Высокая пропускная способность Обнаружение респираторными патогенами в образцах животных с помощью наноразмерных ПЦР
Summary
Высокая пропускная способность тестирование ДНК и РНК возбудителей на основе ПЦР наногруппы описывается с использованием синдромный клыка и лошадиный дыхательной панели ПЦР.
Abstract
Nanoliter шкала ПЦР в реальном времени использует пространственное мультиплексирование, чтобы несколько анализов, которые будут работать параллельно на одной пластине без типичных недостатков комбинирования реакций вместе. Мы разработали и оценили панели на основе этого принципа, чтобы быстро определить наличие общих возбудителей болезней у собак и лошадей с острыми респираторными заболеваниями. Эта рукопись описывает наноразмерных диагностический рабочий процесс ПЦР для подготовки образцов, амплификации и анализа целевых последовательностей патогена, сосредоточив внимание на процедурах, которые отличаются от микролитров масштабных реакций. В дыхательной панели представлены, 18 Анализы каждый комплект в трех экземплярах, вмещающий до 48 образцов на чашку. Универсальная добыча и предварительной амплификации рабочий процесс был оптимизирован для подготовки проб с высокой пропускной способностью для размещения нескольких матриц и ДНК и РНК патогенных микроорганизмов на основе. Типичные данные представлены на одной мишени РНК (гриппа А, матрица) и одной ДНК-мишени (лошадиный вирус герпеса1). Способность быстро и точно проверить для всестороннего, синдрома на основе группы патогенов является ценным инструментом для повышения эффективности и эргономичности диагностического тестирования и острых респираторных диагностики и лечения заболеваний.
Introduction
С требованием для быстрого и всеобъемлющего определения нескольких агентов в клинической диагностике для человека и животных, одного организма молекулярные методы диагностики для выявления патогенных микроорганизмов являются обременительными, если не используется для большого количества образцов, испытываемых одной болезни. В ветеринарии контексте методики диагностики с высокой пропускной способностью, особенно важны из-за дополнительной потребности в охватывающих патогены из широкого спектра видов. OneHealth подходы к управлению болезней пищевого происхождения и формирующейся наблюдения патогена являются примерами потребностей тестирования, которые включают ряд бактерий, вирусов (ДНК или РНК на основе), паразитов и грибов. Задача объединения тестов для нескольких аналитов вместе (мультиплексирование) с целью повышения эффективности тестирования является возможной потери чувствительности и большая нагрузка для оптимизации и проверки анализов.
Nanoliter масштаба в режиме реального времени полимеразной цепной реакции (ПЦР) является альтерУроженец к практике мультиплексирования , что позволяет много отдельных реакций работать одновременно на том же образце 1. OpenArray платформа является применение этого принципа 2; он сочетает в себе технологию микрочипов с ПЦР в реальном времени. На основе концепции пространственного мультиплексирования, каждый образец проверяется на наличие большого количества мишеней в виде отдельных сквозных отверстий. Эта платформа была первоначально использовалась для связывания , цианин на основе двухцепочечной ДНК химии 2 и теперь доступен для химии зонда на основе с использованием темных закалочных зондов 3. Эта платформа была в основном использовалась для генетического профилирования в организме человека 4 и 5 животных. Недавно он был адаптирован для обнаружения ДНК и РНК патогенами через кровь по Григоренко и др. 6 с использованием процедуры двухступенчатую обратной транскрипции / предварительной амплификации (предусилитель).
Здесь мы опишем процедуру предварительного усилителя на основе один шаг для определения обоих типов возбудителей в дыхательной секretions и множество других типов образцов, которые могут быть выполнены полностью в стандартном рабочего дня. По окончании одностадийного предусилитель, образцы переносили в 384-луночный планшет, который является формат, понимаемый автоматизированной системы обработки жидкости, которая поставляется с этой наноразмерной платформы PCR. Система рисует мастер-микс и образец по всей поверхности до 4-х пластин (192 образцов и контролей) в то время. После этого процесса загрузки, мы опишем, как образцы усиливаются и проанализированы с помощью макро-таблицу, которая суммирует среднем 3 технических повторах для каждого образца / целевой комбинации в таблице, которая помещается на одной печатной странице.
был установлен единый способ анализа экстрагированной ДНК и / или РНК из образцов с использованием этой платформы. Большое разнообразие образцов были извлечены, обратной транскрипции, и предварительно усиливается в формате 96-луночного, сводя к минимуму вероятность ошибок. Респираторные испытанные образцы включали носовые тампоны, глубокие глоточные тампоны,транс-трахеи смывки, БАЛ и легочной ткани. Так как некоторые из агентов протестированных также могут присутствовать в периферической крови или кала, мы включили эти типы образцов в процедуру. Это упорядоченный документооборот помогает экономить время и ресурсы по сравнению с проведения экспериментов в нескольких пластин, обеспечивая эффективное тестирование путем выявления генов патогена и токсин панели на основе вместо индивидуального тестирования. Дыхательная панель продемонстрировала здесь было 18 анализов, каждая печатается в трех экземплярах сквозных отверстий, вмещающий до 48 образцов на чашку. Лошадиный патогенных микроорганизмов , обнаруженных включены лошадиный аденовирус 1 и 2, вирус лошадиной артериит, лошадиный вирус насморка А и В, лошадиный вирус герпеса (сверхвысокого) типов 1 и 4, и стрептококки следу. Клыка патогены включены собачьего дыхательную коронавируса (betacoronavirus), собачий вирус чумки, собачий аденовирус, собачий вирус парагриппа, собачьи пневмовируса, Bordetella bronchiseptica и Mycoplasma Cynos.универсальные гриппа были также включены анализ и внутренний контроль (MS2 РНК фага).
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта процедура была использована для рутинного тестирования респираторных патогенов в нашей лаборатории на протяжении шести месяцев (2-3 раза в неделю). Мы также имели успех, используя ту же самую процедуру для кишечно-патогенной профилирование в образцах фекалий и бактериальных изолятов на отдельно заказной пластины. После того, как пластины производятся, опытные специалисты могут выполнить шаги 2-7 в пределах одного стандартного рабочего дня. Наиболее важные шаги являются надлежащее уплотнение предусилителя пластины, перенос предусилитель с образцов между пластинами (что должно быть сделано быстро, чтобы предотвратить испарение), и окончательное покрытие усилительной пластины. Использование макросов электронной таблицы в качестве руководства для анализа результатов проверки (кривые для образцов и контролей) также критично, как это значительно сократило количество времени и документов, необходимых для этого процесса. Предоставленный макросов с электронными таблицами является примером; он должен был бы быть изменен или воссозданы для пластин с различными конфигурациями. Это легко может быть реrformed кем-то с базовыми знаниями с электронными таблицами.
Из-за очень небольшого количества образца погрузили на усилительной пластине (33 NL), требуется предварительной амплификации. В оптимизации этого протокола (не показан), мы сравнили ряд параметров предусплением включая мастер-смеси, добавление случайных праймеров, числа циклов, времени отжига и разбавления до амплификации. Каждая цель имеет свои собственные оптимальные условия, и те, которые описаны здесь, представляют собой те, которые дали наилучший предел обнаружения для целом нашей панели. Эта панель охватывает широкий спектр патогенных мишеней и типов образцов, которые встречаются в повседневной ветеринарной диагностической проверки, но модификации процедур предусилением могут быть необходимы для различных панелей. Производитель-оптимизированные условия амплификации на основе стандартного зонда на основе реального времени протокола ПЦР с 10 мин при 95 ° C активации ферментов с последующей денатурации при 95 ° С и аппИлинга / удлинение при 60 ° С. Праймеры и зонды с предварительно напечатанной на пластинах также с использованием условий изготовителем оптимизированы и, следовательно, не требуют титрование. Сочетание обратной транскрипции и предварительной амплификации шаги для всех образцов (вне зависимости от типа мишени) было необходимо для того, чтобы сохранить эффективность в рабочем процессе. Имея все образцы обратной транскрипции также полезно для максимизации чувствительности. Кроме того, использование мастер-микс для предусилителя, который оптимизирован для минимизации ингибиторов позволяет гибкость в сочетании различных типов образцов на той же пластинке.
Центр по контролю и профилактике заболеваний (CDC) матрицы гриппа анализа , описанного Shu и др. 7 и адаптированной здесь nanoliter масштабных реакций является универсальным гриппа анализ , который подходит для тестирования образцов от людей и домашних животных. Она была разработана для универсального обнаружения матричного гена всех вирусов гриппа А с использованием микролитр масштаба Reactions. Он был использован во всем мире как часть вируса панели CDC гриппа человека и гриппа группы экспертов CDC Свиньи. СВН-1 тест 8 приспособлен здесь обнаруживает важную респираторный патоген лошадей , которые могут вызвать выкидыши и неврологическое заболевание (обзор Pusterla и Хасси 10). Значение адаптации этих тестов к высокой пропускной способности платформы с видами, независимый от внутреннего контроля является то, что они могут быть включены в подход OneHealth наблюдения. Наличие обоих этих анализов на платформе тестирования с высокой пропускной способностью будет способствовать готовности к чрезвычайным ситуациям для клинических учреждений, приютов и событий производительности.
Описанные выше результаты были репрезентативными для всех целей на плите за исключением Mycoplasma собакоподобных обезьян, который показал значительно больший разброс в аналитической деятельности. Это, вероятно , связано с неоптимальной температурой плавления (Т м) праймеров, которые в идеале должны быть 58-60 &# 176; С (идеальный зонд Тт 68-70 ° С). Ограничение этой платформы является то, что она занимает больше времени, чтобы спроектировать и изготовить пластины, чем для заказа отдельных зондов, что ограничивает возможность быстро изменять последовательности. Другим ограничением ПЦР в реальном времени в целом является неспособность обнаружить роман или неожиданные патогены. Эту проблему можно решить в некоторой степени путем разработки анализов , которые соответствуют последовательности в нескольких видов, но Несмещенные методологии , основанные целом секвенирование генома больше подходят для открытия новых препаратов. 11,12
Наномасштабная ПЦР в реальном времени позволяет новую парадигму синдрома на основе, а не на основе видов тестирования, что полезно для снижения расходов реагентов и рабочей силы в высокой пропускной способности молекулярной диагностики. Масштабное тестирование панели с помощью такого подхода может способствовать OneHealth усилия наблюдения , например, те , которые описаны Данна и Gurfield 13 и Moutailler и др. 14. Сбор образцов мазков рано,как правило, в течение 3 дней клинического начала, обеспечивает лучший шанс определить наличие респираторных патогенов. Инфекционное заболевание, появление часто непредсказуемо, и тесты, которые могут быть выполнены на различных видах без необходимости модификации реагентов являются идеальными для обеспечения готовности. Будущие приложения этой технологии, вероятно, будут в pathotyping, антимикробной резистентности, профилирование и дальнейшего синдрома на основе клинико-диагностических панелей. Наномасштабная ПЦР в реальном времени является наиболее полезным для быстрого, высокопроизводительного скрининга множественных образцов и возбудителем типов, и будет дополняться объективными или частично смещенных секвенирования на основе подходов для выявления новых и возникающих патогенных микроорганизмов.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа на анализах респираторных патогенов, описанных здесь, была поддержана Cornell Animal Health диагностический центр фондов внутреннего развития. Разработка наноуровне ПЦР рабочих процессов и связанных с ними систем обеспечения качества частично финансировалась (FOA PA-13-244) и осуществляется в сотрудничестве с Продовольственной и лекарствами администрации ветеринарной лаборатории расследований и ответных мер (FDA Vet-LIRN) под грант № 1U18FD005144- 01. Платы публикации спонсировал VWR и Quanta Biosciences. Мы благодарим Габриэль Никерсон, Roopa Венугопалана, Veldina Camo, XiuLin Чжан, Jinzhi Ю, Weihua Ван, и Катрина Уокер за их помощь в написании и пересмотра протокола. Мы благодарим Mike Carroll для съемок интервью автора. Мы, наконец, поблагодарить редактора и три анонимных рецензентов за их полезные замечания.
Materials
| Zap-OGlobin II lytic reagent | Beckman Coulter | 7546138 | Optional reagent for preparing blood samples. |
| Extraction kit (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | AM1840 | Other extraction kits appropriate for the desired sample types may be substituted. This kit comes with PBS, lysis buffer, and wash buffer. |
| 2X One-Step RT-qPCR mix (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix ) | Quanta Biosciences | 95134-500 | |
| Gene-specific primer pool | IDT | custom order | Can be generated by the user or purchased with the amplification plates. |
| Random primer mix | New England Biolabs | S1330S | |
| Standard 96-well plate | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | N8010560 | This can be any plate that fits into the conventional PCR machine used. |
| Amplification master mix (OpenArray master mix) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4462164 | |
| Clear adhesive seal | Thermo-Fisher | 430611 | |
| Foil seal | Excel Scientific | AF-100 | |
| 384-well plate | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4406947 | |
| Amplification plate (QuantStudio 12K Flex OpenArray plate) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4470813 | Can be customized with any assays conforming to standard TaqMan conditions. |
| Accessories kit | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4469576 | Contains the case lids, plugs, and immersion fluid. |
| AccuFill tips | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4457246 | |
| Amplification machine (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4471090 | |
| Liquid handler (OpenArray AccuFill System) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4457243 | This is purchased with the amplification machine. |
| Primer design software (Primer Express) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4363991 | See manufacturer's instructions for detailed primer and probe specifications. |
| Image analysis program (ImageJ) | NIH | Available at http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Spreadsheet program (Excel) | Microsoft | Available at https://products.office.com/en-us/excel | |
| PCR plate spinner | VWR | 89184-608 | This device has only one speed (2500 rpm); the rotor starts when the lid is closed and stops when the button is pushed. |
| TE buffer | Millipore | 8890-100ML | 10mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 1mM Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0 |
| DMEM | Thermo-Fisher/Gibco | 11965-092 | |
| Tissue disruptor (TissueLyser II) | Qiagen | 85300 | |
| Conventional thermal cycler (Veriti) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4375786 | Any conventional thermal cycler with a heated lid can be used. |
References
- Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. Nanoliter scale PCR with TaqMan detection. Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).
- Morrison, T., et al. Nanoliter high throughput quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 34 (18), e123 (2006).
- Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J Mol Endocrinol. 29 (1), 23-39 (2002).
- McCall, M. N., et al. A benchmark for microRNA quantification algorithms using the OpenArray platform. BMC bioinformatics. 17 (1), 138 (2016).
- Pozzi, A., Previtali, C., Cenadelli, S., Gandini, L., Galli, A., Bongioni, G. Genetic traceability of cattle using an OpenArray genotyping platform. Anim Genet. 47 (1), 133-134 (2016).
- Grigorenko, E., et al. Multiplex screening for blood-borne viral, bacterial, and protozoan parasites using an OpenArray platform. J Mol Diagn. 16 (1), 136-144 (2014).
- Shu, B., et al. Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus. J Clin Microbiol. 49 (7), 2614-2619 (2011).
- Elia, G., et al. Detection of equine herpesvirus type 1 by real time PCR. J Virol Methods. 133 (1), 70-75 (2006).
- Dreier, J., Störmer, M., Kleesiek, K. Use of Bacteriophage MS2 as an Internal Control in Viral Reverse Transcription-PCR Assays. J Clin Microbiol. 43 (9), 4551-4557 (2005).
- Pusterla, N., Hussey, G. S. Equine Herpesvirus 1 Myeloencephalopathy. Vet Clin North Am Equine Pract. 30 (3), 489-506 (2014).
- Firth, C., Lipkin, W. I. The genomics of emerging pathogens. Annu Rev Genomics Hum Genet. 14, 281-300 (2013).
- Lecuit, M., Eloit, M. The potential of whole genome NGS for infectious disease diagnosis. Expert Rev Mol Diagn. 15 (12), 1517-1519 (2015).
- Dunne, G., Gurfield, N. Local Veterinary Diagnostic Laboratory, a Model for the One Health Initiative. Vet Clin North Am Small Anim Pract. 39 (2), 373-384 (2009).
- Moutailler, S., et al. Co-infection of Ticks: The Rule Rather Than the Exception. PLOS Negl Trop Dis. 10 (3), e0004539 (2016).
