Ruimtelijke en temporele analyse van Active ERK in de<em> C. elegans</em> Kiembaan

De hier beschreven protocol is primair voor het invertebrate modelsysteem C. elegans, en volgt de ethische richtlijnen uiteengezet door de instelling. 1. Dierlijke Onderhoud Handhaaf C. elegans werkvoorraad culturen Nematoden groeimedium 20,21 (NGM, zie Materialen Table) agar geënt met E. coli OP50. Handhaaf worm voorraden bij temperaturen tussen 16 ° C en 25 ° C. LET OP: Het kweken van wormen bij hogere temperaturen leidt tot een snellere groei, vaak afwijkende kiembaan ontwikkeling en lagere broed maten. Daarnaast zal temperatuurgevoelige genotypes verschillende fenotypen bij verschillende temperaturen weergegeven. Transfer wormen nieuwe NGM platen elke 2-3 dagen afhankelijk van de groeisnelheid teneinde een constante toevoer van weldoorvoede wormen handhaven. LET OP: Voor elk experiment met dpERK niveaus, wormen mag NIET worden verkregen van een uitgehongerd of menigteed plaat. Verdringing of verhongering gevolgen van insuline signalering in wormen 22, en de insuline signalering reguleert ERK 12 activiteit. Zo wormen uit uitgehongerd of overvol platen zal resulteren in variabele en moeilijk te reproduceren kleurpatronen. 2. Dissectie van volwassen wormen voor het verkrijgen van Gonads Pick 100-150 WT (N2) of gewenste genotype wormen op de gewenste en specifieke ontwikkelingsfase (L1, L2, L3, L4, volwassen, enz.) In 100 pl M9 buffer in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Vul het microcentrifugebuis met 900 ul van M9 buffer (zie Materials tabel). Centrifugeer de buizen bij 1000 xg in een microcentrifuge gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur. Verwijder voorzichtig 900 pi van de M9 buffer en gooi. Verwijder de buffer onder een dissectie microscoop zodat de wormen niet per ongeluk verwijderd. Herhaal stap 2,2-2,3 nog tweemaal met verse buffer M9 telkens.Dit zorgt ervoor dat alle bacteriën die over met de wormen werden uitgevoerd effectief weg te worden gewassen. Na de laatste wasbeurt te verwijderen 900 pi van M9 buffer uit de tube en gooi. Breng de resterende 100 pi M9 buffer die de 100-150 wormen met een 200 ul-micropipet tip om een ​​vlakke bodem glazen horloge schotel. Zorg ervoor dat de micropipet tip aan de 10 pi markering wordt gesneden voor gebruik. Niet snijden van de tip zal resulteren in afschuiving van de wormen. Voeg 1-3 pi van 0,1 M levamisool de glazen schaaltje met het horloge wormen in M9 buffer. Zwenk de levamisol en de M9 om zelfs in staat te mengen totdat de wormen stoppen met bewegen. OPMERKING: Levamisole bestanden kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C voor langdurige opslag. Hier gebruikt de hogere concentratie van 1-3 mM dan wat in de literatuur 23 beschreven van 0,2 – 0,25 mM levamisool om snel verlies van mobiliteit in de dieren te verkrijgen. Als de dieren villen rond voor te long in de vloeibare suspensie, de resulterende patronen van dpERK in de gonaden kan variabel zijn (vanwege stress of gebrek aan voeding of beide). Meer reproduceerbare kleurpatronen zijn verkregen met 1-3 mM levamisol voor dissectie. Bevestig twee 25 G naalden twee 1 ml spuiten (de grootte van de spuit niet uit de meter van de naald kritisch). Punt een spuit in elke hand (figuur 2). Onder een dissectiemicroscoop gepositioneerd, naald onder en over elkaar worm zoals weergegeven in figuur 2 en plaats een shag op de worm nabij de tweede pharyngeal lamp in een schaar-achtige beweging. Na een verlaging van de worm door naar het volgende dier totdat alle dieren in de schaal ten minste eenmaal gesneden. LET OP: Wees bewust dat de stappen 2,8-2,9 zijn tijd gevoelig. Ontleden alle wormen in de schaal in minder dan vijf minuten voor een reproduceerbare dpERK patroon. Langere tijden dissectie resulteert in een uitschakel functie van de dpERK signaal, zeker in Zéén 1. Stel het aantal wormen per ronde van dissectie (dat wil zeggen, 50 wormen versus 150), indien nodig om te verblijven in het toegewezen tijdsbestek. In het geval dat een geëxtrudeerde gonade niet zichtbaar is tijdens de dissectie, niet proberen een andere gesneden in hetzelfde dier. Meestal dat alleen afschuiving het dier niet tot extrusie van de gonade. In plaats daarvan gaan naar het volgende dier. Worms, waar de geslachtsklieren niet extruderen zal verschijnen als zodanig op de dia's die zullen worden gemaakt in hoofdstuk 6 en kan worden genegeerd tijdens de beeldvorming LET OP: Door alle van de dissectie en processtappen, is het belangrijk om in gedachten te houden dat de gonaden om het lichaam / karkas bevestigd blijven. Laat de gonaden en het lichaam uit elkaar met de naald niet dwingen. Vaak een afwijkende scheur in de gonadale weefsel in een poging om de gonaden scheiden uit het lichaam kan leiden tot valse antilichaam signaal. Het lichaam / karkas kan worden genegeerd tijdens de beeldvormende stappen (hoofdstuk 6), en alleen de gonade afgebeeld. Daarnaast sometimes de darmcellen kan ook dienen als controles / somatische controles voor de antilichamen worden getest. 3. Gonade Fixatie Na de dissectie is voltooid, voeg 2 ml 3% paraformaldehyde (PFA) rechtstreeks op het glazen schaaltje met het horloge 100 pi van M9 en de dieren ontleed en bedek met Parafilm. Leg de overdekte horlogeglas gerecht in een chemische dampkap. Let op: PFA is een gevaarlijk chemisch. Daarom moet het fixeren worden uitgevoerd in de zuurkast. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 min. Met behulp van een wegwerp 9 "glas Pasteur pipet voeg 3 ml 1x PBS-T (zie Materialen Table) om het horloge glazen schaal met daarin de ontleed dieren. Mix van het tekenen van de PFA-oplossing en het 1x PBS-T met de ontleed dieren in het Pasteur pipet en het vrijgeven van voorzichtig terug in het horlogeglas gerecht. niet de buizen vortex tijdens de wasbeurten. Met een fresh glas Pasteur pipet trekken de 5 ml vloeistof (die ontleed wormen, PFA en 1x PBS-T) van het horloge glazen schaal in de Pasteur pipet en breng de inhoud in een frisse 5 ml glazen conische buis. Centrifugeer de conische buizen van 30 seconden in een klinische centrifuge bij 1000 x g. Gebruik glas Pasteur pipetten en conische buizen als ontleed geslachtsklieren vasthouden aan plastic. Verwijder de bovenstaande vloeistof zorg om te voorkomen dat de ontleed dieren verstoren. Verwijder de vloeistof na elke wasbeurt van de conische buis onder een stereomicroscoop om te voorkomen dat de gonaden ontleed beïnvloeden en hun minimaliseren. Met eenzelfde Pasteur pipet 5 ml 1x PBS-T om de conische buizen. Centrifugeer de conische buizen in een klinische centrifuge gedurende 30 seconden bij 1000 x g. Verwijder de bovenstaande vloeistof zorg om te voorkomen dat de ontleed dieren verstoren. Herhaal stap 3,7 voor een totaal van drie keer. Met behulp van een verse Pasteur pipet, voeg 2 ml van 100%methanol aan de buizen en meng de gonaden met methanol door het opstellen in de Pasteur pipet. Incubeer de buis bij -20 ° C gedurende ten minste 1 uur. OPMERKING: ontlede gonaden kan worden opgeslagen in methanol tot 2 dagen dpERK kleuring. Opslaan ervan gedurende 2 dagen tot 2 weken is compatibel met andere antilichaamkleuring toepassingen, zoals anti-Lamin antilichaam, maar niet met de dpERK antilichaam. Na de gewenste incubatietijd Herhaal stap 3,7 voor een totaal van drie keer teneinde de gonaden wassen. Laat de buizen niet vortex tijdens de wasbeurten. Na de laatste wasbeurt te verlaten 500 ul van 1x PBS-T in de 5 ml conische buis. Met eenzelfde Pasteur pipet breng de inhoud van de conische glazen buis in een vers 1 mL glazen buis (6 mm x 50 mm). Laat de ontleed dieren om zich te vestigen door de zwaartekracht voor 5-10 min. Met eenzelfde pasteurpipet en onder een stereomicroscoop, verwijder zoveel van de was mogelijk van de 1 ml glasbuizen without verstoren van de ontleed geslachtsklieren. 4. blokkeren en Primary Antibody Treatment Voeg 100 ul van 30% Normaal Geit Serum (NGS) verdund in 1 x PBS-T (zie Materialen tabel) aan de dieren ontleed in 1 ml glazen buizen. 30% NGS dient als blokkerende buffer. Bedek de buis met Parafilm om verdamping van de vloeistof te voorkomen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur of bij 4 ° C overnacht. Na de gewenste incubatietijd, verwijder de blokkerende buffer met eenzelfde Pasteur pipet verwijderd zoveel vloeistof mogelijk. Gebruik een dissectiemicroscoop zodat gonaden niet in de Pasteur pipet getrokken. Verdun de MAPKYT antilichaam (zie Materialen Table, in deze methode aangeduid als dpERK) op 1: 400 in 30% NGS. Bereid genoeg antilichaam verdunning tot 100 ul gebruiken per buis. Ongebruikte verdund antilichaam kan een week bewaard bij 4 ° C. Voeg 100 ul van de verdunde anti-dpERK antilichaam zolutie tot 1 ml glazen buisjes die de dieren ontleed. Sluit de buizen met Parafilm. Incubeer de buizen bij 4 ° C overnacht. Na overnacht incubatie voeg 800 ul PBST 1x aan de buizen bij kamertemperatuur. Neem het monster in vers glazen Pasteur pipet en laat langzaam zodat de gonaden gelijkmatig gesuspendeerd in 1 x PBS-T. Laat de gonaden naar de bodem met de zwaartekracht. Verwijder het supernatant. Dit zorgt ervoor dat de gonaden ontleed worden gewassen maar tijdens het proces niet beschadigd. Herhaal stap 4,5-4,6 voor een totaal van drie wassingen. Laat de buizen niet vortex tijdens de wasbeurten. Na de derde wasbeurt er zeker van te verwijderen en gooi zoveel supernatant mogelijk zonder verstoring van de ontleed dieren. Zorg ervoor dat een nieuwe Pasteur pipet wordt gebruikt per keer. 5. secundair antilichaam Behandeling Tijdens het primaire antilichaam wast bereiden verdunning van het secundaire antilichaam. Verdun de anti-muis secondary antilichaam bij 1: 500 in 30% NGS. Zoals met het primaire antilichaam, gebruikt 100 pi per buis. Ongebruikte antilichaam kan een week bewaard bij 4 ° C. Voeg 100 ul secundair antilichaamoplossing de 1 ml glazen buisjes die de dieren ontleed. Bedek elke buis met Parafilm en wikkel de tubes in aluminiumfolie om de inhoud van de buis in het donker houden. Incubeer de buizen bij kamertemperatuur gedurende 2 uur, of alternatief bij 4 ° C overnacht. Na de gewenste incubatietijd, voeg 800 ul van 1 x PBS-T om de buizen en herhaal de stappen 4,5-4,6 voor een totaal van drie keer. Na de laatste wasbeurt, verwijdert en weggooit zoveel mogelijk van de supernatant mogelijk onder een dissectiemicroscoop met eenzelfde Pasteur pipet. Bereid de DAPI oplossing tijdens het wassen voor het secundaire antilichaam. Verdun 1 ui DAPI (1000x uit een voorraad van 1 mg / ml bewaard bij -20 ° C) in- 1 ml 1x PBST. Voeg 800 ul van de verdunde DAPI oplossing van de buizen die deontleed dieren. Bedek de mond van de buis met Parafilm, en wikkel elke buis in aluminiumfolie. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min. Na de incubatie met DAPI, verwijder zoveel van de DAPI oplossing mogelijk met een verse Pasteur pipet, onder een stereomicroscoop om te voorkomen dat de dieren ontleed verstoren. Voeg 1 druppel bevestigingsoplossing op de buizen. Wikkel elke buis in aluminiumfolie. LET OP: Voor het visualiseren dpERK kleuring, gekleurd geslachtsklieren onmiddellijk te worden gemonteerd voor microscopie. Voor andere toepassingen antilichaam zoals gefosforyleerde serine 10 histon H3, kan gonaden in fixeermiddelen voor maximaal 2 weken bij 4 ° C in het donker bewaard. 6. Montage Slides en Imaging Leg een laag lab tape lengte bovenop, twee glazen microscoopglaasjes (25 mm x 75 mm x 1 mm) zoals getoond in figuur 3. Zet een nieuwe schone microscoopglaasje tussen de twee schuiven geplakt. LET OP: De diktevan de tape helpt bij het genereren van een agarose pad op de middelste dia. Dikte van de agarose pad is bijna gelijk aan die van de band, de band dient als een afstandhouder voor het maken van de agarose pad. Drop ~ 200 pi van gesmolten 2% agarose (gemaakt in gedestilleerd water) op de microscoop dia in het midden. Plaats snel een frisse schone glijbaan, loodrecht op en op de top, van de agar. Laat de agarose stollen (1-2 min). Verwijder de bovenste microscoopglaasje zeer zacht, zodat de agarose pad niet wordt vernietigd. De agarose pad kan bevestigd blijven ofwel naar boven of naar beneden glijden. Het maakt niet uit welke schuif de agarose pad blijft verbonden, zolang het een glad oppervlak van agarose. Met behulp van een Pasteur pipet overdracht van de ontleed dieren op de agarose pad. Verwijder de overtollige vloeistof uit de dia met behulp van een Pasteur pipet onder een dissectie microscoop. Met behulp van een wimper haren of fijn getrokken capillaire, duw de geslachtsklieren en darmen eenweg van elkaar om de gonaden spreiden op de dia. Bedek de microscoop dia met een 24 mm x 50 mm groot dekglaasje. Let erop dat het dekglaasje langzaam wordt neergelaten op de dia met minimale luchtbellen gevormd tussen het dekglaasje en de dia. Bewaren bij 4 ° C overnacht in een schuifkast (een ondoorzichtige schuifkast de glijbanen plat, tot dekglaasje) zodat overtollige vloeistof verdampen en gonaden enigszins afgevlakt worden (door het gewicht van het dekglaasje op de gonaden). De lichte afvlakking van de gonaden maakt een betere beeldvorming van een anders door gonadale buis. Zodra het dekglaasje aangebracht, niet te druk op de bovenkant van het dekglaasje met vingers. Vaak leidt dit tot verstoring van de geslachtsklieren en het verlies van de dpERK signaal. Vlak de geslachtsklieren alleen nacht voor een effectievere beeldvorming. De dia's zijn klaar om zodra ze worden geassembleerd worden bekeken. Als u afbeeldingen onmiddellijk voorzichtig te absorberende overtollige vloeistof tussen het dekglaasje en de dia uit de hoeken met een schone lab weefsel. Na de nachtelijke periode, verzegeling van de glijbaan en dekglaasje met transparante nagellak topcoat op de vier hoeken van het dekglaasje en de dia grens. De nagellak / dekglaasje afdichting zorgt ervoor dat het dekglaasje niet beweegt tijdens beeldvorming en beschermt tegen beschadiging van de monsters. Beeld de gonaden met een samengestelde microscoop bij 63x. Maar de objectieflens en microscoop kunnen worden gevarieerd op basis van de beschikbaarheid van microscopen en gebruikerstoepassing. Vanwege de grootte van het gehele gonade van de proliferatieve regio oöcyten groter dan kan worden opgevangen in een beeld, worden de beelden die als montage met overlappende grenzen zoals getoond in figuur 4. 11-14, 18. In veel gevallen, bewerk het karkas na de laatste imaging en assemblage, zolang er geen grote wijzigingen zijn aangebracht in de kiemlijn afbeelding. Store tHij ruwe beelden langs de samengestelde afbeelding om vergelijking van de 'voor' montage / editing en 'na' montage / bewerken van de foto's in te schakelen. NB: De microscopie beelden mogen niet worden gewijzigd voor de signaalsterkte of verzadiging tijdens de montage van de montage.