ナノスケールPCRによる動物標本における呼吸器病原体のハイスループット検出

いいえヒト被験体または実験動物は、このプロトコルの開発に使用されませんでした。コントロールは、配列を確認したアンプリコンの精製によって、およびRNA標的のためのin vitro転写で生成されました。臨床サンプルはコーネルアニマルヘルス診断センターへの日常的な診断テストのために提出されました。 1.プレートデザイン各アッセイは、プライマー、プローブテストツールを使用して、60℃のアニーリングと標準プローブベースのリアルタイムPCRサイクル条件に準拠していることを確認するために、プライマー設計ソフトウェアを使用します（デフォルトのパラメータで設定定量プローブを選択します）。 注：使用する代表的なRNA標的は、普遍的なインフルエンザシュウらによって発表され、マトリックスの標的アッセイ7から適応させました。次のようなプライマーおよびプローブは、次のとおりです。フォワードプライマー：GACCRATCCTGTCACCTCTGAC、リバースプライマー：AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA、プローブ：ファム – TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-QSY。ここで使用される代表的なDNAアッセイは、あちこちに適応させましたイーリアらによって発表されたウマヘルペスウイルス1型（EHV-1）の検出方法をメートル 8。次のようなプライマーおよびプローブは、次のとおりです。フォワードプライマー：GCTCTCAGGTTTTACGACATC、リバースプライマー：CTTTACCCAGGCCCTTGAAA、プローブ：FAM-TCAACGTGGACAATACCGCAGTGATTAT-QSY。 所望の形状にナノスケールのPCR増幅プレートを注文。 注：この研究のために、18×3遺伝子発現形式が使用された（ 表1）。メーカーに各ターゲットのすべてのプライマーおよびプローブのための配列（またはインベントリアッセイID）を提供します。 2.核酸抽出任意の方法により全核酸（DNAやRNA）を抽出します。 注：自動化された磁気ビーズをベース抽出キットをメーカーの指示に従ってここで使用された（詳細については、材料の表を参照）。 次のようにサンプルを準備します。 10％の漂白剤とドライ徹底的に各試料容器の外側を清掃してください。手袋をはめたFワイプ交差汚染を防止するために、サンプル間の10％の漂白剤とインガーのヒント。 場所の鼻または生理食塩水を数滴と（赤トップ採血管など）の任意の滅菌、密封バイアル中の深い咽頭スワブは、処理の前に乾燥を防ぐために添加しました。 注：綿、プラスチック、木材処理され、ダクロンや他の合成スワブを全て許容されるが、アルギン酸カルシウムスワブを避けます。 液体の少なくとも1〜2ミリリットルがあるように綿棒や気管洗浄のために、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を追加します。チューブに積極的に綿棒とDMEMをVORTEX。次に、新しいチューブにメディアの約1ミリリットルを転送するためにピペットを使用しています。 825×gで3分間遠心分離し、製造元の指示に従って組織破砕機を用いて機械的に溶解組織（DMEMの1ミリリットルで100から200 mg）を。新しいチューブに上清500μlのを転送します。 糞のために、1×リン酸緩衝SAの800μlの糞の400ミリグラムを組み合わせますライン液pH7.4（PBS）。ボルテックス1分以上用サスペンションは、試料を均質化または完全に中断されるまで。いったん均質化し、その後、新しいチューブに400μlのを転送し、18,000×gで10分間のサスペンションを遠心します。 全凝固していない血液について、サンプルをボルテックスし、250μlのアリコートを作ります。混合する溶解試薬と渦の6滴を追加します。 37℃で15分間インキュベートします。 製造元の指示に従って溶解及び洗浄バッファーを準備します。 MS2ファージまたは内部陽性抽出制御9などの溶解バッファーへの選択肢の内部コントロールを追加します。 各ビーズチューブに溶解緩衝液235μlのと（負の対照またはPBS）のサンプル175μlを添加します。製造業者のプロトコールに進みます。 注：精製された全核酸は、90μlのここに溶出しました。 3.逆転写/プレ増幅（プリアンプ） 注：で使用されるすべての試薬およびサンプルを保管してくださいすべての回で氷の上のプリアンプの反応。プリアンプに続いて、室温で全ての試薬を保持します。 ネガティブコントロールとして溶出したDNAおよび/またはRNA、PCR反応ミックス、ヌクレアーゼフリー水を組み立て、そしてポジティブ増幅制御のための基準をプールしました。 注：48サンプルまでは、コントロールを含む増幅プレートで実行することができる（試料が引っ張られるべきであるから、各抽出板のための少なくとも一つの負の抽出制御を含みます）。 サンプルマップを印刷します。二人目の検査マップとサンプルレイアウトが一致することがあります。 1.5mlチューブで、プリアンプのマスターミックスを準備するには、次を追加します。 注：14μlの最終容量がここで使用されました。 各ターゲットからの予混合プライマープールを追加するように、各プライマーの最終濃度は900 nMです。 注：ここで使用されるプールは10倍濃度で調製し、1.4μlの反応ごとに追加されました。 600 nMもしくは0.1×の最終濃度にランダムプライマーを追加します。 </l私> 最終容量（ここでは7マイクロリットル）の半分に2倍RT-定量PCRミックスを追加します。 穏やかにボルテックスし、スピンダウンしてマスターミックスの成分を一緒に混ぜます。 プレートのみ（列1-6）の左側を使用して、標準的な96ウェルプレートにプリアンプを実行します。 各ウェルにプリアンプのマスターミックスの8.5μlのおよびDNA / RNAサンプルの5.5μLを加えます。 すべての試薬（プリアンプミックスとサンプル、陽性対照および陰性対照）を結合した後、完全に透明な接着剤シールで、標準的な96ウェルプレートをシール。サイクル中、シール間隙の形成を防止するために、カミソリの刃を使用して、余分なシールを取り除きます。 PCRプレートスピナーを用いて20秒間密閉されたプレートを遠心。すべての試薬は、プレートウェルの底に結合されて確認してください。 以下の条件で、従来のサーモサイクラー上のプリアンプのアッセイを実行します。50℃で15分。 95℃で1分; 95℃で、次に2分で60℃で15秒の20サイクル。 99.9＆＃176; 10分間、C。 4℃で保持します。プログラム開始する前に、これらの条件。 、従来のサーマルサイクラーをオンにプリアンプサイクリングプログラムを選択して、プログラムを起動します。サーモサイクラー（ないカバー）の底部は、画面上で読み温度を監視することにより、cDNAを生産（50°C）のために必要な温度に到達した場合にのみ、サーモサイクラー中で96ウェルプレートを置きます。これに先立ち、偽陽性の結果を生成するリスクを最小限に抑えるために、コールドプレートを保ちます。 プリアンプの実行が完了すると、プレートは、密閉されたままであることを確認してください。 4.1すぐにステップ進みます。 、一晩このプレートを格納するステップ4.5から4.2に記載されているように希釈を実行するには、代わりにゆるくプレートをカバーするのを除いて、4℃で保存ジッパーロック袋の内側に透明な接着剤シールと場所、でプレートをシール。 プリアンププレートの4希釈あちこち増幅プレートの適切な数を削除します（4までを一度に実行することができる）冷凍庫メートル。パッケージを開けないでください。プレートは室温で少なくとも15分間ウォームアップすることができます。プレートのシリアル番号とロット番号を記録します。 注：未開封のプレートには、最大24時間室温で残ることができますが、ベストプラクティスのために、冷凍庫から前に必要な30分以下でこれらを削除しません。 PCRプレートスピナーを用いて20秒間完成プリアンププレートを遠心。増幅機とコンピュータの電源をオンにし、関連付けられたプログラムを起動します。 PCRセットアップ領域からすべての不要な項目を削除します。二重手袋と袖カバーに入れてください。 プリアンププレートからシールを取り外し、慎重に取り外し、外側の手袋を破棄します。ピペッティングによりカラム96ウェルプリアンププレートの1-6混合の各ウェルにTE緩衝液の56μLを添加することにより、5：1でプリアンプ製品を希釈します。底部から吸引すると、より高いアップを分配するが作成していない、だけピペットの最初のピットストップに行きます泡。かかわらず、未使用のすべてのウェル6列にTEバッファーを追加します。 透明な接着剤またはホイルシールのいずれかでプレートを再密封し、PCRプレートスピナーを用いて20秒間、それを遠心します。ステップ6.1が完了するまで（緩く覆われた）はさておき、このプレートを設定します。残りの手袋と袖のカバーを破棄します。 増幅プレートに384ウェル転送5.準備蓋、栓、浸漬液、プレートプレス、エタノール噴霧ボトル、および糸くずの出ない実験用ワイプのシリンジ：増幅プレートをカバーし、シールするために必要な材料を設定します。 （力を必要とする）シリンジキャップを外し、注射器の上に小さなプラスチックの先端をロックします。 （いくつかの小さな気泡が先端に残っている場合、それはOKです）空気の蓄積を除去するためにペーパータオルの上に浸漬液の少量を取り出します。真空密封されたアルミ袋から注射器を除去する60分以内に液浸流体を使用してください。注射器が開かれると、後で使用するためのキャップを再接続しないでください。 チェックプレートローディング液体ハンドラーの廃棄物のビンが空であることやヒントのボックスを開きます。新しいボックスが開かれ、先端ボックスカバーのヒントの有効期限を書き、ヒントは有効期限が切れていないことを確認してください。液体ハンドラとコンピュータの電源を入れ、セルフテストを実行します液体ハンドラ・ソフトウェアを開きます。 「セットアップとロード」をクリックしてください。サンプルトラッカーソフトウェアから作成したCSVファイルを選択し、「参照」をクリックします。ファイルが表示されない場合は、「インストゥルメント/編集環境設定」に移動して、「サンプルプレートファイルフォルダ」で「変更」をクリックします。 csvファイルが保存されているフォルダを選択します。そして、その後、 "参照"とファイルを選択し、「セットアップおよびロード」をクリックします。 次に、次の「プレートホルダーの位置1」〜「ブラウズ」をクリックし、プレートと同じシリアル番号を持っている（製造業者によって提供される）TPFファイルを選択します。 6.リキッドハンドラー転送注：Fiのを起動しないでください上記の手順の全てが完了するまで、384ウェルプレートをlling。蒸発させると、小容量で懸念される – 384ウェルプレートは、内部の液体で覆われていない放置しないでください。 一旦、全て上記の手順が完了している新しい、よくフィット二重手袋を着用し、スリーブがカバーしています。その後、384ウェルプレートに増幅マスターミックスの2.5μlを添加します。 表2にマップに従って384ウェルプレートに希釈したプリアンプ製品の2.5μLを移し、すぐにホイルシールでしっかりとプレートをカバーしています。外側の手袋とスリーブカバーを破棄します。 遠心PCRプレートスピナーで20秒間、384ウェルプレート。 ホイルシールを削除するが、液体ハンドラで384ウェルプレートを置かないでください。 包まれた増幅プレートを含むパッケージを開き、右側のシリアル番号を持つ最初のスロットに液体ハンドラーに慎重にそれを置く – 表面Oに触れることなくエッジでケースを開催プレートF。開口部の1時間以内に開封されたプレートを使用してください。 注：これは、スルーホール内部プライマーおよびプローブの少量を乱す可能性があるので、ケースの目的は、タッチされることからプレートを保護することです。 すべてが所定の位置になると液体ハンドラ内で384ウェルプレートからホイルシールを取り外します。 [次へ]をクリックし、各ステップが完了すると、すべてのチェックボックスをオンにします。実行を開始するには、[OK]をクリックします。 液体ハンドラーへの扉を閉じ、直ちに充填プロセスを開始します。液体ハンドラーの隣に滞在し、プレートが充填された後、すぐに次のステップに進みます。 液体ハンドラが実行されている間、ケース蓋の下部から保護膜を除去。 注：ケース蓋の底の接着剤は、赤テープと保護膜で覆われています。フィルムは赤いテープにアクセスする最初に削除する必要があります。 ステップ6.15までの場所でトップフィルムを残します。プライムRELEASに少し引いて、赤テープ接着剤からそれを電子。 液体ハンドラーからロードされた（埋め）増幅プレートを外し、ゆっくりと右のシリアル番号プレートプレスに配置します。 （プレートの方を向いて）底面の右と接着剤上の切り欠き端部とプレートの上に蓋を置きます。 慎重にそれを開閉板押圧レバーを引き下げ。光が20秒間点滅します。この時間の間にプレートプレスに手を触れないでください。ライトが緑色に点灯したら、慎重にレバーを持ち上げ、慎重に端にそれを保持することによって密閉されたプレートを取り外します。 例縁によって垂直方向に密封された増幅プレートを保持したまま、すぐに例最後にロードポートにシリンジ先端を挿入し、その後、プレートとの間の空間を充填する1穏やかな連続動作でゆっくりと浸漬液を分配蓋。板が浸漬されると、隅に小さな気泡を残します。 Hしながら古いプレートは、垂直エッジによって、ハンドルが途切れるまで、十分な圧力を加え、ポートにプラグを挿入し、プラグを時計回りにねじることにより、ロードポートを密封します。グリップケースのエッジがしっかりとハンドル破壊の力は、ケースを低下させないように。プレートがドロップされた場合は、それを捨てます。 糸くずの出ないことをワイプが完全にエタノールを噴霧されたとのケースを清掃してください。ケースを乾燥させるために、ワイプクリーンで下向きのケースを拭きます。静かにケースを扱います。井戸上記ガラスに圧力を加えないようにしてください。 増幅機にシールプレートを持参してください。 「インストゥルメント」タブで、「インストゥルメントコンソール」を選択します。その後、増幅マシンを選択し、「オープンドア」ボタンをクリックします。 アダプタが正しく左上隅にA1と並んされていることを確認し、プレートアダプタの最初のスロットに増幅プレートを置きます。東洋最大と向いているバーコード付きプレート楽器の正面。 「クローズドア」ボタンをクリックします。アダプタトレイの使用に注意してください – 10用途の制限があります。 画面下部の[ホーム]タブの下で、ファイル名を指定して実行]メニューの下、OpenArrayを選択します。 「プレートIDを取得します。」をクリックします空のボックスは自動的にプレートについての情報が取り込まれます。実行を開始するには、「スタートファイル名を指定して実行」をクリックします。 液体ハンドラーのソフトウェアを閉じて、液体ハンドラーをオフにします。チップラックの上に先端カバーを置きます。ごみ箱からヒントを破棄し、それをきれいに。清潔で作業面、ピペット、廃棄物のバケツ、とヒントボックスなどすべての項目を除染。 -20℃で透明な接着剤シールとストアとプリアンププレートを再密封。 7.結果の分析実行が完了したら、ファイルを保存し、ファイルを閉じるには、画面の一番下に実行名を持つタブの「X」をクリックしてください。 オープンドア」をクリックします。「ドアを開くには、画面の上部にある。ない浸漬液が漏れ出ていないことを確認し、増幅プレートを取り外します。をクリックして「ドアを閉めるには、画面の上部にある「閉じるドア。 「開く」をクリックして、それを開くために、実行ファイルを選択します。画面右上のボタンを分析し、緑色を押します。 （.txtファイルなど）結果をエクスポートするには、画面の左側にある「エクスポート」をクリックし、「エクスポート開始」。それが開いた後、ファイルを最小化します。そして、「エクスポートQCイメージ」をクリックします。 以下の基準に従って画像解析プログラムでQCの画像を確認してください。 何のダークスポットや汚れがないことを確認することにより、PRE-READ_CHANNEL_4.tiffとPOST-READ_CHANNEL_4.tiffを使用してロードの品質を評価します。 注：このチャネルによって検出された染料は反応がロードされたときに溶液中に放出されたプライマーおよびプローブの製造業者、で追加されます。このチャネルでの読み取りは、反応が適切であったことを示していますロードされ、染料と混合したプライマーおよびプローブが存在していること。 S02_C001_t03_p001_m1_x2_e1_cp＃1 _spotfind.tiffを使用してロードした後、プレートに漏れや攪拌のために確認してください。画像が暗く見える場合はプレート全体が表示されるまで、（Ctrlキーを押しながらコントロールを開くには、Shift + Cを）輝度を上げます。画像はありません影、泡、または変位のサンプルで均一に見えることを確認してください。 STAGE2_CYCLE1_CHANNEL_1.tiffとSTAGE2_CYCLE40_CHANNEL_1.tiffを使用して蓋（輝点）の下蓋の配置や破片を評価します。 オプション：結果のマクロ（補足コードファイル）を含むスプレッドシートを開きます。エクスポートしたデータファイルでは、右画面の下部にあるタブをクリックし、「移動またはコピー」を選択します。 「予約する」フィールドで、「Macro.xlsm結果」を選択します。 「最後に移動」と「コピーを作成」チェックボックスをオンにします。次に、[OK]をクリックします。 結果マクロオプションは、「予約する」フィールドに表示されない場合は、シムプライエクスポートしたデータファイルのワークシートの内容をコピーして、新しいタブに貼り付けます（すべてのセルとCtrl-Cを強調表示するには、左上のセルをクリックしてください）。 古い「エクスポート」タブを削除してから、「エクスポート」として新たに追加されたタブの名前を変更します。 「Altキーを押しながらF8」をクリックします（または[マクロを表示]をクリックします）、次に「マクロ」を選択し、「ファイル名を指定して実行」をクリックします。次に、 "Macro2では"を選択し、「ファイル名を指定して実行」をクリックし、 "Altキーを押しながらF8」をクリックすることで、Macro2では、これを繰り返します。 関連する情報（日付とシリアル番号）を使用して、結果のマクロファイルの名前を変更し、テーブルの上にこの情報を入れて、エクスポートされた結果のフォルダに同じファイル名として保存します。最後に、マクロ生成された結果表をプリントアウト。 増幅マシンソフトウェアでは、画面の左側に分析/増幅プロットを選択することで、マクロテーブルに対して各サンプルおよびコントロールのための曲線をチェックしてください。次に、サンプルのタブを選択し、各サンプルをクリックしてください表中の陽性結果のそれぞれについて、2または3の正の増幅曲線があることを確認してください。 増幅機の電源をオフにします。