Nano PCR ile Hayvan Örnekler Solunum Patojenler yüksek verimlilik Algılama
Summary
Nano ölçekli PCR ile DNA ve RNA bazlı patojenlerin yüksek verimlilik testi bir sendromik köpek ve at solunum PCR panelini kullanarak tarif edilir.
Abstract
Nanoliter ölçekli real-time PCR birden deneyleri birbirine tepkileri birleştiren tipik dezavantajları olmadan tek plaka üzerinde paralel çalışmasına izin vermek için mekansal çoğullama kullanır. Biz tasarlanmış ve hızla akut solunum yolu hastalığı olan köpek ve atlarda yaygın bir hastalıktır ajanların varlığını belirlemek için bu ilkeye dayanan bir panel değerlendirdi. Bu yazıda mikrolitre ölçekli reaksiyonlar farklı prosedürler odaklanarak, örnek hazırlama, yükseltme ve hedef patojen dizilerin analizi için bir nano ölçekli teşhissel PCR akışını tarif eder. sunulan solunum panelinde, 18 deneyleri her plaka başına 48 numuneye kapasiteli, üç nüsha olarak kuruldu. Evrensel bir ekstre ve ön amplifikasyon akışı çok matrisler ve DNA ve RNA göre patojenleri karşılamak için yüksek verimli örneği hazırlanması için optimize edilmiştir. Temsilcisi veri bir RNA hedefinin (influenza A matrisi) ve bir DNA hedefe (at herpes virüsü sunulmuştur1). hızlı ve doğru patojen kapsamlı, sendrom tabanlı grup için test etme yeteneği verimlilik ve tanısal testlerin ergonomisini geliştirmek için ve akut solunum hastalığı tanı ve tedavisi için değerli bir araçtır.
Introduction
Tek bir hastalık için test edilen örneklerin büyük sayılar için kullanılan sürece insanlar ve hayvanlar için klinik teşhis birden ajanların hızlı ve kapsamlı tespiti için talebin, patojen tespiti için tek organizma moleküler tanı yöntemleri külfetli bulunmaktadır. Veteriner bağlamda, yüksek verimli teşhis yöntemleri nedeniyle türlerin çeşitli patojenleri kapsayan ek ihtiyaca özellikle önemlidir. bakteri sayısını içerir test ihtiyaçları örnekleridir OneHealth gıda kaynaklı hastalığın tedavisi ve ortaya çıkan bir patojen gözetim yaklaşımlar, virüsler (DNA ya da RNA bazlı), parazit ve mantar. test verimliliğini artırmak amacıyla birlikte birden fazla analitlerin (çoğullama) testleri birleştirerek meydan duyarlılık olası bir kayıp ve optimizasyon ve tahliller onaylanması için büyük bir yüktür.
Nanoliter ölçekli gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) bir alter olduğunubirçok ayrı reaksiyonlar aynı örnek 1 üzerinde aynı anda çalışmasına olanak sağlayan çoğullama uygulamasına yerli. OpenArray platformu bu ilkenin 2 bir uygulamadır; gerçek zamanlı PCR ile mikroarray teknolojisini birleştiriyor. mekansal çoğullama kavramına göre, her örnekten geçiş delikleri farklı hedeflerin çok sayıda test edilir. Bu platform, başlangıçta cyanine tabanlı çift sarmallı DNA bağlayıcı kimya 2 ile kullanılabilir ve karanlık söndürme sondalar 3 kullanılarak prob tabanlı kimya için kullanılabilir oldu. Bu platform, esas olarak, insanlarda ve hayvanlarda 4 5 genetik profil oluşturma için kullanılmıştır. Bu en son Grigorenko ve diğerleri tarafından kan yoluyla DNA ve RNA patojenleri tespit etmek için adapte edilmiştir. Şekil 6, iki aşamalı bir ters transkripsiyon / ön amplifikasyon (pre-amp) prosedürü kullanılarak.
Bu, solunum sn patojen her iki tip tespit için tek aşamalı bir preamplifikatör tabanlı bir prosedür tarifretions ve standart bir iş günü tamamen gerçekleştirilebilir diğer numune türleri çeşitli. tek-aşamalı preamplifikatörün tamamlanmasından sonra, numuneler bu nano PCR platform ile birlikte otomatik bir sıvı taşıma sistemi tarafından kabul biçimi olan bir 384 gözlü plakaya aktarılır. Sistem aynı anda en fazla 4 plakaları (192 numuneleri ve kontrolleri) yüzeyi boyunca ana karışımı ve örnek çizer. Bu yükleme işlemi takiben, numuneler yükseltilir ve basılan tek bir sayfaya sığan bir tablodaki her numune / hedef kombinasyonu için 3 teknik çoğaltır ortalamasını özetleyen bir makro tablo kullanarak nasıl analiz edildiği açıklanmaktadır.
Bu platformu kullanarak örneklerinden çıkarılan DNA ve / veya RNA analiz etmek için bir tek tip bir yöntem kurulmuştur. numune çok çeşitli ekstre ters transkribe ve olası hataları en aza indirmek, 96 oyuklu bir formatta önceden amplifiye edilmiştir. Test Solunum örnekleri nazal bezlerden, derin farengeal bezlerden dahil,Trans-trakeal yıkar, bronkoalveoler lavaj ve akciğer dokusu. Ayrıca, periferal kan ya da dışkıların mevcut olabilir test maddelerinin bazıları için, biz prosedürü Alınan numunelerin bu tür dahil. Bu aerodinamik iş akışı bireysel test yerine panel tabanlı patojen ve toksin geni tespiti yoluyla verimli test sağlayarak birden fazla plakalar deneyler çalışan kıyasla zaman ve kaynak tasarrufu sağlar. Burada gösterilen solunum paneli 18 deneyleri her plaka başına 48 numuneye kadar uzlaşmacı,-deliklerden üç nüsha olarak basılan vardı. Tespit at patojenler at adenovirüs 1 ve 2, at arterit virüsü, at rinit virüsü A ve B, at herpes virüsü (EHV) tip 1 ve tip 4 ve Streptococcus equi dahildir. Köpek patojenler köpek solunum koronavirüsünün (betacoronavirus), köpek distemper virüsü, Kanin adenovirüs, Kanin parainfluenza virüsü, köpek Pneumovirus, Bordetella bronchiseptica, ve Mycoplasma cynos dahildir. birEvrensel İnfluenza A tahlil ve iç kontrol (MS2 RNA faj) da dahil edildi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu prosedür, altı aylık (hafta 2-3 kez) boyunca laboratuarda solunum patojenlerinin rutin test için kullanılmıştır. Biz de bir ayrı özelleştirilmiş plaka üzerinde dışkı örnekleri ve bakteriyel izolatların enterik patojen profil için aynı prosedürü kullanarak başarıya sahiptir. Plakalar elde edildikten sonra, deneyimli kadrosu bir standart iş günü içinde 2-7 adımları tamamlayın. en kritik adımlar preamp plakasının uygun sızdırmazlık, (buharlaşmayı önlemek için hızla yapılmalıdır) plakalar arasında preamplified örneklerin transferi ve amplifikasyon plakasının son kaplama vardır. büyük ölçüde bu işlem için gereken süre ve evrak miktarı azalır olarak sonuç analizi (numune ve kontroller için eğrileri kontrol) için bir rehber olarak makro-tablonun kullanımı da eleştirdi. sağlanan makro tablo bir örnektir; farklı konfigürasyonları ile plakaları için değiştirilmiş veya yeniden oluşturulmuş olması gerekir. Bu kolayca pe olabilirtemel tablo bilgisi olan birisi tarafından rformed.
Nedeniyle amplifikasyon plakasına (33 nl) üzerine yüklendi numunenin çok küçük bir miktarı ile, ön amplifikasyon gerekir. Bu protokol (gösterilmemiştir) optimizasyonunda, önceden amplifikasyon ana karışımı, rastgele primerler ilavesi döngüsü sayısı, tavlama süresi ve seyreltme içeren amplifikasyon bir dizi parametre karşılaştırıldı. Her hedef, kendi optimal koşulları vardı ve burada tarif edilen bizim panelin algılama genel klasmanda en iyi sınırını vermiştir o temsil etmektedir. Bu panel patojenik hedefler ve rutin veteriner teşhis testleri karşılaşılan örnek türleri geniş bir yelpazesini kapsayan, ancak amplifikasyon prosedürlerine değişiklikler farklı panelleri için gerekli olabilir. Üretici optimize edilmiş amplifikasyon koşulları 95 ° C ve ann denatürasyon, ardından 95 ° C enzim aktivasyonu bir 10 dakika ile standart prob-tabanlı gerçek zamanlı PCR protokolü dayanmaktadır60 ° C'de Ealing / uzatma. primerleri ve sondaları önceden basılmış aynı zamanda üretici optimize koşulları kullanarak ve bu nedenle titrasyonu gerekmez plakalar üzerinde bulunmaktadır. (Ne olursa olsun hedef Çeşidi) tüm örnekler için ters transkripsiyon ve ön amplifikasyon adımlarını birleştirerek iş akışı verimliliğini sağlamak için gerekliydi. Tüm örnekler, ters transkribe olması da duyarlılığı maksimize etmek için faydalıdır. Ayrıca, en aza indirilmesi inhibitörleri için optimize edilmiştir preamp için bir ana karışımı kullanılması, aynı plaka üzerinde farklı numune türleri birleştirerek çok yönlülük sağlar.
Hastalık Kontrol Merkezi (CDC) nanolitre ölçekli reaksiyonlar için Shu ve diğ. 7 tarafından tarif uyarlanmış grip matris deneyi için Merkezi evrensel influenza insanlar ve eşlik eden hayvanlar test örnekleri için uygun olan bir deneydir. Bu mikrolitre ölçekli rea kullanarak tüm influenza A virüsleri matris geninin evrensel tespiti için dizayn edilmiştirseksiyonlar. Bir CDC İnsan Gribi Virüsü Paneli ve CDC Domuz Gribi Panel parçası olarak tüm dünyada kullanılmaktadır. Burada uyarlanmış EHV- 1 tahlil 8 kürtaj ve nörolojik hastalığı (Pusterla ve Hussey 10 tarafından gözden) neden olabilir atların önemli bir solunum patojeni algılar. Bir türün bağımsız iç kontrol ile yüksek verimli bir platforma, bu testler adapte önemi bir OneHealth gözetim yaklaşım dahil edilebilmesidir. yüksek verimli bir test platformu bu tahlillerin her ikisine birden sahip klinik tesisleri, barınaklar ve performans etkinlikleri için acil durum hazırlık kolaylaştıracaktır.
Yukarıda tarif edilen sonuçlar, analitik performansı önemli ölçüde daha fazla varyasyon gösterdi Mycoplasma cynos hariç, plaka üzerinde, tüm hedeflerin temsil etmektedir. Bu durum, ideal bir 58-60 ve olmalıdır primerlerin optimal erime sıcaklığına (Tm), muhtemel olduğunu# 176; C (ideal bir prob Tm 68-70 ° C). Bu platformun bir sınırlama hızla dizileri değiştirme yeteneği sınırlar bireysel sondalar, sipariş için daha plakaları tasarımı ve üretimi için daha uzun sürer olmasıdır. Genel olarak real-time PCR başka sınırlama roman veya beklenmeyen patojenleri algılamak için yetersizliğidir. Bu, birden fazla türde sekansları ile örtüşmek tahlilleri tasarlayarak bir ölçüde üstesinden, ancak tarafsız tüm genom sekanslama göre yöntemler, yeni maddelerin keşfedilmesi için daha uygundur. 11,12
Nano ölçekli real-time PCR için yeni bir paradigma izin veren sendromu tabanlı yüksek verimli moleküler tanı reaktif ve işçilik maliyetlerini azaltmak için yararlıdır türler tabanlı test, yerine. Bu yaklaşım büyük ölçekli panel test örneğin Dunne ve Gurfield 13 ve Moutailler ve ark., 14 tarafından tarif edilenler gibi OneHealth kontrol çabalarını kolaylaştırabilir. Erken sürüntü örneklerinin toplanması,genellikle klinik başlangıcından 3 gün içinde, solunum patojenlerin varlığı tanımlamak için en iyi şansı sağlar. Bulaşıcı hastalığın ortaya çıkması, genellikle öngörülemeyen ve reaktifler modifikasyonu için gerek kalmadan farklı türleri üzerinde yapılabilir testler hazırlık için idealdir. Bu teknolojinin gelecekte uygulamaları patotiplendirme, antimikrobiyal direnç profilleme ve ayrıca sendrom dayalı klinik tanı panellerde olması muhtemeldir. Nano ölçekli real-time PCR çoklu örnek ve patojen türleri hızlı, yüksek verimli tarama için en yararlı olan, yeni ve acil patojenleri belirlemek için tarafsız veya kısmen önyargılı sıralama temelli yaklaşımlar ile tamamlanmaktadır olacaktır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Burada açıklanan solunum patojen deneyleri üzerinde çalışma Cornell Hayvan Sağlığı Tanı Merkezi iç gelişim fonları tarafından desteklenmiştir. nano PCR iş akışı ve ilgili kalite güvence sistemlerinin geliştirilmesi kısmen (FOA PA-13-244) tarafından finanse edilen ve hibe sayılı 1U18FD005144- altında Gıda ve İlaç İdaresi Veteriner Laboratuar Araştırma ve Müdahale Ağı (FDA Vet-LIRN) ile işbirliği içinde gerçekleştirildi 01. yayın ücretleri VWR ve Quanta Biosciences tarafından desteklenmiştir. Biz yazma ve protokol gözden onların yardım için Gabrielle Nickerson, Roopa Venugopalan, Veldina Camo, Xiulin Zhang, Jinzhi Yu, Weihua Wang ve Katrina Walker teşekkür ederiz. Biz yazar röportajlar filme Mike Carroll teşekkür ederiz. Sonunda onların yararlı açıklamalar editörü ve üç anonim hakemleri teşekkür ederim.
Materials
| Zap-OGlobin II lytic reagent | Beckman Coulter | 7546138 | Optional reagent for preparing blood samples. |
| Extraction kit (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | AM1840 | Other extraction kits appropriate for the desired sample types may be substituted. This kit comes with PBS, lysis buffer, and wash buffer. |
| 2X One-Step RT-qPCR mix (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix ) | Quanta Biosciences | 95134-500 | |
| Gene-specific primer pool | IDT | custom order | Can be generated by the user or purchased with the amplification plates. |
| Random primer mix | New England Biolabs | S1330S | |
| Standard 96-well plate | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | N8010560 | This can be any plate that fits into the conventional PCR machine used. |
| Amplification master mix (OpenArray master mix) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4462164 | |
| Clear adhesive seal | Thermo-Fisher | 430611 | |
| Foil seal | Excel Scientific | AF-100 | |
| 384-well plate | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4406947 | |
| Amplification plate (QuantStudio 12K Flex OpenArray plate) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4470813 | Can be customized with any assays conforming to standard TaqMan conditions. |
| Accessories kit | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4469576 | Contains the case lids, plugs, and immersion fluid. |
| AccuFill tips | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4457246 | |
| Amplification machine (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4471090 | |
| Liquid handler (OpenArray AccuFill System) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4457243 | This is purchased with the amplification machine. |
| Primer design software (Primer Express) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4363991 | See manufacturer's instructions for detailed primer and probe specifications. |
| Image analysis program (ImageJ) | NIH | Available at http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Spreadsheet program (Excel) | Microsoft | Available at https://products.office.com/en-us/excel | |
| PCR plate spinner | VWR | 89184-608 | This device has only one speed (2500 rpm); the rotor starts when the lid is closed and stops when the button is pushed. |
| TE buffer | Millipore | 8890-100ML | 10mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 1mM Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0 |
| DMEM | Thermo-Fisher/Gibco | 11965-092 | |
| Tissue disruptor (TissueLyser II) | Qiagen | 85300 | |
| Conventional thermal cycler (Veriti) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4375786 | Any conventional thermal cycler with a heated lid can be used. |
References
- Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. Nanoliter scale PCR with TaqMan detection. Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).
- Morrison, T., et al. Nanoliter high throughput quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 34 (18), e123 (2006).
- Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J Mol Endocrinol. 29 (1), 23-39 (2002).
- McCall, M. N., et al. A benchmark for microRNA quantification algorithms using the OpenArray platform. BMC bioinformatics. 17 (1), 138 (2016).
- Pozzi, A., Previtali, C., Cenadelli, S., Gandini, L., Galli, A., Bongioni, G. Genetic traceability of cattle using an OpenArray genotyping platform. Anim Genet. 47 (1), 133-134 (2016).
- Grigorenko, E., et al. Multiplex screening for blood-borne viral, bacterial, and protozoan parasites using an OpenArray platform. J Mol Diagn. 16 (1), 136-144 (2014).
- Shu, B., et al. Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus. J Clin Microbiol. 49 (7), 2614-2619 (2011).
- Elia, G., et al. Detection of equine herpesvirus type 1 by real time PCR. J Virol Methods. 133 (1), 70-75 (2006).
- Dreier, J., Störmer, M., Kleesiek, K. Use of Bacteriophage MS2 as an Internal Control in Viral Reverse Transcription-PCR Assays. J Clin Microbiol. 43 (9), 4551-4557 (2005).
- Pusterla, N., Hussey, G. S. Equine Herpesvirus 1 Myeloencephalopathy. Vet Clin North Am Equine Pract. 30 (3), 489-506 (2014).
- Firth, C., Lipkin, W. I. The genomics of emerging pathogens. Annu Rev Genomics Hum Genet. 14, 281-300 (2013).
- Lecuit, M., Eloit, M. The potential of whole genome NGS for infectious disease diagnosis. Expert Rev Mol Diagn. 15 (12), 1517-1519 (2015).
- Dunne, G., Gurfield, N. Local Veterinary Diagnostic Laboratory, a Model for the One Health Initiative. Vet Clin North Am Small Anim Pract. 39 (2), 373-384 (2009).
- Moutailler, S., et al. Co-infection of Ticks: The Rule Rather Than the Exception. PLOS Negl Trop Dis. 10 (3), e0004539 (2016).
