Detecção de alto rendimento de patógenos respiratórios em espécimes animais por Nanoscale PCR
Summary
testes de alto rendimento de DNA e RNA patógenos base por nanoescala PCR é descrito usando um canino sindrômica e painel de PCR respiratória equina.
Abstract
escala nanoliter PCR em tempo real usa multiplexação espacial para permitir que vários ensaios para ser executado em paralelo em uma única chapa, sem os inconvenientes típicos de combinação de reações juntos. Nós projetamos e avaliou um painel com base nesse princípio para identificar rapidamente a presença de agentes de doenças comuns em cães e cavalos com doença respiratória aguda. Este manuscrito descreve um fluxo de trabalho PCR de diagnóstico nanoescala para preparação de amostras, amplificação e análise de sequências alvo de patógenos, com foco em procedimentos que são diferentes das reações escala microlitro. No painel respiratória apresentados, 18 ensaios foram, cada um configurado em triplicado, com capacidade para até 48 amostras por placa. Um fluxo de trabalho de extração e pré-amplificação universal foi otimizado para preparação de amostras de alto rendimento para acomodar vários matrizes e DNA e RNA patógenos base. Os dados representativos são apresentados para um alvo de ARN (influenza A matriz) e um alvo de ADN (herpesvírus equino1). A capacidade de testar com rapidez e precisão para um grupo abrangente, baseada em síndrome de patógenos é uma ferramenta valiosa para melhorar a eficiência e ergonomia de testes de diagnóstico e para o diagnóstico de doença respiratória aguda e gestão.
Introduction
Com a demanda para a detecção rápida e abrangente de múltiplos agentes em diagnósticos clínicos para seres humanos e animais, um único organismo métodos diagnósticos moleculares para detecção de patógenos são pesados a menos que usado para o grande número de amostras a ser testado para uma única doença. No contexto veterinário, metodologias de diagnóstico de elevado rendimento, são particularmente importantes devido à necessidade adicional para cobrir agentes patogénicos a partir de uma grande variedade de espécies. OneHealth abordagens para a gestão de doenças de origem alimentar e vigilância patógeno emergente são exemplos de necessidades de testes que incluem um número de bactérias, vírus (DNA ou RNA base), parasitas e fungos. O desafio de combinação de testes para vários analitos juntos (multiplexação), a fim de melhorar a eficiência do teste é uma possível perda de sensibilidade e um grande fardo para a otimização e validação de ensaios.
escala nanoliter em tempo real, reação em cadeia da polimerase (PCR) é um alternativo para a prática de multiplexagem que permite muitas reacções separadas para executar simultaneamente na mesma amostra 1. A plataforma OpenArray é uma aplicação deste princípio 2; que combina a tecnologia de microarray com PCR em tempo real. Com base no conceito de multiplexagem espacial, cada amostra é testada para um grande número de alvos em separado por meio de furos de passagem. Esta plataforma foi inicialmente utilizada com a ligação de ADN de cadeia dupla baseada cyanine química 2 e está agora disponível para a química à base de sonda utilizando sondas de extinção escuros 3. Esta plataforma tem sido principalmente utilizado para a caracterização genética em seres humanos e animais 4 5. Recentemente, foi adaptado para a detecção de ADN e ARN agentes patogénicos contidos no sangue por Grigorenko et ai. 6, utilizando um procedimento em dois passos de transcrição reversa / amplificação pré-(pré- amplificador).
Descrevemos aqui um procedimento baseado em pré-amplificador de um passo para a detecção de ambos os tipos de patógenos no sec respiratóriaretions e uma variedade de outros tipos de amostras que podem ser realizados inteiramente em um dia de trabalho normal. Após a conclusão do pré-amplificador de um-passo, as amostras são transferidas para uma placa de 384 poços, que é o formato aceite pelo sistema de manuseamento de líquidos automatizado que vem com este nanoescala plataforma de PCR. O sistema desenha a mistura principal e a amostra através da superfície de até quatro placas (192) amostras e controlos de cada vez. Na sequência deste processo de carregamento, nós descrevemos como amostras são amplificados e analisados utilizando uma planilha macro que resume a média de 3 repetições técnicos para cada combinação de amostra / target em uma tabela que se encaixa em uma página impressa.
Um método comum para a análise de ADN extraído e / ou de ARN a partir de amostras usando esta plataforma foi estabelecida. Uma grande variedade de amostras foram extraídas, sujeitos a transcrição reversa, e pré-amplificado num formato de 96 poços, minimizando o potencial de erros. amostras respiratórias testadas incluíram swab nasal, compressas faringe profundas,lavagens trans-traqueal, lavado broncoalveolar e tecido pulmonar. Uma vez que alguns dos agentes testados podem também estar presentes no sangue periférico ou fezes, que incorporou os tipos de amostras para o processo. Este fluxo de trabalho simplificado ajuda a economizar tempo e recursos em relação à execução experimentos em várias placas, permitindo testes eficiente através da detecção do gene patógeno e toxina à base de painel no lugar do teste individual. O painel respiratória demonstrado aqui teve 18 ensaios de cada um impresso em triplicado através de furos, com capacidade para até 48 amostras por placa. Os patógenos equinos detectados incluídos adenovírus eqüino 1 e 2, vírus da arterite equina, vírus da rinite equina A e B, vírus de herpes equina tipos (MAT) 1 e 4, e Streptococcus equi. Os agentes patogénicos caninos incluídos coronavírus canino respiratória (betacoronavirus), vírus da cinomose canina, adenovírus canino, vírus parainfluenza canina, pneumovírus canino, Bordetella bronchiseptica e Mycoplasma cynos. UMAUm ensaio universal da gripe e um controlo interno (MS2 ARN fago) também foram incluídos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este procedimento foi utilizado para testes de rotina de agentes patogénicos respiratórios no nosso laboratório, ao longo de seis meses (2-3 vezes por semana). Nós também tivemos sucesso usando o mesmo procedimento para criação de perfis de patógenos entéricos em amostras fecais e bactérias isoladas em um prato personalizado separadamente. Uma vez que as placas são produzidas, a equipe experiente pode completar as etapas 2-7 no prazo de um dia de trabalho normal. Os passos mais críticos são a vedação adequada da placa pré-amplificador, a transferência das amostras entre as placas pré-amplificado (que deve ser feito rapidamente para evitar a evaporação), e o revestimento final da placa de amplificação. Utilização da folha de cálculo macro como um guia para a análise dos resultados (verificação curvas para as amostras e controlos) foi também crítica que reduziu significativamente a quantidade de tempo e papelada necessária para este processo. A planilha macro fornecida é um exemplo; ele precisaria ser modificado ou re-criada para placas com diferentes configurações. Isso pode facilmente ser performed por alguém com conhecimento básico de planilha.
Devido à quantidade muito pequena de amostra carregada na placa de amplificação (33 nl), a pré-amplificação é necessária. Na optimização deste protocolo (não mostrado), comparou-se um número de parâmetros de Pré-amplificação, incluindo a mistura principal, a adição de iniciadores aleatórios, número de ciclos, o tempo de recozimento, e a diluição antes da amplificação. Cada alvo tinha suas próprias condições ideais, e os descritos aqui representam aquelas que produziram o melhor limite de detecção geral para o nosso painel. Este painel abrange uma ampla gama de alvos patogénicos e tipos de amostras que são encontrados nos testes de diagnóstico veterinário de rotina, mas na modificação dos procedimentos Pré-amplificação podem ser necessários para diferentes painéis. As condições de amplificação optimizado pelo fabricante baseiam-se num tempo real protocolo de PCR com base em sonda com um padrão de 10 min a 95 C de activação de enzimas ° seguido de desnaturação a 95 ° C e AnnEaling / extensão a 60 ° C. Os iniciadores e as sondas são pré-impresso sobre as placas também utilizando condições optimizadas pelo fabricante e, portanto, não necessitam de titulação. A combinação dos passos de transcrição reversa e de pré-amplificação de todas as amostras (independentemente do tipo de alvo) foi necessário a fim de manter a eficiência do fluxo de trabalho. Tendo em todas as amostras de transcrição reversa também é benéfico para maximizar a sensibilidade. Além disso, o uso de uma mistura principal para o pré-amplificador que é otimizado para inibidores minimizando permite versatilidade na combinação de diferentes tipos de amostras na mesma placa.
O Center for Disease Control (CDC) ensaio de matriz de influenza descrito por Shu et al. 7 e adaptado aqui para reações escala nanoliter é uma gripe universal Um ensaio que é apropriado para testar amostras de seres humanos e animais de companhia. Ele foi projetado para a detecção universal do gene matriz de todos os vírus da gripe A utilizando rea escala microlitroficções. Ela tem sido usada em todo o mundo como parte de um painel de vírus CDC Influenza Humana e um Painel de gripe suína CDC. O ensaio 8 EHV-1 adaptada aqui detecta um importante patógeno respiratório de cavalos que podem causar abortos e doença neurológica (revisado por Pusterla e Hussey 10). O significado de se adaptar estes ensaios a uma plataforma de alto rendimento com um controlo interno independente da espécie é que eles podem ser incorporados em uma abordagem de vigilância OneHealth. Tendo ambos os ensaios em uma plataforma de testes de alto rendimento irá facilitar a preparação para emergências em instalações clínicas, abrigos e eventos de desempenho.
Os resultados descritos acima foram representativas de todos os alvos na placa com a excepção de Mycoplasma cynos, que mostraram consideravelmente mais variação no desempenho analítico. Isto era provavelmente devido à temperatura sub-óptima de fusão (T m) dos iniciadores, o que deve ser idealmente de 58-60 &# 176; C (a sonda Tm ideal é 68-70 ° C). Uma limitação desta plataforma é que ela leva mais tempo para projetar e fabricar as placas do que para encomendar sondas individuais, o que limita a capacidade de modificar rapidamente sequências. Outra limitação de PCR em tempo real, em geral, é a incapacidade de detectar novos agentes patogénicos ou inesperados. Isto pode ser ultrapassado, em certa medida através da concepção de ensaios que correspondem a sequências em várias espécies, mas metodologias baseadas inteiro de sequenciamento do genoma imparciais são mais adequados para a descoberta de novos agentes 11,12.
Nanoescala PCR em tempo real permite que um novo paradigma para, em vez de testes de espécies baseada, que é útil para reduzir o custo dos reagentes e trabalhistas em diagnóstico molecular de alto rendimento à base de síndrome. Testes de painel em grande escala por esta abordagem pode facilitar os esforços de vigilância OneHealth tais como os descritos por Dunne e Gurfield 13 e Moutailler et al. 14. Recolha de amostras de esfregaço cedo,geralmente dentro de 3 dias do início clínico, proporciona a melhor oportunidade para identificar a presença de patógenos respiratórios. Infecciosa surgimento da doença é muitas vezes imprevisível, e testes que podem ser realizados em espécies diferentes sem a necessidade de modificação de reagentes são ideais para a preparação. As aplicações futuras desta tecnologia são susceptíveis de estar em tipagem patogénica, de perfis de resistência antimicrobiana, e outros painéis à base de diagnósticos clínicos da síndrome. Nanoescala PCR em tempo real é mais útil para uma rápida triagem, de alto rendimento de vários tipos de amostras e de agentes patogénicos, e serão complementadas com abordagens baseadas em seqüenciamento imparciais ou parcialmente tendenciosos para identificar novas e emergentes patógenos.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho sobre os ensaios de patógenos respiratórios descritos aqui foi apoiado por fundos de desenvolvimento interno Cornell Centro de Diagnóstico de Saúde Animal. Desenvolvimento da nanoescala fluxo de trabalho PCR e sistemas de garantia de qualidade associados foi parcialmente financiado (FOA PA-13-244) e realizado em colaboração com o Laboratório de Investigação Veterinária da Food and Drug Administration e Response Network (FDA Vet-LIRN), Grant No. 1U18FD005144- 01. As taxas de publicação foram patrocinados pela VWR e Quanta Biosciences. Agradecemos Gabrielle Nickerson, Roopa Venugopalan, Veldina Camo, Xiulin Zhang, Jinzhi Yu, Weihua Wang, e Katrina Walker para a sua assistência com a escrita e revisão do protocolo. Agradecemos a Mike Carroll para filmar as entrevistas do autor. Nós finalmente agradecer ao editor e três revisores anônimos por seus comentários.
Materials
| Zap-OGlobin II lytic reagent | Beckman Coulter | 7546138 | Optional reagent for preparing blood samples. |
| Extraction kit (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | AM1840 | Other extraction kits appropriate for the desired sample types may be substituted. This kit comes with PBS, lysis buffer, and wash buffer. |
| 2X One-Step RT-qPCR mix (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix ) | Quanta Biosciences | 95134-500 | |
| Gene-specific primer pool | IDT | custom order | Can be generated by the user or purchased with the amplification plates. |
| Random primer mix | New England Biolabs | S1330S | |
| Standard 96-well plate | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | N8010560 | This can be any plate that fits into the conventional PCR machine used. |
| Amplification master mix (OpenArray master mix) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4462164 | |
| Clear adhesive seal | Thermo-Fisher | 430611 | |
| Foil seal | Excel Scientific | AF-100 | |
| 384-well plate | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4406947 | |
| Amplification plate (QuantStudio 12K Flex OpenArray plate) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4470813 | Can be customized with any assays conforming to standard TaqMan conditions. |
| Accessories kit | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4469576 | Contains the case lids, plugs, and immersion fluid. |
| AccuFill tips | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4457246 | |
| Amplification machine (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4471090 | |
| Liquid handler (OpenArray AccuFill System) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4457243 | This is purchased with the amplification machine. |
| Primer design software (Primer Express) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4363991 | See manufacturer's instructions for detailed primer and probe specifications. |
| Image analysis program (ImageJ) | NIH | Available at http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Spreadsheet program (Excel) | Microsoft | Available at https://products.office.com/en-us/excel | |
| PCR plate spinner | VWR | 89184-608 | This device has only one speed (2500 rpm); the rotor starts when the lid is closed and stops when the button is pushed. |
| TE buffer | Millipore | 8890-100ML | 10mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 1mM Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0 |
| DMEM | Thermo-Fisher/Gibco | 11965-092 | |
| Tissue disruptor (TissueLyser II) | Qiagen | 85300 | |
| Conventional thermal cycler (Veriti) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4375786 | Any conventional thermal cycler with a heated lid can be used. |
References
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