liberando suavemente de nuevo en el plato de vidrio de reloj. no Vortex los tubos durante los lavados. El uso de un fresh pipeta Pasteur de vidrio dibujar el 5 ml de líquido (que contiene gusanos disecados, PFA y 1x PBS-T) de la placa de vidrio de reloj en la pipeta Pasteur y transferir el contenido en un tubo cónico de vidrio de 5 ml fresca. Centrifugar los tubos cónicos de 30 segundos en una centrífuga clínica a 1.000 x g. Utilizar pipetas Pasteur de vidrio y tubos cónicos como gónadas disecados se adhieren al plástico. Retirar y desechar el sobrenadante teniendo cuidado a fin de no molestar a los animales disecados. Eliminar el líquido después de cada lavado del tubo cónico bajo un microscopio de disección a fin de no afectar a las gónadas disecados, y minimizar su pérdida. Utilizando una pipeta Pasteur fresco, añadir 5 ml de 1x PBS-T a los tubos cónicos. Centrifugar los tubos cónicos en una centrífuga clínica durante 30 s a 1.000 x g. Retirar y desechar el sobrenadante teniendo cuidado a fin de no molestar a los animales disecados. Repita el paso 3.7 para un total de tres veces. Con una pipeta Pasteur fresca, añadir 2 ml de 100%metanol para los tubos y mezclar suavemente las gónadas con el metanol mediante la elaboración en la pipeta Pasteur. Incubar el tubo a -20 ° C durante un mínimo de 1 h. NOTA: disecado gónadas se pueden almacenar en metanol durante un máximo de 2 días para la tinción dpERK. Almacenamiento durante más de 2 días y un máximo de 2 semanas es compatible con otras aplicaciones de tinción de anticuerpos, tales como anticuerpos anti-Lamin, pero no con el anticuerpo dpERK. Después de que el tiempo de incubación deseado, repetir el paso 3.7 para un total de tres veces para lavar las gónadas. No agite los tubos durante los lavados. Después del lavado final dejar 500 l de 1x PBS-T en el tubo cónico de 5 ml. Utilizando una pipeta Pasteur fresco transferir el contenido del tubo de vidrio cónico en un tubo nuevo 1 ml de vidrio (6 mm x 50 mm). Permitir que los animales disecados se asienten por gravedad 5 – 10 min. Con una pipeta Pasteur fresco y bajo un microscopio de disección, eliminar la mayor cantidad del lavado como sea posible desde el 1 ml tubos de vidrio ingenioHout perturbar las gónadas disecados. 4. Tratamiento anticuerpo primario Bloqueo y Añadir 100 ml de 30% suero de cabra normal (NGS) diluido en 1X PBS-T (véase la Tabla de Materiales) a los animales disecados en los tubos de vidrio de 1 ml. 30% NGS sirve como el tampón de bloqueo. Cubrir el tubo con Parafilm para evitar la evaporación del líquido. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h o a 4 ° C durante la noche. Después del tiempo deseado de incubación, retirar el tampón de bloqueo usando una pipeta Pasteur fresca, eliminar la mayor cantidad de líquido posible. Use un microscopio de disección para asegurar que las gónadas no se ha redactado en la pipeta Pasteur. Diluir el anticuerpo MAPKYT (véase la Tabla de Materiales, se hace referencia en este método como dpERK) a 1: 400 en 30% de NGS. Preparar la dilución de anticuerpos suficiente para utilizar 100 l por tubo. anticuerpo no utilizado, se diluyó se puede almacenar a 4 ° C durante una semana. Añadir 100 ml del anticuerpo anti-dpERK diluida tanlución de los tubos de vidrio 1 ml que contenían los animales disecados. Sellar los tubos con parafilm. Incubar los tubos a 4 ° C durante la noche. Después de la incubación durante la noche, añadir 800 l de 1x PBST a los tubos a TA. Extraer la muestra en una nueva pipeta Pasteur de vidrio y liberar suavemente para asegurar que las gónadas se suspenden uniformemente en el 1x PBS-T. Deje que las gónadas depositan en el fondo con la gravedad. Eliminar el sobrenadante. Esto asegura que las gónadas disecados se lavan pero no dañados durante el proceso. Repita los pasos 4.5 a 4.6 para un total de tres lavados. No agite los tubos durante los lavados. Después del tercer lavado, asegúrese de retirar y desechar tanto sobrenadante como sea posible sin molestar a los animales disecados. Asegúrese de que una pipeta Pasteur fresca se utiliza cada vez. 5. Tratamiento anticuerpo secundario Durante el anticuerpo primario lavados Preparar la dilución para el anticuerpo secundario. Diluir el anti-ratón seanticuerpo cundaria a escala 1: 500 en 30% de NGS. Al igual que con el anticuerpo primario, usar 100 l por tubo. anticuerpo no utilizada se puede almacenar a 4 ° C durante una semana. Añadir 100 l solución de anticuerpo secundario a los tubos de vidrio 1 ml que contenían los animales disecados. Cubrir cada tubo con Parafilm, y luego envolver los tubos en papel de aluminio para mantener el contenido del tubo en la oscuridad. Incubar los tubos a TA durante 2 h, o, alternativamente, a 4 ° C durante la noche. Después del tiempo deseado de la incubación, añadir 800 l de 1x PBS-T a los tubos y repita los pasos 4/5 a 4/6 para un total de tres veces. Después del lavado final, retirar y eliminar la mayor cantidad de sobrenadante como sea posible bajo un microscopio de disección con una pipeta Pasteur fresco. Preparar la solución de DAPI durante los lavados para el anticuerpo secundario. Diluir 1 l de DAPI (de una población de 1.000 x de 1 mg / ml se almacena a -20 ° C) in- 1 ml de 1x PBST. Añadir 800 l de la solución DAPI diluida a los tubos que contienen elanimales disecados. Cubrir la boca del tubo con Parafilm, y envolver cada tubo en papel de aluminio. Incubar a TA durante 20 min. Después de la incubación con DAPI, eliminar la mayor cantidad de la solución de DAPI como sea posible con una pipeta Pasteur fresco, bajo un microscopio de disección a fin de no molestar a los animales disecados. Añadir 1 gota de solución a los tubos de montaje. Envolver cada tubo en papel de aluminio. NOTA: Para visualizar la tinción dpERK, gónadas teñidas se debe montar para microscopía inmediatamente. Para otras aplicaciones de anticuerpos tales como serina fosforilada 10 Histona H3, las gónadas se pueden mantener en medios de montaje para un máximo de 2 semanas a 4 ° C en la oscuridad. 6. Montaje de diapositivas e Imagen Coloque una capa de cinta de laboratorio a lo largo, en la parte superior, de dos portaobjetos de vidrio (25 mm x 75 mm x 1 mm) como se ve en la figura 3. Coloque una limpia portaobjetos de vidrio fresco en medio de las dos diapositivas grabadas. NOTA: El espesorde la cinta ayuda a generar una almohadilla de agarosa en la diapositiva medio. Espesor de la almohadilla de agarosa es casi igual a la de la cinta, como la cinta sirve como un espaciador para la creación de la almohadilla de agarosa. Gota ~ 200 l de fundido 2% de agarosa (hecho en agua destilada) en el portaobjetos de microscopio en el medio. colocar rápidamente en un portaobjetos limpio fresco, perpendicular y en la parte superior, de la agarosa. Deje que la solidificación de agarosa (1 – 2 min). Retire el portaobjetos de microscopio superior muy suavemente, de manera que la almohadilla de agarosa no se destruye. La almohadilla de agarosa puede permanecer unida ya sea al principio o al final de la diapositiva. No importa que se deslizan la almohadilla de agarosa permanece unido a, siempre y cuando se trata de una superficie lisa de agarosa. Utilizando una pipeta Pasteur transferir los animales disecados en la almohadilla de agarosa. Eliminar cualquier exceso de líquido de la lámina usando una pipeta Pasteur bajo un microscopio de disección. El uso de un pelo de las pestañas o capilar finamente dibujada, empujar el gónadas y los intestinos de unaforma el uno del otro con el fin de difundir las gónadas a cabo en la diapositiva. Cubrir el portaobjetos de microscopio con un 24 mm x 50 mm cubreobjetos tamaño. Tener cuidado para asegurar que el cubreobjetos se baja suavemente sobre el portaobjetos con burbujas de aire mínimo que se forman entre el cubreobjetos y el portaobjetos. Almacenar a 4 ° C durante la noche en una caja de portaobjetos (una caja de portaobjetos opaco con las diapositivas acostado, cubreobjetos hacia arriba) para permitir que el exceso de líquido se evapore y las gónadas para convertirse en algo aplanada (debido al peso del cubreobjetos sobre las gónadas). El ligero aplanamiento de las gónadas permite obtener una mejor imagen de un tubo gonadal de lo contrario todo el año. Una vez montado el cubreobjetos, no para aplicar presión en la parte superior del cubreobjetos con los dedos. A menudo, esto se traduce en una distorsión de las gónadas y la pérdida de la señal dpERK. Aplanar las gónadas durante la noche sólo para imágenes más eficaz. Las diapositivas están listos para ser visto tan pronto como se montan. Para tomar imágenes inmediatamente, absorber suavementeel exceso de líquido entre el cubreobjetos y el portaobjetos de las esquinas utilizando un tejido de laboratorio limpia. Después del período durante la noche, sellar el portaobjetos y el cubreobjetos con esmalte de uñas transparente capa de acabado en las cuatro esquinas del cubreobjetos y el límite de diapositivas. El / sello de esmalte de uñas cubreobjetos asegura que el cubreobjetos no se mueve mientras que las imágenes y protege contra la destrucción de las muestras. Imagen de las gónadas con un microscopio compuesto a 63X. Sin embargo la lente del objetivo y el microscopio se pueden variar en base a la disponibilidad de microscopios y aplicación de usuario. Debido a que el tamaño de toda la gónada de la región proliferativa a los ovocitos es más grande que puede ser capturado en una imagen, las imágenes se toman como un montaje con los límites superpuestas como se muestra en la Figura 4. 11-14, 18. En muchos casos, editar el canal, después de la proyección de imagen final y ensamblaje, siempre y cuando no hay alteraciones importantes están hechos a la imagen de la línea germinal. tienda tél imágenes en bruto a lo largo de la imagen montada para permitir la comparación del "antes" de montaje / edición y "después" de montaje / edición de las imágenes. NOTA: Las imágenes de microscopía no deben ser alteradas para la fuerza de la señal o la saturación durante el montaje del montaje.