High-throughput detectie van respiratoire pathogene in dierlijke specimens door nanoschaal PCR

Geen menselijke proefpersonen of proefdieren werden gebruikt voor de ontwikkeling van dit protocol. Controles werden gegenereerd door zuivering van sequentie bevestigde amplicons en in vitro transcriptie van RNA targets. Klinische monsters werden voor routinematige diagnostische testen om de Cornell Animal Health Diagnostisch Centrum ingediend. 1. Ontwerp van de Plaat Gebruik primer design software om te controleren of elke test voldoet aan de standaard-probe op basis van real-time PCR cycling omstandigheden met 60 ° C gloeien met behulp van de primer probe test tool (selecteer de kwantificering sonde instelling met standaard parameters). Opmerking: De representatieve RNA doelwit gebruikt werd aangepast van de universele influenza A matrix gerichte assay gepubliceerd door Shu et al 7.. De primers en de probe zijn als volgt: Forward primer: GACCRATCCTGTCACCTCTGAC, Reverse Primer: AGGGCATTYTGGACAAAKCGTCTA, Probe: Fam-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-QSY. De vertegenwoordiger van de DNA-test die hier gebruikt werd weer aangepastben het soort paarden herpesvirus 1 (EHV-1) detectiemethode gepubliceerd door Elia et al. 8. De primers en de probe zijn als volgt: Forward primer: GCTCTCAGGTTTTACGACATC, Reverse Primer: CTTTACCCAGGCCCTTGAAA, Probe: FAM-TCAACGTGGACAATACCGCAGTGATTAT-QSY. Bestellen nanoschaal PCR amplificatie platen in de gewenste configuratie. OPMERKING: Voor deze studie werd de 18×3 genexpressie formaat gebruikt (tabel 1). Verschaffen sequenties voor primers en probes (of geïnventariseerd assay ID's) voor elk dier waarvoor de fabrikant. 2. Nucleic Acid Extraction Extract totale nucleïnezuur (DNA en RNA) van elke gewenste werkwijze. LET OP: Een geautomatiseerde magnetische bead-based extractie kit werd hier gebruikt volgens de instructies van de fabrikant (zie de materialen tabel voor meer details). Bereid monsters als volgt: Maak de buitenkant van elk monster container met 10% bleekwater en afdrogen. Veeg gehandschoende finger tips met 10% bleekwater tussen monsters om kruisbesmetting te voorkomen. Plaats nasale faryngeale of diep swabs in een steriele, gesloten flesje (bijvoorbeeld een rode top bloedafnamebuis) met enkele druppels zoutoplossing toegevoegd om uitdroging vóór verwerking. LET OP: katoen, plastic, hout-behandeld, en Dacron en andere synthetische swabs zijn allemaal aanvaardbaar, maar vermijd calciumalginaat swabs. Voor swabs en trachea wast, voeg Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), zodat er ten minste 1-2 ml vloeistof. Vortex het staafje en DMEM krachtig in de buis. Gebruik vervolgens een pipet ongeveer 1 ml medium overbrengen naar een nieuwe buis. Mechanisch Lyse weefsels (100-200 mg in 1 ml DMEM) met een tissue disruptor volgens de instructies van de fabrikant gevolgd door centrifugatie gedurende 3 min bij 825 x g. Transfer 500 pi van het supernatant naar een nieuwe buis. Voor uitwerpselen Combineer 400 mg feces met 800 gl 1 x met fosfaat gebufferde salijn pH 7,4 (PBS). Vortex de suspensie gedurende 1 min of meer tot het monster gehomogeniseerd of volledig onderbroken. Eenmaal gehomogeniseerd, centrifuge de suspensie gedurende 10 min bij 18.000 xg, vervolgens over 400 ul naar een nieuwe buis. Voor de hele uncoagulated bloed, vortex het monster en een 250 ul aliquot. Voeg zes druppels lytisch reagens en vortex te mengen. Incubeer 15 min bij 37 ° C. Bereid lysis en wassen buffers volgens de instructies van de fabrikant. Voeg MS2-faag of een interne controle van de keuze om de lysisbuffer als een interne positieve extractie controle 9. Voeg 235 ul lysis buffer en 175 gl monster (of PBS negatieve controle) aan elke kraal buis. Ga verder met het protocol van de fabrikant. LET OP: Gezuiverd totaal nucleïnezuur werd hier geëlueerd in 90 pi. 3. Reverse transcriptie / Pre-amplificatie (voorversterker) LET OP: Houd alle reagentia en samples gebruikt inde voorversterker reactie op ijs te allen tijde. Na voorversterker, houden alle reagentia bij kamertemperatuur. Assembleren geëlueerde DNA en / of RNA, PCR Reaction Mix, nuclease-vrij water als negatieve controle, en samengevoegd normen voor de positieve controle-amplificatie. LET OP: Tot 48 monsters kunnen worden uitgevoerd op een versterking plaat inclusief controles (ten minste één negatieve extractie besturing voor elke extractie plaat waaruit monsters worden getrokken). Druk een sample kaart. Laat een tweede persoon te controleren of de kaart en voorbeeld lay-out wedstrijd. In een 1,5 ml tube, het volgende toevoegen aan de voorversterker master mix voor te bereiden. LET OP: Een laatste volume van 14 ul werd gebruikt hier. Voeg een pool van voorgemengde primers van elk doel, zodat de uiteindelijke concentratie van elke primer 900 nM. LET OP: Het zwembad hier gebruikt werd bereid bij een 10x concentratie, en 1,4 pl toegevoegd per reactie. Voeg willekeurige primers tot een uiteindelijke concentratie van 600 nM of 0,1x. </li> Add 2x RT-qPCR mix helft van het eindvolume (7 pi hier). Meng de master mix componenten met elkaar door voorzichtig vortexen en te stoppen met draaien. Voer de voorversterker in een standaard 96-putjesplaat met de linker zijde van de plaat alleen (kolommen 1-6). Voeg 8,5 gl voorversterker hoofdmengsel en 5,5 pl DNA / RNA-monster aan elk putje. Na het combineren van alle reagentia (monsters positieve controles en negatieve controles voorversterker mix), grondig sluit de standaard 96-putjesplaat namelijk kleefband. Verwijder overtollig afdichting met behulp van een scheermesje om de vorming van afdichting gaten tijdens het fietsen te voorkomen. Centrifugeer de verzegelde plaat gedurende 20 seconden met behulp van een PCR-plaat spinner. Controleer alle reagentia worden gecombineerd in de bodem van de putjes. Run de voorversterker assay op een gebruikelijke thermocycler onder de volgende omstandigheden: 15 min bij 50 ° C; 1 min bij 95 ° C; 20 cycli van 15 sec bij 95 ° C, daarna 2 minuten bij 60 ° C; 99,9 & #176; C gedurende 10 min; houden op 4 ° C. Programma deze voorwaarden voorafgaand aan het starten. Zet de conventionele thermocycler, selecteert u de voorversterker fietsen programma en start het programma. Plaats de 96-wells plaat in de thermocycler wanneer het onderste gedeelte van de thermocycler (niet kaft) de temperatuur die nodig is voor de productie van cDNA (50 ° C) door de temperatuur lezen op het scherm bereikt. Daarvoor houden de plaat koud het risico van het produceren van vals positieve resultaten te minimaliseren. Zodra de voorversterker run is voltooid, controleert u of de plaat is gebleven verzegeld. Gaat u direct naar stap 4.1. Om deze plaat 's nachts op te slaan, voert u de verwatering, zoals beschreven in de stappen 4,2-4,5, behalve in plaats van los die de plaat, sluit de plaat met een duidelijke kleefband en plaats binnen een rits-lock zakje, opgeslagen bij 4 ° C. 4. Verwatering van voorversterker Plate Verwijder het juiste aantal amplificatie platen weerm de vriezer (maximaal 4 kunnen worden uitgevoerd in een keer). Laat het verpakkingsmateriaal niet openen. Laat de plaat opwarmen gedurende tenminste 15 minuten bij kamertemperatuur. Noteer het serienummer en het lotnummer van de plaat. OPMERKING: Ongeopende platen kunnen bij kamertemperatuur gedurende maximum 24 uur, maar voor de beste praktijken, verwijder deze uit de vriezer niet meer dan 30 minuten voor nodig. Centrifugeer de voltooide voorversterker plaat gedurende 20 seconden met behulp van de PCR-plaat spinner. Zet de versterking apparaat en de computer en start het bijbehorende programma. Verwijder alle overbodige items uit een PCR-setup omgeving. Doe dubbele handschoenen en mouw covers. Verwijder de afdichting van de voorversterker bord en verwijder voorzichtig en gooi de buitenste handschoenen. Verdun de voorversterker producten bij 1: 5 door toevoeging van 56 ui TE-buffer aan elk putje kolommen 1-6 van de 96-well plaat voorversterker en mengen door en neer te pipetteren. Alleen naar de eerste halte van de pipet, opzuigen van de bodem en het doseren hoger, maar niet het creëren vanbubbels. Voeg TE-buffer om alle 6 kolommen, ongeacht de gebruikte bronnen. Verzegelt de plaat met ofwel een doorzichtige tape of folie afdichting en centrifugeren het voor 20 sec met behulp van de PCR-plaat spinner. Stel deze plaat opzij (losjes overdekt) tot stap 6.1 is voltooid. Gooi resterende handschoenen en mouw covers. 5. Voorbereiding voor 384-wells Transfer naar Amplification Plate Het opzetten van de materialen die nodig zijn om te dekken en sluit de versterking plaat: deksel, stop, spuit onderdompeling vloeistof, plaat pers, ethanol squirt fles, en niet-pluizende laboratorium doekjes. Verwijder de dop van de injectiespuit en zet een kleine plastic tip op de spuit (vereist kracht). Eject een kleine hoeveelheid van de onderdompeling vloeistof op een papieren handdoek om lucht opbouw te verwijderen (het is ok als enkele kleine luchtbelletjes in de top te blijven). Gebruik de immersievloeistof binnen 60 minuten van het verwijderen van de spuit uit de vacuüm aluminiumzak. Zodra een spuit wordt geopend, niet plaats de kap voor later gebruik. checkdat de afvalbak van de plaat laden vloeistof handler is leeg en open de doos van de tips. Schrijf de vervaldatum van de tips op het puntje deksel wanneer er een nieuwe doos wordt geopend, en ervoor zorgen dat de uiteinden niet verstreken. Zet de vloeistof handler en de computer en open de vloeistof handler software, die een zelftest zal uitvoeren. Klik op "Setup en Load". Klik op "Browse" om het CSV-bestand gemaakt op basis van de Sample Tracker software te selecteren. Als het bestand niet wordt weergegeven, ga naar "Instrument Preferences / Edit" en vervolgens op "Change" door "Sample Plate Folder File". Selecteer de map waarin het csv-bestand wordt opgeslagen. Klik vervolgens op "Setup en Load", dan "Bladeren" en selecteer het bestand. Vervolgens klikt u op "Browse" naast de "Plate Holder Stand 1" en selecteer het TPF bestand (verstrekt door de fabrikant) dat hetzelfde serienummer als de plaat. 6. Liquid Handler Transfer Opmerking: Begin niet fivullen van de 384-well plaat tot alle bovenstaande stappen zijn voltooid. Verdamping is een punt van zorg met kleine volumes – laat niet de 384-wells plaat zitten ontdekt met vloeistof in. Nadat alle bovenstaande stappen zijn voltooid gezet op nieuwe, goed ingerichte dubbele handschoenen en mouw dekt. Voeg vervolgens 2,5 ul van versterking master mix van een 384-wells plaat. Transfer 2.5 ul van verdund voorversterker product aan de 384-wells plaat volgens de kaart in tabel 2 en onmiddellijk de plaat te dekken goed af met een folie afdichting. Gooi buitenste handschoenen en mouw covers. Centrifuge de 384-wells plaat gedurende 20 seconden in de PCR-plaat spinner. Verwijder de folie afdichting, maar plaatst u de 384-wells plaat in de vloeistof handler. Open het pakket met een ingepakt versterking bord en plaats deze voorzichtig in de vloeistof handler in de eerste sleuf met het serienummer op de rechter – in het bezit van de zaak door de randen zonder het aanraken van het oppervlak of de plaat. Gebruik ongeopende platen binnen een uur na opening. Opmerking: Het doel van de behuizing is aan de plaat te beschermen tegen aanraking, aangezien de kleine hoeveelheid primers en probes in de doorgaande openingen kunnen verstoren. Verwijder de folie afdichting van de 384-wells plaat in de vloeistof handler een keer alles op zijn plaats. Klik op Volgende en controleer vervolgens alle vakken als elke stap is voltooid. Klik op OK om de run te starten. Sluit de deur om de vloeistofmanipulator en geeft de vulproces beginnen. Blijven naast de vloeistofmanipulator en onmiddellijk naar de volgende stap nadat de plaat gevuld. Terwijl de vloeistofmanipulator loopt, verwijdert de beschermende laag van de bodem van een kofferdeksel. Opmerking: het kleefmiddel aan de onderkant van het kofferdeksel onder een rode band en een beschermende film. De film dient eerst om de rompslomp te verwijderen. Laat de bovenste laag in plaats totdat stap 6.15. Prime de administratieve rompslomp door iets te trekken naar release uit de lijm. Verwijder de geladen (gevulde) versterking plaat uit de vloeistof handler en voorzichtig plaats deze in de plaat pers met het serienummer aan de rechterkant. Plaats het deksel bovenop de plaat met de ingekeepte einde rechts en lijm aan de onderzijde (richting van de plaat). Trek op de plaat pers hendel zorgvuldig te sluiten; het licht knippert gedurende 20 sec. Laat de plaat pers niet aan tijdens deze periode. Zodra het lampje continu groen, til de hendel voorzichtig en verwijder voorzichtig de verzegelde plaat door vast te houden aan de randen. Terwijl de verzegelde versterking plaat verticaal door de randen van de zaak, onmiddellijk plaatst u de spuit in de haven van belading aan het einde van de zaak, dan afzien van de onderdompeling vloeistof langzaam in een zachte vloeiende beweging naar de ruimte tussen de plaat en het vullen deksel. Laat een kleine luchtbel in de hoek wanneer de plaat wordt ondergedompeld. Terwijl u houd de plaat verticaal door de randen, sluit de laadhaven door het inbrengen van de stekker in de haven en het verdraaien van de stekker met de klok mee, het toepassen van voldoende druk totdat het handvat afbreekt. Pak de randen van de behuizing vast zodat de kracht van de greep breken veroorzaakt niet het geval te laten vallen. Als een plaat is gevallen, gooi hem weg. Reinig de behuizing met een pluisvrije doek, dat grondig is besproeid met ethanol. Om de zaak te drogen, veeg de zaak naar beneden met een schoon te vegen. Voorzichtig omgaan met de zaak; zeker druk uitoefenen op het glas boven de putjes. Breng de verzegelde plaat om de versterking machine. Onder het tabblad "Instrument", selecteer "Instrument Console." Selecteer de versterking machine klik op de knop "Open Deur". Plaats de versterking plaat in de eerste sleuf van de plaat adapter en controleer of de adapter goed up is bekleed met A1 in de linker bovenhoek. Richt de plaat met de barcode naar boven en in de richtingde voorzijde van het instrument. Klik op de "Sluit klep" knop. Let op het gebruik van de adapter tray – er is een maximum van 10 toepassingen. Onder het tabblad Start aan de onderkant van het scherm, onder het menu Run, selecteert OpenArray. Klik op 'Get Plate ID's. " De lege dozen worden automatisch gevuld met informatie over de plaat. Om de run te beginnen, klikt u op 'Start Run ". Sluit de vloeibare handler software en zet de vloeistof handler. Plaats de tip deksel over de tip rack. Gooi de tips van de afvalbak en reinigen. Schoon en ontsmetten van alle items, waaronder het werkvlak, pipet, emmer, en tips boxen. Verzegelt de voorversterker plaat met een duidelijke kleefband en bewaar bij -20 ° C. 7. Resultaat Analyse Zodra de run is voltooid, sla het bestand en klik vervolgens op de "X" op het tabblad met de run naam aan de onderkant van het scherm om het bestand te sluiten. Klik op "Open Deur"Aan de bovenkant van het scherm om de deur te openen. Verwijder de versterking plaat, controleren dat er geen onderdompeling vloeistof is uitgelekt. Klik op" Sluit de deur "aan de bovenkant van het scherm om de deur te sluiten. Klik op "Open" en selecteer de run-bestand om het te openen. Druk op de groene knop Analyseren in de rechterbovenhoek van het scherm. Klik op "Export" aan de linkerkant van het scherm en vervolgens op "Start Export" om de resultaten te exporteren (als txt-bestand). Minimaliseer het bestand na het opent. Klik vervolgens op "Export QC afbeeldingen." Beoordeel QC beelden in de beeldanalyse programma volgens de volgende criteria: Beoordelen van het laden van hoge kwaliteit met behulp van PRE-READ_CHANNEL_4.tiff en POST-READ_CHANNEL_4.tiff, door te controleren dat er geen donkere vlekken of vlekken. OPMERKING: Een kleurstof gedetecteerd door dit kanaal wordt toegevoegd door de fabrikant aan de primers en probes, die in oplossing vrijkomt bij de reactie geladen. De lezing in dit kanaal geeft aan dat de reacties niet goed warengeplaatst en de primers en probe gemengd met kleurstof aanwezig waren. Controleer op lekken of agitatie aan de plaat na het inladen met S02_C001_t03_p001_m1_x2_e1_cp # _spotfind.tiff. Als het beeld ziet er donker, verhoogt u de helderheid (druk op Ctrl + Shift + C om de controles te openen) totdat de gehele plaat zichtbaar is. Controleer dat het beeld ziet er uniform zonder schaduwen, bellen, of verplaatst samples. Evalueren deksel plaatsing en puin onder het deksel (lichtpuntjes) met behulp van STAGE2_CYCLE1_CHANNEL_1.tiff en STAGE2_CYCLE40_CHANNEL_1.tiff. Optioneel: Open een spreadsheet met daarin de resultaten Macro (Aanvullende code-bestand). In het geëxporteerde bestand, klik met de rechtermuisknop op de tab aan de onderkant van het scherm en selecteer "Verplaatsen of Kopiëren". In het veld "te boeken", selecteer "Resultaten Macro.xlsm". Klik op "Move to end" en vink het vakje "Create kopiëren". Klik vervolgens op OK. Als de optie Resultaten Macro niet wordt weergegeven in het veld "te boeken", simply kopieert u de inhoud van het geëxporteerde bestand werkblad (klik op de linkerbovenhoek cel om alle cellen te selecteren en Ctrl-C) en plak deze in een nieuw tabblad. Verwijder het tabblad oude "Export" en vervolgens de naam van het tabblad nieuw toegevoegde als "Export". Klik op 'Alt-F8' (of klik op vervolgens op Macro's) te selecteren en vervolgens "Macro" en klik op "Run". Herhaal dit voor Macro2 door te klikken op "Alt-F8" en vervolgens te kiezen voor "Macro2" en te klikken op "Run". Hernoem de resultaten Macro-bestand met de relevante informatie (datum en het serienummer), zet deze informatie boven tafel, en opslaan als dezelfde bestandsnaam in de geëxporteerde map Results. Tot slot een afdruk van de macro-gegenereerde resultaten tafel. In de amplificatie machine software, controleert u de curves voor elk monster en controle tegen de macro tafel door het selecteren van Analyse / Amplification Plot aan de linkerkant van het scherm. Vervolgens selecteert u het tabblad Sample, en klik op elk monster tebevestigen dat er 2 of 3 positief amplificatie curves voor elk van de positieve resultaten in de tabel. Schakel de versterking machine.