Пространственный и временной анализ активного ERK в<em> C. Элеганс</em> Половые

Протокол , описанный здесь, в первую очередь для беспозвоночное модельной системы C. Элеганс, и соблюдает все этические принципы , изложенные в учреждении. 1. Техническое обслуживание животных Поддерживать C. Элеганс работает маточных культур на нематоде роста среды 20,21 (NGM см Материалы таблицу) агар засевали Е. OP50 палочка. Поддержание запасов червя при температуре от 16 ° C до 25 ° C. Примечание: Культивирование червей при более высоких температурах приводит к более высокими темпами роста, зачастую, развитие отклоняющегося зародышевой и нижних размеров выводка. Кроме того, чувствительные к температуре генотипы будут отображать различные фенотипы при различных температурах. Передача червей на новые планшеты NGM каждые 2 – 3 дня, в зависимости от скорости их роста так, чтобы поддерживать постоянную подачу сытых червей. ПРИМЕЧАНИЕ: Для любого данного эксперимента с участием уровней dpERK, черви НЕ должны быть получены от голода или толпыред пластины. Вытеснение или голодание воздействие инсулина сигнализации в глистов 22 и передачу сигналов инсулина регулирует ЭРК 12 деятельности. Таким образом, черви изголодавшимися или перенаселенных пластин приведет к переменным и труднодоступных воспроизведите моделей окрашивания. 2. Препарирование взрослых червей для получения гонад Pick 100 – 150 WT (N2) или желаемый генотип червей на желательные и определенной стадии развития (L1, L2, L3, L4, взрослых и т.д..) В 100 мкл буфера M9 в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Заполните микроцентрифужных пробирку с 900 мкл буфера M9 (см Материалы таблицу). Центрифуга пробирки при 1000 х г в микроцентрифуге в течение 1 мин при температуре окружающей среды. Аккуратно удалите 900 мкл буфера M9 и выбросить. Удалите буфер под рассекает микроскопом, чтобы гарантировать, что черви не случайно удалены. Повторите шаги 2.2 – 2.3 еще два раза со свежим M9 буфера каждый раз.Это гарантирует, что любые бактерии, которые были перенесены с червями эффективно смыты. После окончательной промывки удалить 900 мкл буфера M9 из трубки и отбрасывать. Передача оставшихся 100 мкл M9 буфера, содержащего 100 – 150 червей с наконечником 200 мкл-микропипетки с плоским дном стекла часов блюдо. Убедитесь в том, что кончик микропипетки разрезают на отметке 10 мкл перед использованием. Не резки наконечник приведет к стрижке червей. Добавьте 1 – 3 мкл 0,1 М левамизола к стеклу часов чашку, содержащую червей в буфер М9. Аккуратно вихревой левамизол и М9, чтобы позволить даже смешиваться, пока черви не перестанут двигаться. Примечание: Левамизол запасы можно хранить при температуре -20 ° С в течение длительного хранения. При этом используют более высокую концентрацию 1 – 3 мм , чем то , что было описано в литературе 23 0,2 – 0,25 мМ левамизола, чтобы получить быструю потерю подвижности у животных. Если животные содрать вокруг слишком лОнг в жидкой суспензии, полученные образцы dpERK в гонадах может быть переменной (из-за стресса или недостатка питания или обоих). Более воспроизводимые модели окрашивания были достигнуты с 1 – 3 мМ левамизол для рассечения. Прикрепите две иглы 25 G к двум шприцами 1 мл (размер шприца не имеет значения, датчик иглы имеет решающее значение). Позиция один шприц в каждой руке (рисунок 2). Под микроскопом рассекает, поместите каждую иглу под и над каждым червем , как показано на рисунке 2 и поместить точную резку на червя вблизи второй глоточной лампочкой в ножницам , как движение. После одного разреза в червя перейти к следующему животному, пока все животные в блюдо не были сокращены, по крайней мере один раз. Примечание: Помните, что шаги 2.8 – 2.9 являются чувствительным ко времени. Проанализируйте все червей в блюдо в возрасте до пяти минут для воспроизводимой шаблона dpERK. Более длительное время рассечение приведет к выключив сигнала dpERK, особенно в Zодин 1. Отрегулируйте количество червей на раунд рассечения (то есть 50 червей против 150) , если это необходимо , чтобы остаться в отведенный срок. В случае экструдированный гонад не виден во время вскрытия, не пытайтесь другой разрез в том же животном. Как правило, это будет только сдвигать животное и не приводят к экструзии гонады. Вместо этого перейдем к следующему животному. Черви, где гонады не экструзию будут появляться в качестве таковых на слайдах, которые будут сделаны в разделе 6 и могут быть проигнорированы во время съемки Примечание: Через все рассечение и обработки шагов, важно иметь в виду, что гонады будет оставаться прикрепленной к корпусу / каркаса. Не заставляйте гонады и тело на части с иглой. Часто аберрантный разрыв в гонадной ткани в попытке разорвать гонады из организма может привести к ложному сигналу антитела. Тело / туши можно пренебречь во время стадий обработки изображений (раздел 6), и только гонад образ. Кроме того, сомаetimes кишечные клетки могут также служить в качестве внутреннего контроля / управления соматические для антитела, подвергаемые исследованию. 3. гонад Фиксирование После того, как рассечение завершено, добавьте 2 мл 3% параформальдегида (PFA) непосредственно на стекло часов блюдо, содержащую 100 мкл M9 и рассеченных животных и накрыть парафильмом. Поместите покрытую часы стеклянную посуду в химическом вытяжном шкафу. Внимание: PFA является опасным химическим веществом. Таким образом, фиксация должна быть выполнена в химическом вытяжном шкафу. Инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин. Использование одноразового использования 9 "стекло пипетки Пастера добавить 3 мл 1x PBS-T (см Материалы таблицы) в часы стеклянную посуду , содержащую расчлененный животных. Смешать рисуя раствора PFA и 1x PBS-T с рассеченными животными в Пастера пипетку и выпуская аккуратно обратно в часы стеклянную посуду. не вихре трубки во время мытья. С помощью Freш стекло пипетки Пастера привлечь 5 мл жидкости (содержащей расчлененный червей, PFA и 1x PBS-T) из стеклянной посуде часов в пипетку Пастера и передать содержимое в 5 мл свежей стеклянной конической трубе. Центрифуга конические пробирки в течение 30 секунд в клинической центрифуге при 1000 х г. Используйте стеклянные пипетки Пастера и конические пробирки, как расчлененный яичники придерживаться пластика. Удаляют супернатант заботиться, чтобы не мешать расчлененный животных. Удалите жидкость после каждой промывки от конической трубе при рассекает микроскопом, чтобы не влиять на расчлененный гонады, и минимизировать их потери. С помощью свежей пипетки Пастера, добавляют 5 мл 1x PBS-T в конические пробирки. Центрифуга конические пробирки в клинической центрифуге в течение 30 с при 1000 об х г. Удаляют супернатант заботиться, чтобы не мешать расчлененный животных. Повторите шаг 3.7 в общей сложности три раза. Использование свежей пипетки Пастера, добавьте 2 мл 100%метанол в пробирки, и осторожно перемешать гонад с метанолом, разработав в пипетку Пастера. Инкубируйте пробирку при -20 ° С в течение как минимум 1 ч. Примечание: расчлененный гонады могут храниться в метаноле в течение до 2-х дней для dpERK окрашивания. Хранение в течение более 2-х дней и до 2-х недель, совместим с другими приложениями с использованием меченых антител, таких как анти-Lamin антителом, но не с антителом dpERK. По истечении заданного времени инкубации, повторите шаг 3.7 в общей сложности три раза для того, чтобы вымыть гонады. Не вихре трубки во время мытья. После окончательной промывки оставить 500 мкл 1X PBS-T в конической трубе 5 мл. Использование свежей пипетки Пастера переноса содержимого конической стеклянной трубки в свежий 1 мл стеклянной трубки (6 мм х 50 мм). Дайте рассеченные животных осесть под действием силы тяжести в течение 5 – 10 мин. Использование свежей пипетки Пастера и под микроскопом рассекает, удалить как можно больше стирке, насколько это возможно от 1 мл стеклянных трубок остроумияХаут тревожа расчлененный гонады. 4. Блокирование и первичное антитело Лечение Добавьте 100 мкл 30% нормальной козьей сыворотки (NGS) , разведенного в 1x PBS-T (см таблицу) Материалы к вскрытых животных в 1 мл стеклянные пробирки. 30% NGS служит в качестве блокирующего буфера. Накройте трубку парапленкой, чтобы избежать испарения жидкости. Инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч или при 4 ° С в течение ночи. По истечении заданного времени инкубации, удалите блокирующий буфер, используя свежий пипетку Пастера, удаляя столько жидкости, сколько это возможно. Используйте рассекает микроскоп, чтобы убедиться, что яичники не составлены в пипетку Пастера. Развести антитело MAPKYT (см Материалы таблицу, о которой говорится в этом методе в качестве dpERK) в соотношении 1: 400 в 30% NGS. Подготовьте достаточное количество разведения антител использовать 100 мкл на пробирку. Неиспользованный, разбавленный антитело можно хранить при температуре 4 ° С в течение недели. Добавьте 100 мкл разведенного антитела против dpERK таклюция к 1 мл стеклянные пробирки, содержащие расчлененный животных. Уплотнение трубок с парафильмом. Инкубировать пробирки при температуре 4 ° С в течение ночи. После инкубации в течение ночи, добавляют 800 мкл 1x PBST в пробирки при комнатной температуре. Draw образец в свежей стеклянной пипетки Пастера и отпустить осторожно, чтобы гарантировать, что гонады равномерно взвешенном состоянии в 1х PBS-T. Пусть гонады оседают на дно с гравитацией. Удалить супернатант. Это гарантирует, что расчлененный гонады моют, но не были повреждены во время процесса. Повторите шаги 4.5 – 4.6 в общей сложности трех стирок. Не вихре трубки во время мытья. После третьей промывки не забудьте удалить и выбросить как можно больше супернатант насколько это возможно, не нарушая расчлененный животных. Убедитесь в том, что свежие пипетки Пастера используется каждый раз. 5. Антитело Лечение Вторичный Во время первичного антитела смывки готовят разбавлением на второе антитело. Развести анти-мышиного С.Е.condary антитела в соотношении 1: 500 в 30% NGS. Как и в случае с первичным антителом, используют в количестве 100 мкл на пробирку. Неиспользованный антитела можно хранить при температуре 4 ° С в течение недели. Добавьте 100 раствор вторичного антитела мкл к 1 мл стеклянные пробирки, содержащие расчлененный животных. Накройте каждую пробирку парафильмом, а затем обернуть трубы в алюминиевую фольгу, чтобы сохранить содержимое трубки в темноте. Инкубировать пробирки при комнатной температуре в течение 2 ч, или в качестве альтернативы при 4 ° С в течение ночи. По истечении заданного времени инкубации, добавьте 800 мкл 1X PBS-T в пробирки и повторите шаги 4.5 – 4.6 в общей сложности три раза. После последней промывки, удалить и выбросить, как большая часть надосадочной жидкости, как это возможно под микроскопом рассекает с использованием свежей пипетки Пастера. Приготовьте раствор DAPI во время промывки для вторичного антитела. Развести 1 мкл DAPI (из 1,000x запаса 1 мг / мл хранили при -20 & deg; C) ин- 1 мл 1x PBST. Добавьте 800 мкл разведенного раствора DAPI в пробирки, содержащиерассеченные животных. Накройте рот трубки с Parafilm, и обернуть каждую пробирку алюминиевой фольгой. Инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин. После инкубации с DAPI, удалить как можно больше раствора DAPI, насколько это возможно со свежим пипеткой Пастера, под микроскопом рассекает так, чтобы не мешать рассеченных животных. Добавьте 1 каплю решение для монтажа к трубам. Оберните каждую пробирку алюминиевой фольгой. ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации dpERK окрашивания, окрашивали гонады должен быть установлен для микроскопии немедленно. Для других антител приложений, таких как фосфорилируется серина 10 гистона H3, гонады могут быть сохранены в СМИ для монтажа до 2-х недель при температуре 4 ° С в темноте. 6. Сборка и обработка изображений Слайды Поместите слой лаборатории ленты в продольном направлении , сверху, из двух предметные стекла микроскопа (25 мм х 75 мм х 1 мм) , как показано на рисунке 3. Поместите свежий чистый предметное стекло микроскопа между двумя заклеенными горками. Примечание: Толщиналенты помогает генерировать агарозы накладку на среднем слайде. Толщина агарозном площадки практически равна ленты, так как лента служит в качестве распорки для создания агарозном площадку. Падение ~ 200 мкл растопленным 2% агарозы (сделано в дистиллированной воде), на предметном стекле микроскопа в середине. Быстро поместить свежий чистый слайд, перпендикулярно и на вершине, из агарозы. Пусть агарозном затвердевает (1 – 2 мин). Удалить верхний стекло микроскопа очень осторожно, так, что агароза подушка не разрушается. Агарозы накладка может оставаться прикрепленной либо к верхней или нижней слайда. Не имеет значения, которые скользят агарозном подушка остается прикрепленной к, до тех пор, как она является гладкой поверхностью агарозы. С помощью пипетки Пастера перенести расчлененный животных на агарозном площадку. Удалите лишнюю жидкость из слайда с помощью пипетки Пастера под рассекает микроскопом. Использование волос ресниц или тонко нарисованный капилляр, толкать гонад и кишечникпуть друг от друга для того, чтобы распространить гонады на слайде. Покройте стекло микроскопа с покровным размером х 50 мм на 24 мм. Позаботьтесь, чтобы убедиться, что покровное осторожно опускают на слайде с минимальным воздушные пузырьки образуются между покровным и горкой. Хранить при температуре 4 ° С в течение ночи в коробке слайдов (непрозрачной слайд коробки с горок лежа, покровное вверх), чтобы избыток жидкости испаряться и гонады, чтобы стать несколько уплощена (из-за веса покровного на гонады). Небольшое уплощение гонад позволяет лучше визуализации в противном случае круглой трубы гонад. После того, как покровное монтируется, не оказывать давление на верхней части покровного с пальцами. Часто это приводит к искажению гонад и потери сигнала dpERK. Свести гонады на ночь только для более эффективной визуализации. Слайды готов к просмотру, как только они будут собраны. Для того, чтобы немедленно принять образы, мягко поглощаютизбыток жидкости между покровным и ползуна из углов с помощью чистой ткани лаборатории. После ночной период, печать слайдов и покровное с прозрачным верхним слоем лака для ногтей по четырем углам покровного и границы слайда. Лак для ногтей / покровное уплотнение гарантирует, что покровное не двигается во время визуализации и защищает от разрушения образцов. Изображение гонады с соединением микроскопа при 63x. Однако линза объектива и микроскопа можно варьировать в зависимости от наличия в микроскопах и пользовательского приложения. Поскольку размер всего гонад от пролиферативного области к ооцитов больше , чем может быть захвачено в одном изображении, изображения принимаются как монтаж с перекрывающимися границами , как показано на рисунке 4. 11-14, 18. Во многих случаях, редактировать тушу после окончательной обработки изображений и сборки, пока никаких серьезных изменений не выполнены в зародышевой изображения. магазин тон сырые изображения вдоль собранного изображения для обеспечения возможности сравнения «до» сборки / монтажа и 'после' сборки / редактирования изображений. Примечание: микроскопия изображения не должны быть изменены для силы сигнала или насыщения во время сборки монтажа.