Analyse spatiale et temporelle d'Active ERK dans le<em> C. elegans</em> germinale

Le protocole décrit ici est surtout pour le système modèle invertébré C. elegans, et suit toutes les règles éthiques fixées par l'institution. 1. Entretien des animaux Maintenir C. elegans travail cultures mères sur nématode croissance moyenne 20,21 (NGM, voir Matériaux Table) gélose ensemencée avec E. coli OP50. Maintenir les stocks de vis sans fin à des températures entre 16 ° C et 25 ° C. NOTE: La culture des vers à des résultats plus élevés des températures dans le taux de croissance plus rapide, souvent, le développement de la lignée germinale aberrante et taille des couvées inférieurs. En outre, les génotypes sensibles à la température affichent des phénotypes différents à différentes températures. Transfert vers de nouvelles plaques NGM tous les 2 – 3 jours en fonction de leur taux de croissance de manière à maintenir un approvisionnement constant de vers bien nourris. NOTE: Pour toute expérience donnée impliquant des niveaux dpERK, les vers ne doivent PAS être obtenus à partir d'un mort de faim ou de fouleplaque ed. Surpeuplement ou impacts de famine signalisation de l' insuline dans les vers 22 et signalisation de l' insuline régule ERK 12 activité. Ainsi les vers de plaques affamés ou surpeuplés se traduira par des motifs de coloration variables et difficiles à reproduire. 2. Dissection des adultes Worms pour l'obtention gonades Choisir 100-150 WT (N2) ou le génotype désiré de vers au stade de développement souhaité et spécifique (L1, L2, L3, L4, adultes, etc.) Dans 100 pi de tampon M9 dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Remplissez le tube de microcentrifugation avec 900 ul de tampon M9 (voir le tableau Matériaux). Centrifuger les tubes à 1 000 x g dans une microcentrifugeuse pendant 1 minute à température ambiante. Retirez délicatement 900 ul du tampon M9 et le jeter. Retirer le tampon sous un microscope à dissection pour faire en sorte que les vers soient pas accidentellement enlevés. Répétez les étapes 2.2 – 2.3 plus de deux fois avec frais M9 tampon à chaque fois.Cela garantit que toutes les bactéries qui ont été reportés avec les vers sont efficacement éliminées. Après le lavage final supprimer 900 ul de tampon M9 du tube et défausse. Transférer 100 ul de M9 tampon restant contenant les 100 – 150 vers avec une pointe de 200 pi-micropipette à un fond plat de montre en verre plat. Assurez-vous que la pointe de la micropipette est coupé à la marque de 10 pi avant utilisation. Non coupe la pointe se traduira par cisaillement des vers. Ajouter 1 – 3 pi de 0,1 M lévamisole à la boîte de montre en verre contenant les vers dans le tampon M9. Agitez doucement le lévamisole et le M9 pour permettre même mélanger jusqu'à ce que les vers cessent de bouger. NOTE: les stocks levamisole peut être stocké à -20 ° C pour le stockage à long terme. Ici, utiliser la plus forte concentration de 1 – 3 mM que ce qui a été décrit dans la littérature 23 de 0,2 – 0,25 mM de levamisole afin d'obtenir une perte rapide de la mobilité chez les animaux. Si les animaux écorchent autour de trop long dans la suspension liquide, les motifs résultant de dpERK dans les gonades peuvent être variables (à cause du stress ou le manque de nutrition ou les deux). motifs de coloration plus reproductibles ont été obtenus avec 1-3 lévamisole mM pour la dissection. Fixez les deux 25 aiguilles G à deux seringues 1 ml (la taille de la seringue n'a pas d'importance, la jauge de l'aiguille est critique). Position une seringue dans chaque main (Figure 2). Sous un microscope à dissection, positionner chaque aiguille sous et sur chaque vis sans fin comme le montre la figure 2 et placez une coupe fine sur le ver près de la deuxième ampoule pharyngée dans un mouvement de ciseaux. Après une coupe dans le ver de passer à l'animal suivant jusqu'à ce que tous les animaux dans le plat ont été coupés au moins une fois. NOTE: Soyez conscient que les étapes 02.08 à 02.09 sont sensibles au temps. Disséquer tous les vers dans le plat en moins de cinq minutes pour un motif de dpERK reproductible. De plus longs temps de dissection se traduira par une rotation hors du signal dpERK, en particulier dans Zun 1. Régler le nombre de vers par tour de dissection (c. -à- 50 vers vs. 150) si nécessaire pour rester dans le délai imparti. Dans le cas où un gonades extrudé est pas visible lors de la dissection, ne pas essayer une autre coupe dans le même animal. Habituellement, cela ne fera que cisailler l'animal et non se traduire par extrusion de la gonade. Au lieu de cela, passer à l'animal suivant. Worms où les gonades n'extruder pas apparaîtront en tant que telle sur les diapositives qui seront apportées à l'article 6 et peuvent être ignorées lors de l'imagerie NOTE: Grâce à l'ensemble de la dissection et les étapes de traitement, il est important de garder à l'esprit que la gonade restera attaché au corps / carcasse. Ne pas forcer la gonade et le corps à part avec l'aiguille. Souvent, une lacrymaux aberrante dans le tissu gonadique dans une tentative de rompre la gonade du corps peut entraîner des signaux d'anticorps parasite. Le corps / carcasse peuvent être ignorées pendant les étapes d'imagerie (section 6), et seulement la gonade imagés. En outre, sometimes les cellules intestinales peuvent également servir de témoins internes / contrôles somatiques pour l'anticorps en cours d'analyse. 3. gonades Fixation Après la dissection est terminée, ajouter 2 mL de 3% de paraformaldehyde (PFA) directement à la boîte de montre en verre contenant 100 pi de M9 et les animaux disséqués et couvrir avec Parafilm. Placer le plat recouvert de verre de montre dans une hotte chimique. Attention: PFA est un produit chimique dangereux. Ainsi, la fixation doit être réalisée dans la hotte d'aspiration chimique. Incubation à température ambiante pendant 10 min. L' utilisation d' un jetable pipette 9 "Pasteur en verre ajouter 3 ml de PBS 1x-T (voir tableau des matériaux) à la boîte de verre de montre contenant les animaux disséqués. Mix en tirant la solution PFA et 1x PBS-T avec les animaux disséqués dans le Pasteur pipette et en relâchant doucement dans le plat de verre de montre. ne pas vortex les tubes pendant les lavages. L'utilisation d'un freverre sh pipette Pasteur tirer le 5 ml de liquide (contenant des vers disséqués, PFA et 1x PBS-T) de la boîte de verre de montre dans la pipette Pasteur et transférer le contenu dans un nouveau tube mL 5 conique en verre. Centrifuger les tubes coniques de 30 secondes dans une centrifugeuse clinique à 1000 x g. Utilisez verre pipettes Pasteur et des tubes coniques comme gonades disséquées collent au plastique. Retirer et jeter le surnageant en prenant soin afin de ne pas déranger les animaux disséqués. Retirer le liquide après chaque lavage du tube conique sous un microscope de dissection afin de ne pas affecter les gonades disséquées, et minimiser leur perte. En utilisant une pipette Pasteur fraîche, ajouter 5 ml de PBS 1x-T pour les tubes coniques. Les centrifuger les tubes coniques dans une centrifugeuse clinique pendant 30 secondes à 1000 x g. Retirer et jeter le surnageant en prenant soin afin de ne pas déranger les animaux disséqués. Répétez l'étape 3.7 pour un total de trois fois. En utilisant une pipette Pasteur fraîche, ajouter 2 mL de 100%méthanol dans les tubes et mélanger doucement les gonades avec le méthanol en tirant dans la pipette Pasteur. Incuber le tube à -20 ° C pendant au moins 1 h. NOTE: Dissected gonades peuvent être stockés dans le méthanol jusqu'à 2 jours pour dpERK coloration. Stockage pendant plus de 2 jours et jusqu'à 2 semaines est compatible avec d'autres applications de coloration d'anticorps, tels que les anticorps anti-lamine, mais pas avec l'anticorps dpERK. Après le temps d'incubation désirée, répéter l'étape 3.7 pour un total de trois fois afin de se laver les gonades. Ne pas vortexer les tubes pendant les lavages. Après le lavage final laisser 500 ul de 1 x PBS-T dans le tube conique de 5 ml. À l'aide d'une pipette Pasteur fraîche transférer le contenu du tube en verre conique dans un nouveau tube 1 ml en verre (6 mm x 50 mm). Laisser les animaux disséqués à régler par gravité pendant 5 – 10 min. En utilisant une pipette Pasteur fraîche et sous un microscope de dissection, enlever autant de lavage que possible à partir du 1 mL tubes de verre without déranger les gonades disséquées. 4. Blocage et traitement Anticorps primaire Ajouter 100 pi de 30% normal sérum de chèvre (NGS) dilué dans 1x PBS-T (voir tableau des matériaux) aux animaux disséqués dans les tubes 1 ml en verre. 30% de NGS sert de tampon de blocage. Recouvrir le tube avec du Parafilm afin d'éviter l'évaporation du liquide. Incuber à température ambiante pendant 1 h ou à 4 ° C durant la nuit. Après le temps désiré d'incubation, enlever le tampon de blocage à l'aide d'une pipette Pasteur frais, enlever autant de liquide que possible. Utiliser un microscope disséquant pour veiller à ce que les gonades ne sont pas établis dans la pipette Pasteur. Diluer l'anticorps MAPKYT (voir tableau des matériaux, visée à cette méthode comme dpERK) à 1: 400 dans 30% NGS. Préparer suffisamment dilution d'anticorps à utiliser 100 pi par tube. Non utilisé, anticorps dilué peut être conservé à 4 ° C pendant une semaine. Ajouter 100 ul de l'anticorps anti-dpERK dilué de manièrerésolu- aux tubes mL 1 de verre contenant les animaux disséqués. Sceller les tubes avec Parafilm. Incuber les tubes à 4 ° C pendant une nuit. Après incubation pendant une nuit, ajouter 800 pl de 1 x PBST aux tubes à la température ambiante. Dessinez l'échantillon dans une pipette Pasteur en verre fraîche et relâchez doucement pour assurer que les gonades sont régulièrement suspendus dans le 1x PBS-T. Que les gonades se déposent au fond avec la gravité. Retirer le surnageant. Cela garantit que les gonades disséquées sont lavés mais pas endommagés pendant le processus. Répétez les étapes 04.05 à 04.06 pour un total de trois lavages. Ne pas vortexer les tubes pendant les lavages. Après le troisième lavage être sûr d'enlever et jeter autant que possible surnageant sans déranger les animaux disséqués. Assurez-vous que d'une pipette Pasteur frais est utilisé à chaque fois. 5. Traitement secondaire Anticorps Au cours de l'anticorps primaire lavages préparer la dilution de l'anticorps secondaire. Diluer l'anti-souris seanticorps condaire à 1: 500 dans 30% NGS. Comme avec l'anticorps primaire, utiliser 100 pi par tube. anticorps non utilisé peut être conservé à 4 ° C pendant une semaine. Ajouter 100 pi de solution d'anticorps secondaire aux tubes mL 1 de verre contenant les animaux disséqués. Couvrir chaque tube avec Parafilm, puis envelopper les tubes dans une feuille d'aluminium pour garder le contenu du tube dans l'obscurité. Incuber les tubes à la température ambiante pendant 2 h, ou bien à 4 ° C durant la nuit. Après la durée souhaitée de l'incubation, ajouter 800 ul de 1 x PBS-T aux tubes et répéter les étapes 04.05 à 04.06 pour un total de trois fois. Après le lavage final, enlever et jeter autant de surnageant que possible sous un microscope à dissection à l'aide d'une pipette Pasteur frais. Préparer la solution de DAPI pendant les lavages à l'anticorps secondaire. Diluer 1 pl de DAPI (à partir d'un 1,000x mère de 1 mg / mL stocké à -20 ° C) in- 1 ml de PBST 1x. Ajouter 800 ul de la solution diluée DAPI aux tubes contenant leanimaux disséqués. Couvrir la bouche du tube avec du Parafilm, et envelopper chaque tube dans une feuille d'aluminium. Incubation à température ambiante pendant 20 min. Après l'incubation avec DAPI, enlever autant de la solution DAPI que possible avec une pipette Pasteur frais, sous un microscope de dissection afin de ne pas déranger les animaux disséqués. Ajouter 1 goutte de solution pour les tubes de montage. Enveloppez chaque tube dans une feuille d'aluminium. REMARQUE: Pour visualiser dpERK coloration, les gonades colorées doit être monté pour la microscopie immédiatement. Pour d'autres applications d'anticorps tels que la serine phosphorylée 10 l'histone H3, les gonades peuvent être conservées dans un milieu de montage pendant jusqu'à 2 semaines à 4 ° C dans l'obscurité. 6. Assemblage Diapositives et imagerie Placez une couche de ruban de laboratoire de la longueur, sur le dessus, de deux lames de microscope en verre (25 mm x 75 mm x 1 mm) comme on le voit sur la figure 3. Placez un propre lame de microscope en verre frais entre les deux diapositives enregistrées. NOTE: L'épaisseurde la bande permet de générer un tampon d'agarose sur la glissière centrale. Épaisseur du tampon d'agarose est à peu près égale à celle de la bande, lorsque la bande sert d'entretoise pour créer le coussin d'agarose. ~ Goutte 200 ul de 2% d'agarose fondu (fabriqué dans l'eau distillée) sur la lame de microscope dans le milieu. Placez rapidement une lame propre et fraîche, perpendiculaire et au-dessus, de l'agarose. Laissez le Solidifier d'agarose (1 – 2 min). Retirer la lame de microscope dessus très doucement, de telle sorte que le tampon d'agarose ne soit pas détruit. Le tampon d'agarose peut rester attaché soit en haut ou en bas de la diapositive. Il n'a pas d'importance qui coulissent le pad agarose reste attaché à, tant qu'elle est une surface lisse d'agarose. En utilisant une pipette Pasteur transférer les animaux disséqués sur le tampon d'agarose. Retirer tout excès de liquide de la diapositive à l'aide d'une pipette Pasteur sous un microscope à dissection. L'utilisation d'un cheveu cils ou capillaire finement dessiné, pousser les gonades et les intestins d'unchemin d'un autre dans le but de répartir les gonades sur la diapositive. Couvrir la lame de microscope avec un 24 mm x 50 mm taille lamelle. Prenez soin de veiller à ce que la lamelle est abaissée doucement sur la lame avec des bulles d'air minimal étant formés entre la lamelle et la lame. Conserver à 4 ° C pendant la nuit dans une boîte de glissement (une boîte de glissement opaque avec les lames à plat, Coverslip up) pour permettre l'excès de liquide à évaporer et gonades pour devenir quelque peu aplatie (en raison du poids de la lamelle sur les gonades). Le léger aplatissement des gonades permet une meilleure imagerie d'un tube gonadique autrement ronde. Une fois que la lamelle est montée, ne pas exercer une pression sur la partie supérieure de la lamelle avec les doigts. Souvent, cela se traduit par une distorsion des gonades et de la perte du signal dpERK. Aplatir les gonades nuit seulement pour une imagerie plus efficace. Les lames sont prêts à être consultés dès qu'ils sont assemblés. Pour prendre des photos immédiatement, d'absorber doucementl'excès de liquide entre la lamelle et la lame à partir des coins à l'aide d'un tissu de laboratoire propre. Après la période du jour au lendemain, sceller la lame et lamelle avec du vernis transparent de finition vernis sur les quatre coins de la lamelle et la limite de la diapositive. Le joint vernis à ongles / lamelle assure que la lamelle ne bouge pas pendant l'imagerie et protège contre la destruction des échantillons. Image gonades avec un microscope composé à 63X. Cependant l'objectif et objectif de microscope peuvent varier en fonction de la disponibilité des microscopes et l'application utilisateur. Étant donné que la taille de l'ensemble de la région gonadique proliférative des ovocytes est plus grande que peut être capturé dans une image, les images sont prises comme un montage dont les limites se chevauchent comme le montre la figure 4. 11-14, 18. Dans de nombreux cas, modifier la carcasse après l'imagerie finale et l'assemblage, aussi longtemps qu'aucune des modifications importantes sont apportées à l'image germinale. Magasin til les images brutes le long de l'image assemblée pour permettre la comparaison de l' 'avant' assemblage / montage et 'après' assemblage / montage des images. REMARQUE: Les images de microscopie ne doivent pas être modifiées pour la force du signal ou de saturation lors de l'assemblage du montage.