Detection High-throughput respiratorie patogeni nei campioni animali da Nanoscale PCR
Summary
test high-throughput di DNA e RNA patogeni a base di nanoscala PCR è descritto con un cane sindromica e equini pannello PCR respiratorio.
Abstract
scala nanoliter real-time PCR utilizza multiplexing spaziale per consentire a più test da eseguire in parallelo su un singolo piatto senza gli svantaggi tipici di combinare insieme le reazioni. Abbiamo progettato e valutato un pannello basato su questo principio per identificare rapidamente la presenza di agenti patogeni comuni nei cani e cavalli con malattia respiratoria acuta. Questo manoscritto descrive un flusso di lavoro PCR diagnostico su scala nanometrica per la preparazione del campione, l'amplificazione e l'analisi di sequenze bersaglio patogeni, concentrandosi sulle procedure che sono diverse dalle reazioni scala microlitro. Nel pannello respiratoria presentato, 18 saggi sono stati ogni istituiti in triplice copia, che possono ospitare fino a 48 campioni per piastra. Una estrazione e di pre-amplificazione del flusso di lavoro universale è stato ottimizzato per la preparazione dei campioni high-throughput per ospitare molteplici matrici e gli agenti patogeni a base di DNA e RNA. dati rappresentativi sono presentati per un obiettivo RNA (influenza A matrice) e un obiettivo di DNA (herpesvirus equino1). La possibilità di testare in modo rapido e preciso per un gruppo completo sindrome a base di agenti patogeni è uno strumento prezioso per migliorare l'efficienza e l'ergonomia di test diagnostici e per la diagnosi della malattia respiratoria acuta e gestione.
Introduction
Con la domanda per la rilevazione rapida e completa di molteplici agenti in diagnostica clinica per l'uomo e gli animali, unico organismo metodi diagnostici molecolari per il rilevamento degli agenti patogeni sono gravosi se non usato per un gran numero di campioni in fase di sperimentazione per una singola malattia. Nel contesto veterinaria, high throughput metodologie diagnostiche sono particolarmente importanti a causa della necessità supplementare per coprire patogeni da un'ampia varietà di specie. OneHealth approcci per la gestione delle malattie di origine alimentare e la sorveglianza degli agenti patogeni emergenti sono esempi di esigenze di test che includono un numero di batteri, virus (DNA o RNA based), parassiti e funghi. La sfida di combinare test per più analiti insieme (multiplexing) al fine di migliorare l'efficienza di test è una possibile perdita di sensibilità e un grande peso per l'ottimizzazione e la validazione di saggi.
in tempo reale scala nanoliter reazione a catena della polimerasi (PCR) è un alternativo per la pratica di multiplazione che permette molte reazioni separate di eseguire contemporaneamente sullo stesso campione 1. La piattaforma OPENARRAY è un'applicazione di questo principio 2; combina la tecnologia dei microarray con real-time PCR. Basato sul concetto di multiplexing spaziale, ogni campione viene testato per un gran numero di bersagli in separato fori passanti. Questa piattaforma è stata inizialmente utilizzata con legame al DNA a doppio filamento Cyanine a base chimica 2 ed è ora disponibile per la chimica sonda-based utilizzando sonde tempra scuri 3. Questa piattaforma è stata principalmente utilizzato per la profilazione genetica negli esseri umani e negli animali 4 5. E 'stato recentemente adattato per rilevare il DNA e RNA agenti patogeni da Grigorenko et al. 6 utilizzando una procedura in due fasi inversa trascrizione / pre-amplificazione (preamplificatore).
Descriviamo qui di una procedura preamplificatore a base one-step per la rilevazione di entrambi i tipi di agenti patogeni nel sec respiratoriaretions e una varietà di altri tipi di campioni che possono essere eseguite interamente in una giornata lavorativa normale. Al completamento del preamplificatore one-step, i campioni vengono trasferiti ad una piastra a 384 pozzetti, che è il formato accettato dal sistema di gestione dei liquidi automatizzato che viene con questa piattaforma nanoscala PCR. Il sistema disegna il master mix e il campione su tutta la superficie di un massimo di 4 piastre (192 campioni e controlli) alla volta. In seguito a questo processo di caricamento, si descrive come i campioni sono amplificati e analizzati utilizzando un foglio di calcolo macro che riassume la media di 3 repliche tecnici per ogni combinazione campione / target in una tabella che si inserisce in una pagina stampata.
è stato stabilito un metodo uniforme per l'analisi del DNA e / o RNA estratto da campioni che utilizzano questa piattaforma. Un'ampia varietà di campioni sono stati estratti, retrotrascritto, e pre-amplificato in un formato a 96 pozzetti, minimizzando la possibilità di errori. campioni respiratori testati inclusi tamponi nasali, tamponi faringei profondi,lavaggi trans-tracheale, lavaggio broncoalveolare, e tessuto polmonare. Poiché alcuni degli agenti testati possono anche essere presenti nel sangue periferico o feci, abbiamo incorporato questi tipi di campioni nella procedura. Questo flusso di lavoro consente di risparmiare tempo e risorse rispetto alla corsa esperimenti in più piatti, permettendo test efficiente attraverso patogeno e la tossina rilevazione gene pannello a base al posto di test individuale. Il pannello respiratoria dimostrato qui aveva 18 saggi di ogni stampati in triplice copia fori passanti, che possono ospitare fino a 48 campioni per piastra. I patogeni equine rilevati inclusi adenovirus equina 1 e 2, il virus arterite equina, equina virus rinite A e B, equina herpesvirus (AAT) tipi 1 e 4, e Streptococcus equi. I patogeni canino incluso canine coronavirus respiratorio (betacoronavirus), virus del cimurro canino, adenovirus canino, virus parainfluenza canina, pneumovirus canina, Bordetella bronchiseptica e Mycoplasma CYNOS. UNl'influenza universale sono stati inclusi anche un saggio e un controllo interno (MS2 RNA fago).
Protocol
Representative Results
Discussion
Questa procedura è stata utilizzata per il test di routine di patogeni respiratori nel nostro laboratorio nel corso di sei mesi (2-3 volte a settimana). Abbiamo anche avuto successo usando la stessa procedura per enterica profiling patogeno in campioni fecali e batteri isolati su un piatto personalizzato separatamente. Una volta che le piastre vengono prodotte, personale esperto in grado di completare i passaggi 2-7 entro una giornata lavorativa standard. Le fasi più critiche sono la corretta tenuta della piastra preamplificatore, il trasferimento dei campioni preamplificati fra piastre (che deve essere fatto rapidamente per evitare l'evaporazione), ed il rivestimento finale della piastra di amplificazione. L'uso del foglio di macro come guida per l'analisi risultato (controllo curve per campioni e controlli) era anche critica in quanto riduce notevolmente la quantità di tempo e lavoro di ufficio necessario per questo processo. Il foglio di calcolo macro fornito è un esempio; avrebbe bisogno di essere modificato o ricreato per piatti con diverse configurazioni. Questo può essere facilmente performed da qualcuno con conoscenze di base foglio di calcolo.
A causa della piccola quantità di campione caricato sulla piastra di amplificazione (33 nl), è necessario pre-amplificazione. Nella ottimizzazione di questo protocollo (non mostrato), abbiamo confrontato una serie di parametri di preamplificazione compreso il master mix, aggiunta di primer casuali, il numero di cicli, tempo di ricottura, e diluizione prima dell'amplificazione. Ogni bersaglio aveva le sue condizioni ottimali, e quelli qui descritti rappresentano quelli che ha dato il limite migliore della complessiva rilevazione per il nostro pannello. Questo pannello copre un'ampia gamma di obiettivi patogeni e tipi di campione che si incontrano nei test diagnostico veterinario di routine, ma le modifiche alle procedure di preamplificazione può essere necessaria per diversi pannelli. Le condizioni di amplificazione quelle ottimizzati sono basate su uno standard sonda basata protocollo in tempo reale PCR con un 10 min a 95 ° C attivazione enzimatica seguita da denaturazione a 95 ° C e AnnEaling / estensione a 60 ° C. I primer e le sonde sono pre-stampati sulle piastre anche utilizzando condizioni produttore ottimizzato e quindi non richiedono titolazione. Combinando i passaggi trascrizione inversa e pre-amplificazione per tutti i campioni (indipendentemente dal tipo di destinazione) è necessario per mantenere l'efficienza del flusso di lavoro. Avere tutti i campioni trascrizione inversa è anche utile per massimizzare la sensibilità. Inoltre, l'uso di una miscela master per il preamplificatore ottimizzata per inibitori riduce permette versatilità nel combinare diversi tipi di campione sulla stessa piastra.
Il Center for Disease Control (CDC) saggio matrice di influenza descritto da Shu et al. 7 e adattato qui per le reazioni scala nanolitro è una influenza universale Un test che è appropriato per i campioni di prova da esseri umani e animali da compagnia. E 'stato progettato per il rilevamento universale del gene matrice di tutti i virus dell'influenza A usando rea scala microlitroAZIONI. E 'stato utilizzato in tutto il mondo come parte di un Panel virus CDC influenza umana e di un pannello di influenza suina CDC. Il EHV-1 test 8 adattato qui rileva un importante patogeno respiratorio dei cavalli che possono causare aborti e malattie neurologiche (recensito da Pusterla e Hussey 10). Il significato di adattare questi test per una piattaforma high-throughput con un controllo interno specie indipendente è che possono essere incorporati in un approccio di sorveglianza OneHealth. Avendo entrambi questi saggi su una piattaforma di test high-throughput faciliterà la preparazione alle emergenze per le strutture cliniche, ricoveri, e gli eventi di prestazioni.
I risultati sopra descritti erano rappresentative di tutti gli obiettivi sulla piastra con l'eccezione di Mycoplasma CYNOS, che ha mostrato considerevolmente più variazione delle prestazioni analitica. Questo è probabilmente dovuto alla temperatura di sub-ottimali di fusione (T m) dei primer, che idealmente dovrebbe essere 58-60 &# 176; C (la sonda ideale Tm è 68-70 ° C). Una limitazione di questa piattaforma è che ci vuole più tempo per progettare e realizzare le piastre che per ordinare le singole sonde, che limita la capacità di modificare rapidamente le sequenze. Un'altra limitazione di PCR in tempo reale, in generale, è l'incapacità di rilevare romanzo o patogeni inattesi. Questo può essere superato in una certa misura progettando saggi che hanno sequenze di specie diverse, ma imparziali metodologie basate genoma sequenziamento sono più adatti per la scoperta di nuovi agenti. 11,12
Nanoscale PCR in tempo reale permette un nuovo paradigma per la sindrome-based piuttosto che specie basati su test, che è utile per ridurre reagenti e costo del lavoro in diagnostica molecolare ad alto throughput. Su larga scala test panel da questo approccio può facilitare gli sforzi di sorveglianza OneHealth come quelli descritti da Dunne e Gurfield 13 e Moutailler et al. 14. La raccolta dei campioni di tamponi precoce,generalmente entro 3 giorni di manifestazione clinica, offre la migliore possibilità di identificare la presenza di patogeni respiratori. Infettiva comparsa della malattia è spesso imprevedibile, e le prove che possono essere eseguite su diverse specie, senza la necessità di modifica dei reagenti sono ideali per la preparazione. Le future applicazioni di questa tecnologia sono suscettibili di essere in pathotyping, profilatura resistenza antimicrobica, ed ulteriori pannelli di diagnostica clinica sindrome-based. Nanoscale PCR in tempo reale è molto utile per lo screening rapido, high-throughput di molteplici tipi di campioni e patogeni, e sarebbe completato da approcci imparziali o parzialmente distorti sequenziamento-based per l'individuazione di nuove ed emergenti agenti patogeni.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro su saggi patogeno respiratorio qui descritti è stato sostenuto da fondi per lo sviluppo interno Cornell Animal Health Centro Diagnostico. Sviluppo della scala nanometrica flusso di lavoro PCR e sistemi di garanzia di qualità è stato parzialmente finanziato (FOA PA-13-244) e svolto in collaborazione con Veterinary Laboratory Investigation la Food and Drug Administration e Response Network (FDA Vet-LIRN) sotto Grant No 1U18FD005144- 01. I costi di pubblicazione sono stati sponsorizzati da VWR e Quanta Biosciences. Ringraziamo Gabrielle Nickerson, Roopa Venugopalan, Veldina Camo, Xiulin Zhang, Jinzhi Yu, Wang Weihua, e Katrina Walker per la loro assistenza con la scrittura e la revisione del protocollo. Ringraziamo Mike Carroll per filmare le interviste agli autori. Abbiamo finalmente Ringraziamo l'editor e tre revisori anonimi per i loro utili commenti.
Materials
| Zap-OGlobin II lytic reagent | Beckman Coulter | 7546138 | Optional reagent for preparing blood samples. |
| Extraction kit (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | AM1840 | Other extraction kits appropriate for the desired sample types may be substituted. This kit comes with PBS, lysis buffer, and wash buffer. |
| 2X One-Step RT-qPCR mix (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix ) | Quanta Biosciences | 95134-500 | |
| Gene-specific primer pool | IDT | custom order | Can be generated by the user or purchased with the amplification plates. |
| Random primer mix | New England Biolabs | S1330S | |
| Standard 96-well plate | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | N8010560 | This can be any plate that fits into the conventional PCR machine used. |
| Amplification master mix (OpenArray master mix) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4462164 | |
| Clear adhesive seal | Thermo-Fisher | 430611 | |
| Foil seal | Excel Scientific | AF-100 | |
| 384-well plate | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4406947 | |
| Amplification plate (QuantStudio 12K Flex OpenArray plate) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4470813 | Can be customized with any assays conforming to standard TaqMan conditions. |
| Accessories kit | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4469576 | Contains the case lids, plugs, and immersion fluid. |
| AccuFill tips | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4457246 | |
| Amplification machine (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4471090 | |
| Liquid handler (OpenArray AccuFill System) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4457243 | This is purchased with the amplification machine. |
| Primer design software (Primer Express) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4363991 | See manufacturer's instructions for detailed primer and probe specifications. |
| Image analysis program (ImageJ) | NIH | Available at http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Spreadsheet program (Excel) | Microsoft | Available at https://products.office.com/en-us/excel | |
| PCR plate spinner | VWR | 89184-608 | This device has only one speed (2500 rpm); the rotor starts when the lid is closed and stops when the button is pushed. |
| TE buffer | Millipore | 8890-100ML | 10mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 1mM Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0 |
| DMEM | Thermo-Fisher/Gibco | 11965-092 | |
| Tissue disruptor (TissueLyser II) | Qiagen | 85300 | |
| Conventional thermal cycler (Veriti) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4375786 | Any conventional thermal cycler with a heated lid can be used. |
References
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