で活躍ERKの時空間解析<em> C。エレガンス</em>生殖細胞系列

ここで説明するプロトコルは、主に無脊椎動物モデル系Cでありますエレガンス 、そして機関が定めるすべての倫理指針に従います。 1.動物のメンテナンス C.を維持E.を接種した寒天線虫成長培地20,21（NGM、参照材料表 ）上のストック培養作業エレガンス 大腸菌 OP50。 16℃と25℃の間の温度でワームストックを維持します。 注：より速い成長速度、多くの場合、異常な生殖系列発達と下ひなサイズで、より高い温度の結果でワームを培養します。また、温度感受性遺伝子型が異なる温度で異なる表現型を表示します。 よく供給されたワームの一定の供給を維持するように、その成長率に応じて3日 – すべての2新NGMプレートにワームを転送します。 注：dpERKレベルを含む任意の実験のために、虫が飢餓や群衆の中から得られるべきではありませんエドプレート。混雑や飢餓の影響インスリンは、ワーム22におけるシグナリング、およびインスリンシグナル伝達は、ERK 12活性を調節します。したがって、飢餓や超満員のプレートからワームは、変数と困難な再現染色パターンになります。 生殖腺を得るための成虫の2解剖 150 WT（N2）または所望の特定の発達段階でのワームの所望の遺伝子型のM9緩衝液100μL中に1.5 mLのマイクロ遠心チューブに- 100ピック（L1、L2、L3、L4、大人、 など 。）。 M9バッファー900μLでマイクロチューブを埋める（ 材料表を参照してください）。周囲温度で1分間微量1,000×gでチューブを遠心。 静かにM9バッファー900μLを除去し、廃棄します。ワームが誤って削除されないことを保証するために解剖顕微鏡下でバッファを削除してください。 各バッファ時間新鮮なM9と2.3 2回以上 – を繰り返して、2.2を繰り返します。これはワームに持ち越された任意の細菌を効果的に洗い流されることを保証します。 最終洗浄後、チューブからM9バッファー900μLを除去し、廃棄します。 平底ガラス製時計皿に200μL、マイクロピペットチップで150ワーム – 100を含む残りの100μLM9のバッファを転送します。マイクロピペットチップは、使用前に10μLマークで切断されていることを確認してください。先端を切断しないと、ワームのせん断になります。 M9バッファーでワームを含むガラスの時計皿に0.1 Mレバミゾールの3μL – 1を追加します。ゆっくりワームは移動を停止するまで混合しても有効にするためにレバミゾールとM9を旋回。 注：レバミゾールストックを長期保存のために-20℃で保存することができます。動物における移動度の急速な損失を得るために、レバミゾールの0.25mMの- 0.2の文献23に記載されているものよりも3mMの-ここでは、1のより高い濃度を使用します。動物はあまりにリットルの周りフレイ場合オング液体懸濁液に、生殖腺におけるdpERKの結果として得られるパターンは、（応力または栄養または両方の不足のために）変数にすることができます。解剖のために3mmのレバミゾール – より再現性の染色パターンは、1で達成されています。 2 1 mLのシリンジに2 25 G針を取り付け（注射器の大きさは重要ではありません、針のゲージは非常に重要です）。それぞれの手で1位のシリンジ（ 図2）。 図2に示すように、解剖顕微鏡下で、下で各ワーム上で各針を置き、はさみのような動きで二咽頭電球の近くにワームに細かいカットを配置します。シャーレ内のすべての動物が少なくとも1回切断されるまで、ワームで1カットした後、次の動物に移動します。 注：手順2.8ことを注意して – 2.9時間に敏感です。再現性のdpERKパターンのための5分の下に皿の中のすべてのワームを解剖。長い解剖時間が特にZで、dpERK信号のオフにすることになります1 1.割り当てられた時間枠内にとどまることを解剖（ すなわち 、50ワーム対 150）、必要に応じてのラウンドあたりのワームの数を調整します。 場合に押し出された生殖腺は、解剖時に表示されていない、同じ動物内の別のカットを行わないでください。通常、それは唯一の動物を剪断し、生殖腺の押し出しにはなりません。代わりに、次の動物に移動します。生殖腺が押し出していないワームは、セクション6に説明すると、撮影時に無視することができ、スライド上のような表示されます。 注：解剖および処理工程の全てを通じ、それは生殖腺が体/カーカスに付着したままになります念頭に置くことが重要です。生殖腺と離れて針で体を強制しないでください。体から生殖腺を切断しようとする試みで、しばしば生殖腺組織における異常な涙は、スプリアス抗体シグナルをもたらすことができます。ボディ/カーカスは、撮像ステップ（セクション6）の間に無視することができ、かつ唯一の生殖腺を画像化しました。さらに、ソム腸の細胞は、抗体のための内部統制/体細胞のコントロールがアッセイされるとしての役割を果たすことができるetimes。 3.生殖腺固定解剖が完了した後、M9の100μLを含むガラス時計皿や解剖動物に直接、3％パラホルムアルデヒド（PFA）の2ミリリットルを追加し、パラフィルムでカバーしています。化学ヒュームフードで覆われた時計ガラス皿を置きます。 注意：PFAは、危険な化学物質です。従って、固定は、化学ヒュームフード内で行われるべきです。 室温で10分間インキュベートします。 使い捨て9「ガラスパスツールピペットを使用して、解剖した動物を含む時計ガラス皿に3 mLの1×PBS-T（参照材料表 ）を追加します。ミックスをパスツールに解剖動物とPFA溶液および1×PBS-Tを描くことによってピペットとバック時計ガラス皿に静かに放出される。洗浄の間にチューブをボルテックスしないでください。 FREを使用しましたshのガラスパスツールピペットは、パスツールピペットに時計ガラス皿から液体の5mLの（解剖ワームを含む、PFAおよび1×PBS-T）を描画し、新鮮な5mLのガラス製コニカルチューブに内容を転送します。 遠心分離機千×gでの臨床遠心分離機で30秒間コニカルチューブ。解剖生殖腺がプラスチックに固執するように、ガラスパスツールピペットとコニカルチューブを使用してください。 解剖の動物を邪魔しないように注意しながら、上清を除去し、廃棄します。解剖生殖腺に影響を与えないように、解剖顕微鏡下での円錐管から各洗浄後に液体を削除し、その損失を最小限に抑えます。 新鮮なパスツールピペットを使用して、コニカルチューブに1×PBS-Tの5 mLを加え。遠心分離機千x gで30秒のための臨床遠心分離機で円錐管。解剖の動物を邪魔しないように注意しながら、上清を除去し、廃棄します。 3回の合計を繰り返し手順3.7。 新たなパスツールピペットを使用して、100％の2 mLを加えチューブにメタノール、ゆっくりパスツールピペットに引き上げることにより、メタノールで生殖腺を混ぜます。最低1時間-20℃でチューブをインキュベートします。 注：解剖生殖腺はdpERK染色の場合は最大2日間メタノール中で保存することができます。以上の2日間、2週間までのストレージはなく、dpERK抗体と、抗ラミン抗体などの他の抗体染色のアプリケーションと互換性があります。 希望のインキュベーション時間の後、生殖腺を洗浄するために3回の合計のためのステップ3.7を繰り返します。洗浄液中にチューブをボルテックスしないでください。最終洗浄後5 mLコニカルチューブに1×PBS-Tの500μLを残します。 新たなパスツールピペットを使用して新鮮な1mLのガラス管（×50から6mm mm）の中に円錐形のガラス管の内容物を移します。 10分 – 解剖動物は5のために、重力によって解決することができます。 新鮮なパスツールピペットを使用し、解剖顕微鏡下で、1 mLのガラス管のウィットから可能な洗浄の限りを削除解剖生殖腺を乱すハウト。 4.ブロッキングと一次抗体治療 1 mLのガラスチューブ内の解剖動物に1×PBS-Tで希釈した30％正常ヤギ血清（NGS）（ 材料表を参照）の100μLを加えます。 30％NGSは、ブロッキングバッファーとして機能します。液体の蒸発を回避するために、パラフィルムでチューブをカバーしています。 1時間または4℃で一晩室温でインキュベートします。 インキュベーションの所望の期間が経過した後、できるだけ多くの液体を除去、新鮮なパスツールピペットを用いてブロッキング緩衝液を除去します。生殖腺をパスツールピペットでアップ描かれていないことを確認するために解剖顕微鏡を使用してください。 30％NGSで400：1で（dpERKとして、この方法で参照される材料の表を参照してください）MAPKYT抗体を希釈します。チューブあたり100μLを使用するのに十分な抗体希釈を準備します。未使用の、希釈した抗体は、週に4℃で保存することができます。 そのように希釈した抗dpERK抗体の100μLを追加解剖した動物を含む1mLのガラス管にリューション。パラフィルムでチューブを密封します。 4°Cで一晩チューブをインキュベートします。 一晩インキュベーションした後、室温で試験管に1×PBSTの800μLを追加します。 新鮮なガラスパスツールピペットでサンプルを描画し、生殖腺が均等に1×PBS-T中に懸濁されることを保証するためにそっと放し。生殖腺が重力で底に沈殿してみましょう。上清を取り除きます。これは、解剖生殖腺を洗浄したが、プロセス中に損傷されないようにします。 合計3回の洗浄のための4.6 – を繰り返して、4.5を繰り返します。洗浄液中にチューブをボルテックスしないでください。 3回目の洗浄後解剖動物を乱すことなく、できるだけ多くの上清を除去し、廃棄してください。新鮮なパスツールピペットを毎回使用されていることを確認してください。 5.二次抗体治療一次抗体の間、洗浄は二次抗体のための希釈液を準備します。抗マウスSEを希釈1でcondary抗体：30％NGSで500。一次抗体と同様に、チューブあたり100μLを使用します。未使用の抗体は、週に4℃で保存することができます。 解剖の動物を含む1 mLのガラス管に100μLの二次抗体溶液を追加します。パラフィルムで各チューブをカバーし、その後、暗闇の中で、管の内容物を維持するためにアルミホイルでチューブを包みます。 2時間、室温で管をインキュベートし、あるいは4℃で一晩。 インキュベーションの所望の期間が経過した後、チューブに1×PBS-Tの800μLを追加し、繰り返しは4.5手順 – 3回の合計4.6。最終洗浄後、新鮮なパスツールピペットを用いて、解剖顕微鏡下で可能な限り上清をできるだけ多く除去し、廃棄します。 二次抗体のための洗浄中にDAPI溶液を調製します。 1×PBST 1mLのIN-（-20℃で保存の1mg / mLのの1,000倍ストックから）DAPIの1μLに希釈します。 含有するチューブに希釈したDAPI溶液を800μLを追加解剖した動物。パラフィルムでチューブの口を覆い、アルミ箔で各チューブを包みます。 RTで20分間インキュベートします。 解剖の動物を邪魔しないように、DAPIとのインキュベーションの後、解剖顕微鏡下で、新鮮なパスツールピペットでできるだけDAPIソリューションの多くを削除します。 チューブに取り付け、溶液の1滴を追加します。アルミ箔で各チューブを包みます。 注：dpERK染色を可視化するために、染色された生殖腺は直ちに顕微鏡検査のためにマウントする必要があります。このようなリン酸化セリン10ヒストンH3などの他の抗体の用途については、生殖腺は、暗所で4℃で最大2週間、培地を取り付けるに保つことができます。 6.スライドとイメージングの組み立て 図3に見られるように、2つのガラス顕微鏡スライド（25ミリメートル×75ミリメートル×1ミリメートル）の、上に、長さ方向ラボテープの層を配置します。2テーピングスライド間で新鮮なクリーンなガラス顕微鏡スライドを置きます。 注：厚さテープの真ん中のスライド上のアガロースパッドを生成するのに役立ちます。テープは、アガロースパッドを作成するためのスペーサとして機能するようにアガロースパッドの厚さは、テープとほぼ同等です。 途中で顕微鏡スライド上にドロップ溶融した2％アガロースの〜200μL（蒸留水で作られました）。迅速アガロース、に垂直な上に、新鮮なきれいなスライドを配置します。 （ – 2分1）アガロースが固化してみましょう。 アガロースパッドが破壊されないように、非常に軽くトップ顕微鏡スライドを削除します。アガロースパッドは、上下どちらのスライドに付着したまますることができます。アガロースパッドは限りそれはアガロースの滑らかな表面であるように付着したままスライドしている問題ではありません。 パスツールピペットを使用してアガロースのパッド上に解剖した動物を移します。解剖顕微鏡下でパスツールピペットを用いてスライドから余分な液体を除去します。 まつげの毛または細かく描かれたキャピラリーを用いて、生殖腺と腸Aをプッシュスライド上に生殖腺を広げるために、互いに方法。 24ミリメートル×50mmのサイズのカバーガラスと顕微鏡スライドをカバーしています。カバースリップをカバースリップとスライドの間に形成されている最小の気泡でスライド上に静かに下げられることを保証するために注意してください。 過剰な液体が蒸発すると、生殖腺が（による生殖腺に対するカバーガラスの重量に）やや偏平になることを可能にするスライドボックス中で一晩4℃で保存（平らにスライドを使って、不透明なスライドボックス、アップカバースリップ）。生殖腺のわずかな平坦化は、そうでなければ、ラウンド性腺管の優れたイメージングを可能にします。 カバーガラスがマウントされると、指でカバースリップの上部に圧力を適用しません。多くの場合、これは生殖腺とdpERK信号の損失の歪みが生じます。 唯一のより効果的なイメージングのために一晩生殖腺を平らに。スライドは、すぐに彼らが組み立てられていると見ることができる状態になります。すぐに画像を撮るために、穏やかに吸収カバーガラスとクリーンラボ組織を使用して、コーナーからのスライドの間に過剰な液体。 一晩の期間の後、カバースリップとスライド境界の四隅に透明なマニキュアトップコート付きスライドとカバーガラスをシール。マニキュア/カバースリップシールはカバーガラスは、撮像しながら移動していないことを保証し、サンプルの破壊から保護します。 画像63Xでの化合物の顕微鏡による生殖腺。しかし、対物レンズと顕微鏡は顕微鏡やユーザアプリケーションの可用性に基づいて変化させることができます。卵母細胞の増殖領域から全体の生殖腺の大きさが一つの画像内に捕捉することができるよりも大きいので、 図4。11-14、18に示すように 、画像が重複する境界とモンタージュとして取られます。 多くの場合、限りは大きな変化は、生殖細胞系列の画像に行われないように、最終的なイメージングおよび組立後に死体を編集します。ストアトン「前」組立/編集や画像の組立/編集」の後」の比較を可能にするために組み立てられた画像に沿って彼の生の画像。 注：顕微鏡画像は、モンタージュの組み立て中に信号強度または飽和に変更することはできません。