كشف الإنتاجية العالية للجهاز التنفسي مسببات الأمراض في العينات الحيوانية التي كتبها النانو PCR
Summary
يوصف الإنتاجية العالية اختبار الحمض النووي والحمض النووي الريبي مسببات الأمراض استنادا كتبها النانو PCR باستخدام الكلاب المتلازمة والفروسية لوحة PCR في الجهاز التنفسي.
Abstract
يستخدم على نطاق ونانولتر الوقت الحقيقي PCR المكانية المتعددة للسماح للفحوصات متعددة ليتم تشغيلها في نفس الوقت على لوحة واحدة من دون عيوب نموذجية من الجمع بين ردود الفعل معا. لقد قمنا بتصميم وتقييم لجنة بناء على هذا المبدأ على تحديد بسرعة وجود عوامل الأمراض شيوعا في الكلاب والخيول مع المرض التنفسي الحاد. توضح هذه المخطوطة النانو سير العمل PCR التشخيص لإعداد العينات، والتضخيم، وتحليل تسلسل العوامل المسببة للأمراض المستهدفة، مع التركيز على الإجراءات التي تختلف عن ردود الفعل على نطاق وميكروليتر. في لوحة الجهاز التنفسي المقدمة، وضعت 18 المقايسات كل ما يصل في ثلاث نسخ، واستيعاب ما يصل الى 48 عينات لكل لوحة. تم تحسين واستخراج وقبل التضخيم عالمي سير العمل لإعداد عينة الإنتاجية العالية لاستيعاب مصفوفات متعددة والدنا والرنا مسببات الأمراض مقرها. وتعرض بيانات تمثيلية للهدف واحد RNA (أنفلونزا مصفوفة) والهدف الحمض النووي واحد (هربس الخيول1). القدرة على اختبار بسرعة وبدقة لمجموعة شاملة مستندة إلى متلازمة من مسببات الأمراض هي أداة قيمة لتحسين الكفاءة وبيئة العمل من الاختبارات التشخيصية ولتشخيص أمراض الجهاز التنفسي الحادة والإدارة.
Introduction
مع الطلب للكشف السريع والشامل من وكلاء متعددة في التشخيص السريري للإنسان والحيوان، الكائنات احد الطرق الجزيئية للكشف عن العوامل المسببة للأمراض التشخيص مرهقة ما لم تستخدم لأعداد كبيرة من العينات التي يجري اختبارها لمرض واحد. في سياق البيطري، الإنتاجية العالية منهجيات التشخيص أهمية خاصة نظرا للحاجة إضافية لتغطية مسببات الأمراض من مجموعة واسعة من الأنواع. OneHealth أساليب إدارة الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية ومراقبة العوامل المسببة للأمراض الناشئة هي أمثلة على احتياجات التجارب التي تشمل عددا من البكتيريا والفيروسات (DNA أو RNA القائم)، والطفيليات والفطريات. ويتمثل التحدي في الجمع بين اختبارات التحاليل متعددة معا (مضاعفة) من أجل تحسين كفاءة الاختبار هو احتمال فقدان حساسية وعبء كبير لتحسين والتحقق من المقايسات.
مقياس نانولتر في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) هو مذبحمواطن لممارسة المتنوعة التي تتيح العديد من ردود الفعل منفصلة لتشغيل في نفس الوقت على نفس العينة 1. منصة OpenArray هو تطبيق لهذا المبدأ 2. فهو يجمع بين تكنولوجيا متطورة مع الوقت الحقيقي PCR. واستنادا إلى مفهوم المكانية المتعددة، يتم اختبار كل عينة لعدد كبير من الأهداف في منفصلة من خلال الثقوب. وقد استخدمت هذه المنصة في البداية مع الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل على أساس cyanine ملزمة كيمياء 2، وتتوفر الآن للكيمياء القائم على التحقيق باستخدام تحقيقات تبريد المظلمة 3. وفي المقام الأول تم استخدام هذه المنصة لالتنميط الجيني في البشر والحيوانات 4 5. تم تكييفها مؤخرا للكشف عن الحمض النووي والحمض النووي الريبي مسببات الأمراض التي تنتقل عن طريق الدم عن طريق Grigorenko وآخرون. 6 باستخدام خطوتين عكس النسخ / قبل التضخيم (PREAMP) الإجراء.
نحن هنا وصف الإجراء القائم على PREAMP خطوة واحدة للكشف عن كلا النوعين من مسببات الأمراض في الجهاز التنفسي ثانيةretions ومجموعة متنوعة من أنواع العينات الأخرى التي يمكن أن يؤديها تماما في يوم العمل العادي. عند الانتهاء من PREAMP خطوة واحدة، يتم نقل العينات إلى لوحة 384 بشكل جيد، وهو الصيغة المقبولة من قبل نظام مناولة السائل الآلية التي تأتي مع هذا المقياس النانوي منصة PCR. النظام يسحب مزيج الرئيسي وعينة على سطح ما يصل الى 4 لوحات (192 عينات والضوابط) في وقت واحد. وبعد هذا عملية التحميل، نحن تصف كيفية تضخيم عينات وتحليلها باستخدام جدول بيانات الماكرو الذي يلخص بمعدل 3 مكررات التقنية لكل تركيبة نموذج / الهدف في الجدول الذي يناسب على الصفحة المطبوعة واحد.
وأنشئ طريقة موحدة لتحليل الحمض النووي المستخرج و / أو الحمض النووي الريبي من العينات باستخدام هذه المنصة. تم استخلاص مجموعة واسعة من العينات، نسخه عكس، وقبل تضخيمه في شكل 96-جيدا، والتقليل من احتمالات الأخطاء. شملت عينات الجهاز التنفسي اختبار مسحات الأنف، ومسحات البلعوم العميق،يغسل عبر القصبة الهوائية، غسل القصبات، وأنسجة الرئة. منذ بعض العوامل التي يمكن أن تكون موجودة في الدم المحيطي أو البراز أيضا اختبارها، ونحن أدرجت هذه الأنواع من العينات في الإجراء. هذا تبسيط العمل يساعد على توفير الوقت والموارد مقارنة مع تجارب تشغيل في لوحات متعددة من خلال تمكين اختبار كفاءة من خلال العوامل المسببة للأمراض والسموم الكشف عن الجين القائم على لوحة في مكان الاختبار الفردي. كانت لوحة الجهاز التنفسي تظاهر هنا 18 المقايسات طباعة كل في ثلاث نسخ من خلال الثقوب، واستيعاب ما يصل الى 48 عينات لكل لوحة. وشملت مسببات الأمراض الفروسية الكشف اتش الخيول 1 و 2، فيروس التهاب الشرايين الخيول، الخيول فيروس التهاب الأنف ألف وباء، هربس الخيول (EHV) أنواع 1 و 4، والمكورات العقدية الخيلية. وشملت مسببات الأمراض الكلاب الفيروس التاجى الكلاب التنفسي (betacoronavirus)، فيروس حمى الكلاب كلاب، اتش الكلاب، فيروس نظير الانفلونزا الكلاب، pneumovirus الكلاب، البورديتيلة قصبات، وcynos الميكوبلازما. اانفلونزا عالمي أدرجت أيضا على فحص والرقابة الداخلية (MS2 RNA فج).
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد استخدم هذا الإجراء لاختبار روتيني من مسببات الأمراض التنفسية في المختبر لدينا على مدى ستة أشهر (2-3 مرات في الأسبوع). كان لدينا أيضا نجاح استخدام نفس الإجراء لتحديد ملامح الممرض المعوية في عينات البراز والعزلات البكتيرية على لوحة مخصصة بشكل منفصل. مرة واحدة يتم إنتاج لوحات، ويمكن للموظفين ذوي الخبرة استكمال الخطوات 2-7 في غضون ساعات العمل القياسية واحد. الخطوات الأكثر أهمية هي ختم الصحيح من لوحة PREAMP، ونقل عينات preamplified بين لوحات (والذي يجب أن يتم بسرعة لمنع التبخر)، وتغطي النهائي للوحة التضخيم. كان استخدام جداول البيانات الكلي كدليل لتحليل نتيجة (فحص منحنيات للعينات والضوابط) بالغ الأهمية أيضا لأنها تقلص إلى حد كبير مقدار الوقت والأوراق اللازمة لهذه العملية. جدول الكلي قدمت مثالا. أنها تحتاج إلى تعديل أو إعادة إنشاء لوحات مع تكوينات مختلفة. هذا يمكن أن يكون بسهولة المؤسسة العامةrformed من قبل شخص ما مع معرفة جدول الأساسية.
ويرجع ذلك إلى كمية صغيرة جدا من العينة تحميلها على لوحة التضخيم (33 NL)، مطلوب قبل التضخيم. في الاستفادة المثلى من هذا البروتوكول (لا يظهر)، قارنا عدد من المعلمات preamplification بما في ذلك مزيج الرئيسي، إضافة البادئات العشوائية، عدد من الدورات، وقت الصلب، والتخفيف قبل التضخيم. وكان كل هدف الظروف المثلى الخاصة بها، وتلك التي وصفها هنا تمثل تلك التي حققت أفضل الحد من عموما الكشف عن لوحة لدينا. وتغطي هذه اللوحة مجموعة واسعة من الأهداف المسببة للأمراض وأنواع العينات التي واجهتها في الاختبار الروتيني التشخيص البيطري، ولكن تعديلات على إجراءات preamplification قد يكون ضروريا لوحات مختلفة. وتستند هذه الظروف التضخيم الأمثل المصنعة على بروتوكول قياسي القائم على التحقيق في الوقت الحقيقي PCR مع 10 دقيقة في 95 درجة مئوية تنشيط انزيم تليها تمسخ في 95 درجة مئوية وآنإيلينغ / تمديد في 60 درجة مئوية. الاشعال وتحقيقات هي على لوحات أيضا باستخدام الظروف الأمثل الشركة المصنعة، وبالتالي لا تتطلب المعايرة مطبوعة مسبقا. الجمع بين العكسية النسخ وقبل التضخيم الخطوات لجميع العينات (بغض النظر عن نوع الهدف) من الضروري من أجل الحفاظ على الكفاءة في العمل. وجود جميع عينات عكس كتب هو أيضا مفيد لتحقيق أقصى قدر من الحساسية. وعلاوة على ذلك، واستخدام مزيج الرئيسي لPREAMP التي يتم أمثل لمثبطات تقليل يسمح براعة في الجمع بين أنواع عينة مختلفة على نفس اللوحة.
مركز السيطرة على الأمراض (CDC) فحص مصفوفة الإنفلونزا التي وصفها شو وآخرون. (7) وتكييفها هنا لردود الفعل على نطاق ونانولتر هو انفلونزا عالمي وفحص غير مناسبة لفحص عينات من البشر والحيوانات الأليفة. وقد صمم هذا البرنامج للكشف الشامل على الجينات مصفوفة من جميع فيروسات الأنفلونزا A باستخدام الجرمية نطاق ميكروليترctions. وقد تم استخدامه في جميع أنحاء العالم كجزء من لوحة الفيروسات CDC الأنفلونزا البشرية ولوحة انفلونزا الخنازير CDC. فحص EHV-1 8 تكييفها هنا بالكشف عن العوامل المسببة للأمراض في الجهاز التنفسي هاما من الخيول التي يمكن أن تسبب الإجهاض والأمراض العصبية (التي استعرضتها Pusterla وهاسي 10). أهمية التكيف مع هذه الاختبارات إلى منصة عالية الإنتاجية مع الرقابة الداخلية المستقلة الأنواع هي التي يمكن إدراجها في نهج المراقبة OneHealth. وجود كل من هذه المقايسات على الإنتاجية العالية اختبار منصة تسهيل التأهب لحالات الطوارئ للمرافق الطبية، والملاجئ، والأحداث الأداء.
وكانت النتائج المذكورة أعلاه ممثلة لجميع الأهداف التي تظهر على لوحة باستثناء الميكوبلازما cynos، والتي أظهرت قدرا أكبر بكثير من التباين في الأداء التحليلي. كان هذا الأرجح بسبب درجة الحرارة دون المستوى الأمثل ذوبان (T م) من الاشعال، الذي يجب أن يكون مثاليا 58-60 &# 176؛ ج (المثالي التحقيق تيم هو 68-70 درجة مئوية). وجود قيود على هذا المنبر هو ان الامر يستغرق وقتا أطول لتصميم وتصنيع لوحات من لترتيب تحقيقات الفردية، مما يحد من القدرة على تعديل بسرعة متواليات. الحد آخر في الوقت الحقيقي PCR بشكل عام هو عدم القدرة على الكشف عن رواية أو مسببات الأمراض غير متوقعة. ويمكن التغلب على هذه إلى حد ما من خلال تصميم فحوصات تطابق تسلسل في أنواع متعددة، ولكن منهجيات مشاركات كامل الجينوم التسلسل أساس أكثر ملاءمة لاكتشاف وكلاء الرواية. 11،12
النانو في الوقت الحقيقي PCR يسمح نموذج جديد بدلا من التركيز على الاختبار التي تعتمد الأنواع، وهو أمر مفيد للحد من تكاليف كاشف والعمل في التشخيص الجزيئي عالية الإنتاجية القائمة على متلازمة. لوحة اختبار على نطاق واسع من قبل هذا النهج يمكن أن يسهل جهود المراقبة OneHealth مثل تلك التي وصفها دان وGurfield 13 و Moutailler وآخرون. 14. جمع عينات مسحة في وقت مبكر،عادة في غضون 3 أيام من الإصابة السريرية، يوفر أفضل فرصة لتحديد وجود مسببات الأمراض في الجهاز التنفسي. ظهور الأمراض المعدية في كثير من الأحيان لا يمكن التنبؤ بها، والاختبارات التي يمكن القيام بها على الأنواع المختلفة من دون الحاجة لتعديل الكواشف هي مثالية للتأهب. من المحتمل أن تكون في pathotyping، التنميط مقاومة مضادات الميكروبات، والمزيد من لوحات التشخيص السريري على أساس متلازمة التطبيقات المستقبلية لهذه التكنولوجيا. النانو في الوقت الحقيقي PCR هو الأكثر فائدة للالسريع، وفحص عالية الإنتاجية من عدة عينة والممرض أنواع، وسوف تستكمل النهج مشاركات أو منحازة جزئيا على أساس التسلسل لتحديد مسببات الأمراض الجديدة والناشئة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد العمل على المقايسات الممرض في الجهاز التنفسي وصفها هنا من قبل صناديق التنمية الداخلية كورنيل الحيوان مركز صحة التشخيص. وقد تم تمويل تطوير النانو PCR سير العمل وما يرتبط بها من أنظمة ضمان الجودة جزئيا (FOA PA-13-244)، وأجرى بالتعاون مع مباحث إدارة الغذاء والدواء في الطب البيطري مختبر وشبكة الاستجابة (FDA الطبيب البيطري-LIRN) تحت رقم المنحة 1U18FD005144- 01. رعيت رسوم النشر بواسطة VWR وكوانتا العلوم البيولوجية. نشكر غابرييل نيكرسون، روبا Venugopalan، Veldina كامو، XiuLin تشانغ، Jinzhi يو وى هوا وانغ، وكاترينا ووكر لمساعدتهم في كتابة ومراجعة البروتوكول. نشكر مايك كارول لتصوير المقابلات المؤلف. نشكر أخيرا رئيس التحرير وثلاثة مراجعين المجهول لتعليقاتهم المفيدة.
Materials
| Zap-OGlobin II lytic reagent | Beckman Coulter | 7546138 | Optional reagent for preparing blood samples. |
| Extraction kit (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | AM1840 | Other extraction kits appropriate for the desired sample types may be substituted. This kit comes with PBS, lysis buffer, and wash buffer. |
| 2X One-Step RT-qPCR mix (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix ) | Quanta Biosciences | 95134-500 | |
| Gene-specific primer pool | IDT | custom order | Can be generated by the user or purchased with the amplification plates. |
| Random primer mix | New England Biolabs | S1330S | |
| Standard 96-well plate | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | N8010560 | This can be any plate that fits into the conventional PCR machine used. |
| Amplification master mix (OpenArray master mix) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4462164 | |
| Clear adhesive seal | Thermo-Fisher | 430611 | |
| Foil seal | Excel Scientific | AF-100 | |
| 384-well plate | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4406947 | |
| Amplification plate (QuantStudio 12K Flex OpenArray plate) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4470813 | Can be customized with any assays conforming to standard TaqMan conditions. |
| Accessories kit | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4469576 | Contains the case lids, plugs, and immersion fluid. |
| AccuFill tips | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4457246 | |
| Amplification machine (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4471090 | |
| Liquid handler (OpenArray AccuFill System) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4457243 | This is purchased with the amplification machine. |
| Primer design software (Primer Express) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4363991 | See manufacturer's instructions for detailed primer and probe specifications. |
| Image analysis program (ImageJ) | NIH | Available at http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Spreadsheet program (Excel) | Microsoft | Available at https://products.office.com/en-us/excel | |
| PCR plate spinner | VWR | 89184-608 | This device has only one speed (2500 rpm); the rotor starts when the lid is closed and stops when the button is pushed. |
| TE buffer | Millipore | 8890-100ML | 10mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 1mM Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0 |
| DMEM | Thermo-Fisher/Gibco | 11965-092 | |
| Tissue disruptor (TissueLyser II) | Qiagen | 85300 | |
| Conventional thermal cycler (Veriti) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4375786 | Any conventional thermal cycler with a heated lid can be used. |
References
- Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. Nanoliter scale PCR with TaqMan detection. Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).
- Morrison, T., et al. Nanoliter high throughput quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 34 (18), e123 (2006).
- Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J Mol Endocrinol. 29 (1), 23-39 (2002).
- McCall, M. N., et al. A benchmark for microRNA quantification algorithms using the OpenArray platform. BMC bioinformatics. 17 (1), 138 (2016).
- Pozzi, A., Previtali, C., Cenadelli, S., Gandini, L., Galli, A., Bongioni, G. Genetic traceability of cattle using an OpenArray genotyping platform. Anim Genet. 47 (1), 133-134 (2016).
- Grigorenko, E., et al. Multiplex screening for blood-borne viral, bacterial, and protozoan parasites using an OpenArray platform. J Mol Diagn. 16 (1), 136-144 (2014).
- Shu, B., et al. Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus. J Clin Microbiol. 49 (7), 2614-2619 (2011).
- Elia, G., et al. Detection of equine herpesvirus type 1 by real time PCR. J Virol Methods. 133 (1), 70-75 (2006).
- Dreier, J., Störmer, M., Kleesiek, K. Use of Bacteriophage MS2 as an Internal Control in Viral Reverse Transcription-PCR Assays. J Clin Microbiol. 43 (9), 4551-4557 (2005).
- Pusterla, N., Hussey, G. S. Equine Herpesvirus 1 Myeloencephalopathy. Vet Clin North Am Equine Pract. 30 (3), 489-506 (2014).
- Firth, C., Lipkin, W. I. The genomics of emerging pathogens. Annu Rev Genomics Hum Genet. 14, 281-300 (2013).
- Lecuit, M., Eloit, M. The potential of whole genome NGS for infectious disease diagnosis. Expert Rev Mol Diagn. 15 (12), 1517-1519 (2015).
- Dunne, G., Gurfield, N. Local Veterinary Diagnostic Laboratory, a Model for the One Health Initiative. Vet Clin North Am Small Anim Pract. 39 (2), 373-384 (2009).
- Moutailler, S., et al. Co-infection of Ticks: The Rule Rather Than the Exception. PLOS Negl Trop Dis. 10 (3), e0004539 (2016).
