איתור תפוקה גבוהה של פתוגנים הנשימה בדגימות בעלי חיים על ידי ננו PCR
Summary
בדיקות תפוקה גבוהה של פתוגנים מבוססים DNA ו- RNA על ידי ננו PCR מתוארות באמצעות כלבים syndromic ולוח PCR נשימת סוסים.
Abstract
סולם Nanoliter בזמן אמת PCR משתמשת ריבוב מרחבים לאפשר מבחני מרובים שיופעלו במקביל על צלחת אחת ללא חסרונות הטיפוסיים של שילוב תגובות ביחד. עיצבנו ומוערכת פאנל מבוסס על העיקרון הזה כדי לזהות את נוכחות במהירות של סוכני מחלה נפוצה אצל כלבים וסוסים עם מחלה נשימתית חריפה. כתב יד זה מתאר עבודה PCR ננו איבחוני הכנת המדגם, הגברה, וניתוח רצפי הפתוגן היעד, תוך התמקדות והליכים שונים מתגובות מידה מיקרוליטר. בחלונית הנשימה שהוצגה, 18 מבחנים היו כל להגדיר בשלושה עותקים, להכיל עד 48 דגימות לכל צלחת. חילוץ אוניוורסלי זרימת עבודה מראש הגברה הוטבה הכנת מדגם תפוקה גבוהה כדי להכיל מטריצה מרובה פתוגנים מבוסס DNA ו- RNA. נציג נתונים מוצגים עבור היעד RNA אחד (שפעת A מטריצה) ויעד DNA אחד (הרפס סוסים1). היכולת מהירה ומדויק לבדוק עבור קבוצה מקיפה, מבוסס-תסמונת של פתוגנים היא כלי רב ערך לשיפור יעילות ארגונומיה של בדיקות אבחון לאבחון מחלה נשימתית חריפה וניהול.
Introduction
עם ביקוש איתור מהיר ומקיף של סוכנים מרובים לדיאגנוסטיקה רפואית לבני אדם ולבעלי חיים, שיטות אבחון מולקולריות היחיד-אורגניזם לגילוי הפתוגן הם מכבידים אלא ממשמשים מספר רב של דגימות נבדקות עבור מחלה אחת. בהקשר הווטרינרים, מתודולוגיות אבחון תפוקה גבוהה חשובות במיוחד בשל צורך הנוסף לכיסוי פתוגנים ממגוון רחב של מינים. OneHealth גישות לניהול המחלה שמקורן במזון ומעקב הפתוגן המתעוררים הם דוגמאות של הצרכים בדיקות הכוללות מספר חיידקים, וירוסים (DNA או RNA מבוסס), טפילים ופטריות. האתגר שילוב בדיקות עבור analytes מרובים יחד (ריבוב) על מנת לשפר את יעילות הבדיקה היא הפסד אפשרי של רגישות נטל גדול עבור אופטימיזציה ואימות של מבחני.
תגובת שרשרת בקנה מידה Nanoliter פולימראז בזמן אמת (PCR) הוא האלטריליד לפרקטיקה של ריבוב המאפשרת תגובות נפרדות רבות לרוץ בו זמנית על אותו המדגם 1. פלטפורמת OpenArray היא יישום של עיקרון זה 2; הוא משלב טכנולוגיה microarray עם PCR בזמן אמת. מבוסס על הרעיון של ריבוב מרחבים, כל מדגם הוא נבדק על מספר רב של מטרות נפרדות דרך חורים. פלטפורמה זו שמשה בתחילה עם כימית מחייב cyanine מבוסס פעמים התקועות DNA 2, והיא זמינה כעת עבור כימיה מבוססת בדיקה באמצעות 3 בדיקות מרווה כהות. פלטפורמה זו נעשה שימוש בעיקר עבור פרופיל גנטי בבני אדם ובעלי חיים 4 5. זה הותאם לאחרונה לזהות פתוגנים DNA ו- RNA-מובל בדם על ידי ואח Grigorenko. 6 באמצעות הליך שני שלבים הפוכה שעתוק / טרום הגברה (preamp).
אנו מתארים כאן הליך מבוסס קדם מגבר אחד-צעד לגילוי שני סוגי פתוגנים שניות נשימהretions ומגוון של סוגי מדגם אחרים שיכול להתבצע אך ורק בתוך יום עבודה רגיל. עם ההשלמה קדם מגבר אחד-צעד, דגימות מועברות צלחת 384 גם, המהווה את הפורמט המקובל על ידי מערכת טיפול נוזל האוטומטית שמגיעה עם פלטפורמת ה- PCR ננו זה. המערכת שואבת את תערובת מאסטר ו המדגם על פני השטח של עד 4 צלחות (192 דגימות ובקרות) בכל פעם. בעקבות תהליך טעינה זה נתאר כיצד דגימות הם מוגברים ונותחו באמצעות גיליון אלקטרוני מאקרו המסכם את הממוצע של 3 משכפל טכני עבור כל שילוב מדגם / יעד בטבלה שמתאימה על דף מודפס אחד.
שיטה אחידה לניתוח DNA חילוץ ו / או RNA מן הדגימות באמצעות פלטפורמה זו הוקמה. מגוון רחב של דוגמאות חולץ, הפוך עבד, וטרום-מוגבר בפורמט 96-היטב, מזעור האפשרות לטעויות. דגימות נשימה שנבחנו כללו בין היתר מטליות אף, מטליות בלוע עמוקות,שטיפות טרנס-קנה הנשימה, שטיפה ברונכואלוואולרית, ואת רקמת הריאה. מכיוון שהחלק מהסוכנים הנבדקים עשויים להיות גם בהווה בדם היקפי או צואה, שילבנו סוגים אלה של דגימות לתוך ההליך. זרמי עבודה זה עוזר לחסוך זמן ומשאבים לעומת הפעלת ניסויים ב צלחות מרובות, בכך שהיא מאפשרת בדיקה יעילה באמצעות זיהוי גן לוח מבוסס הפתוגן הרעלן במקום של בדיקות בודדות. פנל הנשימה הפגין כאן היה 18 מבחנים בכל מודפס בשלושה עותקים באמצעות חורים, להכיל עד 48 דגימות לכל צלחת. הפתוגנים סוסים זוהה כלולים אדנו סוסים 1 ו -2, וירוס arteritis סוסים, וירוס נזלת סוסים ו- B, הרפס סוסים (EHV) סוגים 1 ו -4, או סטרפטוקוקוס שוה. הפתוגנים הכלבי כלול קורונה נשימת כלבים (betacoronavirus), וירוס כלבלבת, אדנו כלבים, וירוס parainfluenza כלבים, pneumovirus כלבים, Bordetella bronchiseptica, ו cynos Mycoplasma. אAssay שפעת אוניברסלית שליטה פנימית (הפאג RNA MS2) נכללו גם.
Protocol
Representative Results
Discussion
הליך זה נעשה שימוש עבור בדיקות שיגרתיות של פתוגנים נשימה במעבדה שלנו במשך שישה חודשים (2-3 פעמים בשבוע). גם יש לנו הצלחה באמצעות אותו התהליך עבור פרופיל הפתוגן מעיים בדגימות צואה ומבודדת חיידקים על צלחת אישית בנפרד. לאחר הצלחות יוצר, צוות מנוסה יכול לבצע את שלבי 2-7 בתוך יום עבודה אחד רגיל. השלבים הקריטיים ביותר הם האיטום התקין של הצלחת קדם המגבר, העברת דגימות preamplified בין לוחות (אשר חייב להיעשות במהירות כדי למנוע אידוי), ואת הכיסוי הסופי של צלחת ההגברה. שימוש בגיליון האלקטרוני מאקרו כמדריך לניתוח תוצאה (בדיקת עקומות עבור דגימות ובקרות) היה קריטי גם כפי שהוא הקטין באופן משמעותי את משך הזמן ואת הניירת דרושה בתהליך זה. הגיליון המאקרו סיפק דוגמה; זה היה צריך להיות שונה או נוצר מחדש עבור צלחות עם תצורות שונות. זה יכול בקלות להיות PErformed ידי מישהו עם ידע גיליון אלקטרוני בסיסי.
בשל כמות קטנה מאוד של המדגם טעון לצלחת הגברה (33 NL), נדרשת הגברה מראש. בשנת אופטימיזציה של פרוטוקול זה (לא מוצג), השווינו מספר פרמטרים preamplification כולל מיקס מאסטר, תוספת של פריימרים אקראיים, מספר מחזורי, זמן חישול, ודילול לפני הגברה. היו כל יעד תנאים אופטימליים משלה, ואלה המתוארים כאן מייצגים אלה הניבו את הגבול הטוב ביותר של הכללית זיהוי לפנל שלנו. פנל זה מכסה מגוון רחב של מטרות פתוגניים וסוגים מדגם כי הם נתקלו בדיקות אבחון וטרינרים שיגרתיות, אבל שינויים לנהלי preamplification עשויים להיות נחוצים עבור פנלים שונים. תנאי הגברת אופטימיזציה היצרניות מבוססים על פרוטוקול ה- PCR בזמן אמת המבוססת על בדיקה סטנדרטית עם 10 דקות ב 95 מעלות הפעלת אנזים C ואחריו denaturation על 95 מעלות צלזיוס ו אןאילינג / רחבה על 60 מעלות צלזיוס. פריימרים וזונדים הם מודפס מראש על הצלחות גם באמצעות תנאי אופטימיזציה יצרן ולכן אינו דורש טיטרציה. שילוב היפך-שעתוק צעדי הגברה מראש עבור כל הדגימות (ללא תלות בסוג של יעד) היה הכרחי על מנת לשמור על יעילות בתהליך העבודה. לאחר כל הדגימות הפוכות עבדו הוא גם מועיל עבור למקסם את הרגישות. יתר על כן, שימוש תערובת אמן עבור קדם המגבר כי הוא מותאם במיוחד מעכבי מזעור מאפשר צדדי שילוב סוגי מדגם שונים על אותה הצלחת.
המרכז לבקרת מחלות (CDC) assay מטריקס שפעת מתואר על ידי שו et al. 7 והמותאמים כאן לתגובות בקנה מידת nanoliter הוא שפעת אוניברסלית assay שמתאימה מדגמי בדיקות מבני אדם ובעלי חי לוויה. זה היה מתוכנן לגילוי אוניברסלי של הגן מטריצה של כל וירוסים שפעת באמצעות מחשבה בקנה מידה מיקרוליטרctions. זה כבר נעשה שימוש ברחבי העולם כחלק לוח וירוס האדם שפעת CDC ולוח שפעת החזירים CDC. את assay EHV-1 8 מותאמים כאן מזהה פתוגן נשימה חשוב של סוסים שיכולים לגרום הפלות ומחלות נוירולוגיות (נבדק על ידי Pusterla ו Hussey 10). המשמעות של התאמת בדיקות אלה פלטפורמת תפוקה גבוהה עם בקרה פנימית-עצמאי מינים היא שהם יכולים להיות משולבים בתוך גישת מעקב OneHealth. בשניהם של מבחנים אלה על פלטפורמת בדיקות תפוקה גבוהה יקל כוננות חירום עבור מתקנים קליניים, מקלטים, ואירועי ביצועים.
התוצאות שתוארו לעיל היו נציג של כל המטרות על הצלחת למעט Mycoplasma cynos, אשר הראה הרבה יותר וריאציה בביצועים אנליטית. זה היה כנראה עקב טמפרטורת ההתכה תת אופטימלית (מ T) של פריימרים, אשר אידיאלי צריך להיות 58-60 &# 176; C (החללית האידיאלית TM היא 68-70 מעלות צלזיוס). הגבלה של פלטפורמה זו היא כי זה לוקח יותר זמן כדי לתכנן ולייצר הצלחות מאשר להזמנת בדיקות בודדות, אשר מגבילה את היכולת לשנות רצפים במהירות. מגבלה נוספת של real-time PCR בכלל היא חוסר היכולת לזהות רומן או פתוגנים לא צפויים. זו ניתן להתגבר במידה מסוימת על ידי עיצוב מבחני תואמי רצפי מינים רבים, אבל רצף הגנום משוחד כולו מתודולוגיות מבוסס מתאימות יותר עבור חשיפת סוכני רומן. 11,12
PCR בזמן אמת ננו מאפשר פרדיגמה חדשה מבוסס תסמונת ולא בדיקות מינים מבוססים, אשר הן שימושי עבור הפחתת עלויות מגיבים ועבודת אבחון מולקולרי תפוקה גבוהה. בדיקות לוח בקנה מידה גדול על ידי גישה זו יכולה להקל המאמצים מעקב OneHealth כגון אלה המתוארים על ידי דאן Gurfield 13 ו Moutailler et al. 14. אוסף של דגימות ספוגיות מוקדם,בדרך כלל בתוך 3 ימים מהופעה קלינית, מספק את הסיכוי הטוב ביותר לזהות את נוכחותם של פתוגנים נשימה. הופעתה מחל זיהומיות היא לעתים קרובות בלתי צפויה, ובדיקות שניתן לבצע על מינים שונים ללא צורך שינוי של ריאגנטים הן אידיאליות עבור מוכנות. יישומים עתידיים של הטכנולוגיה הזו צפויים להיות ב pathotyping, פרופיל עמידות לאנטיביוטיקה, ולוחות אבחון קליניים מבוסס תסמונת נוספת. PCR בזמן אמת ננומטריים שימושי ביותר עבור לסינון מהיר, תפוקה גבוהה של סוגי מדגם הפתוגן מרובים, יהיה כהשלמת גישות המבוסס על רצף משוחדים או מוטות חלקית לזיהוי פתוגנים חדשים המתהווה.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה על מבחני הפתוגן הנשימה המתואר כאן נתמכה על ידי קרנות פיתוח פנימי מרכז אבחון לבריאות בעלי חיים קורנל. פיתוח הננומטרי עבודה PCR ומערכות אבטחת איכות הקשורים מומנה בחלקה (פואה PA-13-244) ו שנעשתה בשיתוף לחקירת מעבדה וטרינרית של מינהל המזון והתרופות ותגובה רשת (-LIRN Vet FDA) תחת גרנט מס '1U18FD005144- 01. דמי הפרסום היו בחסות VWR ו Quanta Biosciences. אנו מודים גבריאל ניקרסון, רופא Venugopalan, Veldina Camo, XiuLin ג'אנג, Jinzhi יו, Weihua וואנג, וקטרינה ווקר על עזרתם בכתיבת וסקירה בפרוטוקול. אנו מודים מייק קרול לקראת צילומי ראיונות המחבר. אנחנו סוף סוף להודות לעורך ושלוש ביקורות של עמיתים אנונימיים על הערותיהם המועילות.
Materials
| Zap-OGlobin II lytic reagent | Beckman Coulter | 7546138 | Optional reagent for preparing blood samples. |
| Extraction kit (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | AM1840 | Other extraction kits appropriate for the desired sample types may be substituted. This kit comes with PBS, lysis buffer, and wash buffer. |
| 2X One-Step RT-qPCR mix (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix ) | Quanta Biosciences | 95134-500 | |
| Gene-specific primer pool | IDT | custom order | Can be generated by the user or purchased with the amplification plates. |
| Random primer mix | New England Biolabs | S1330S | |
| Standard 96-well plate | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | N8010560 | This can be any plate that fits into the conventional PCR machine used. |
| Amplification master mix (OpenArray master mix) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4462164 | |
| Clear adhesive seal | Thermo-Fisher | 430611 | |
| Foil seal | Excel Scientific | AF-100 | |
| 384-well plate | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4406947 | |
| Amplification plate (QuantStudio 12K Flex OpenArray plate) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4470813 | Can be customized with any assays conforming to standard TaqMan conditions. |
| Accessories kit | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4469576 | Contains the case lids, plugs, and immersion fluid. |
| AccuFill tips | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4457246 | |
| Amplification machine (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4471090 | |
| Liquid handler (OpenArray AccuFill System) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4457243 | This is purchased with the amplification machine. |
| Primer design software (Primer Express) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4363991 | See manufacturer's instructions for detailed primer and probe specifications. |
| Image analysis program (ImageJ) | NIH | Available at http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Spreadsheet program (Excel) | Microsoft | Available at https://products.office.com/en-us/excel | |
| PCR plate spinner | VWR | 89184-608 | This device has only one speed (2500 rpm); the rotor starts when the lid is closed and stops when the button is pushed. |
| TE buffer | Millipore | 8890-100ML | 10mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 1mM Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0 |
| DMEM | Thermo-Fisher/Gibco | 11965-092 | |
| Tissue disruptor (TissueLyser II) | Qiagen | 85300 | |
| Conventional thermal cycler (Veriti) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4375786 | Any conventional thermal cycler with a heated lid can be used. |
References
- Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. Nanoliter scale PCR with TaqMan detection. Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).
- Morrison, T., et al. Nanoliter high throughput quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 34 (18), e123 (2006).
- Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J Mol Endocrinol. 29 (1), 23-39 (2002).
- McCall, M. N., et al. A benchmark for microRNA quantification algorithms using the OpenArray platform. BMC bioinformatics. 17 (1), 138 (2016).
- Pozzi, A., Previtali, C., Cenadelli, S., Gandini, L., Galli, A., Bongioni, G. Genetic traceability of cattle using an OpenArray genotyping platform. Anim Genet. 47 (1), 133-134 (2016).
- Grigorenko, E., et al. Multiplex screening for blood-borne viral, bacterial, and protozoan parasites using an OpenArray platform. J Mol Diagn. 16 (1), 136-144 (2014).
- Shu, B., et al. Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus. J Clin Microbiol. 49 (7), 2614-2619 (2011).
- Elia, G., et al. Detection of equine herpesvirus type 1 by real time PCR. J Virol Methods. 133 (1), 70-75 (2006).
- Dreier, J., Störmer, M., Kleesiek, K. Use of Bacteriophage MS2 as an Internal Control in Viral Reverse Transcription-PCR Assays. J Clin Microbiol. 43 (9), 4551-4557 (2005).
- Pusterla, N., Hussey, G. S. Equine Herpesvirus 1 Myeloencephalopathy. Vet Clin North Am Equine Pract. 30 (3), 489-506 (2014).
- Firth, C., Lipkin, W. I. The genomics of emerging pathogens. Annu Rev Genomics Hum Genet. 14, 281-300 (2013).
- Lecuit, M., Eloit, M. The potential of whole genome NGS for infectious disease diagnosis. Expert Rev Mol Diagn. 15 (12), 1517-1519 (2015).
- Dunne, G., Gurfield, N. Local Veterinary Diagnostic Laboratory, a Model for the One Health Initiative. Vet Clin North Am Small Anim Pract. 39 (2), 373-384 (2009).
- Moutailler, S., et al. Co-infection of Ticks: The Rule Rather Than the Exception. PLOS Negl Trop Dis. 10 (3), e0004539 (2016).
