La detección de alto rendimiento de los patógenos respiratorios de especímenes animales por PCR nanoescala
Summary
pruebas de alto rendimiento de ADN y ARN patógenos basados por nanoescala PCR se describe el uso de un canino sindrómica y el panel de PCR respiratoria equina.
Abstract
En tiempo real a escala de nanolitros PCR utiliza multiplexado espacial para permitir que varios ensayos que se ejecutan en paralelo en una sola placa sin los inconvenientes típicos de la combinación de reacciones juntos. Hemos diseñado y evaluado un panel basado en este principio para identificar rápidamente la presencia de agentes patógenos comunes en perros y caballos con enfermedad respiratoria aguda. Este manuscrito describe un flujo de trabajo de PCR de diagnóstico a escala nanométrica para la preparación de muestras, amplificación y análisis de secuencias de patógenos objetivo, centrándose en los procedimientos que son diferentes de reacciones escala microlitro. En el panel respiratorio presentado, 18 ensayos se establecieron cada uno por triplicado, con capacidad para 48 muestras por placa. Una extracción y pre-amplificación de flujo de trabajo universal, se ha optimizado para la preparación de muestras de alto rendimiento para acomodar múltiples matrices y patógenos basados en ADN y ARN. Los datos representativos se presentan para una diana de ARN (influenza A matriz) y una diana de ADN (virus del herpes equino1). La capacidad de probar con rapidez y precisión para un grupo amplio, basado en el síndrome de patógenos es una herramienta valiosa para mejorar la eficiencia y la ergonomía de las pruebas de diagnóstico y para el diagnóstico de la enfermedad respiratoria aguda y la gestión.
Introduction
Con la demanda para la detección rápida y completa de múltiples agentes en el diagnóstico clínico para humanos y animales, métodos de diagnóstico molecular de un solo organismo para la detección de patógenos son difíciles de cumplir si no se utiliza un gran número de muestras que se está probando para una sola enfermedad. En el contexto veterinario, metodologías de diagnóstico de alto rendimiento son particularmente importantes debido a la necesidad adicional para cubrir los patógenos de una amplia variedad de especies. OneHealth enfoques para la gestión de las enfermedades transmitidas por los alimentos y la vigilancia de los patógenos emergentes son ejemplos de necesidades de pruebas que incluyen una serie de bacterias, virus (ADN o ARN basadas), parásitos y hongos. El desafío de la combinación de ensayos para múltiples analitos juntos (multiplexación) con el fin de mejorar la eficiencia de la prueba es una posible pérdida de sensibilidad y una gran carga para la optimización y validación de ensayos.
reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real a escala de nanolitros (PCR) es un alternativo a la práctica de multiplexación que permite que muchas reacciones separadas puedan funcionar simultáneamente en la misma muestra 1. La plataforma OpenArray es una aplicación de este principio 2; que combina la tecnología de microarrays con PCR en tiempo real. Basado en el concepto de multiplexación espacial, cada muestra se analiza para un gran número de objetivos en separada agujeros pasantes. Esta plataforma se utilizó inicialmente con la unión de ADN de doble cadena a base de cianina química 2 y ahora está disponible para la química basada en sondas utilizando sondas de enfriamiento 3 oscuras. Esta plataforma ha sido utilizada principalmente para la caracterización genética en los seres humanos y los animales 4 5. Recientemente se ha adaptado para detectar ADN y ARN patógenos de la sangre por Grigorenko et al. 6 mediante un procedimiento de dos etapas de transcripción inversa / pre-amplificación (preamplificador).
Se describe aquí un procedimiento basado en preamplificador de un solo paso para la detección de ambos tipos de agentes patógenos en sec respiratoriaretions y una variedad de otros tipos de muestras que se pueden realizar en su totalidad en un día de trabajo normal. Al finalizar el preamplificador de una sola etapa, las muestras se transfirieron a una placa de 384 pocillos, que es el formato aceptado por el sistema de manejo de líquidos automatizado que viene con este nanoescala plataforma PCR. El sistema señala a la mezcla maestra y de la muestra a través de la superficie de hasta 4 placas (192 muestras y controles) a la vez. Después de este proceso de carga, se describe cómo se amplifican muestras y se analizaron usando una hoja de cálculo macro que resume el promedio de 3 repeticiones técnica para cada combinación de muestra / diana en una tabla que quepa en una página impresa.
Se estableció un método uniforme para el análisis de ADN y / o ARN extraído de muestras usando esta plataforma. Se extrajeron Una amplia variedad de muestras, transcribe inversa, y pre-amplificado en un formato de 96 pocillos, lo que minimiza la posibilidad de errores. muestras respiratorias analizadas incluyeron muestras nasales, faríngeas profundas hisopos,lavados trans-traqueales, lavado broncoalveolar, y el tejido pulmonar. Dado que algunos de los agentes probados también pueden estar presentes en la sangre periférica o las heces, incorporamos estos tipos de muestras en el procedimiento. Este flujo de trabajo optimizado ayuda a ahorrar tiempo y recursos en comparación con llevar a cabo experimentos en múltiples placas, permitiendo la prueba eficiente a través de patógenos y toxinas detección de genes basados en panel en su lugar de pruebas individuales. El panel respiratoria ha demostrado aquí tenía 18 ensayos cada impresos por triplicado orificios pasantes, con capacidad para 48 muestras por placa. Los patógenos equinos detectados incluyen adenovirus equino 1 y 2, virus de la arteritis equina, virus de la rinitis equina A y B, virus del herpes equino (EHV) tipos 1 y 4, y Streptococcus equi. Los patógenos caninos incluyen coronavirus canino respiratoria (betacoronavirus), el virus del moquillo canino, adenovirus canino, virus de la parainfluenza canina, pneumovirus canino, Bordetella bronchiseptica y Mycoplasma Cynos. UNla gripe universal, también se incluyó un ensayo y un control interno (MS2 ARN del fago).
Protocol
Representative Results
Discussion
Este procedimiento se ha utilizado para las pruebas de rutina de patógenos respiratorios en nuestro laboratorio en el transcurso de seis meses (2-3 veces a la semana). También hemos tenido éxito utilizando el mismo procedimiento para el perfilado de patógenos entéricos en muestras fecales y bacterias aisladas en una placa personalizada por separado. Una vez que se producen las placas, el personal experimentado puede completar los pasos 2-7 el plazo de un día de trabajo normal. Los pasos más críticos son el sellado adecuado de la placa de preamplificador, la transferencia de muestras preamplificada entre las placas (que se debe hacer rápidamente para evitar la evaporación), y el recubrimiento final de la placa de amplificación. El uso de la hoja de cálculo macro como una guía para el análisis de resultado (comprobación de curvas para muestras y controles) también fue crítica, ya que reduce en gran medida la cantidad de tiempo y trámites necesarios para este proceso. La hoja de cálculo macro proporcionada es un ejemplo; tendría que ser modificado o re-creado para placas con diferentes configuraciones. Esto puede ser fácilmente performed por alguien con conocimientos básicos de hoja de cálculo.
Debido a la muy pequeña cantidad de muestra se carga en la placa de amplificación (33 nl), se requiere pre-amplificación. En la optimización de este protocolo (no mostrado), se comparó un número de parámetros de preamplificación incluyendo la mezcla maestra, la adición de cebadores aleatorios, número de ciclos, el tiempo de recocido, y la dilución antes de la amplificación. Cada destino tiene sus propias condiciones óptimas, y los descritos aquí representan aquellos que rindió el mejor límite de detección global de nuestro panel. Este panel cubre una amplia gama de patógenos objetivos y tipos de muestras que se encuentran en las pruebas de diagnóstico veterinario de rutina, pero las modificaciones a los procedimientos de preamplificación puede ser necesario para los diferentes paneles. Las condiciones de amplificación fabricante optimizado se basan en un protocolo estándar basado en sonda de PCR en tiempo real con un 10 min a la activación de la enzima 95 ° C seguido de desnaturalización a 95 ° C y AnnEaling / extensión a 60 ° C. Los cebadores y sondas son pre-impreso en las placas también usando condiciones fabricante optimizados y por lo tanto no requieren de titulación. La combinación de los pasos de transcripción inversa y pre-amplificación para todas las muestras (independientemente del tipo de blanco) era necesario con el fin de mantener la eficacia del flujo de trabajo. Tener todas las muestras a transcripción inversa también es beneficioso para maximizar la sensibilidad. Por otra parte, el uso de una mezcla maestra para el preamplificador que está optimizado para minimizar los inhibidores permite versatilidad en la combinación de diferentes tipos de muestras en la misma placa.
El Centro para el Control de Enfermedades (CDC) de ensayo de la matriz de influenza descrito por Shu et al. 7 y adaptado aquí para reacciones a escala de nanolitros es una gripe universal de un ensayo que sea apropiado para el análisis de muestras de humanos y animales de compañía. Fue diseñado para la detección universal de la matriz de genes de todos los virus de la influenza A utilizando rea escala microlitrocciones. Se ha utilizado en todo el mundo como parte de un panel de los CDC sobre Virus de la Influenza Humana y un panel de gripe porcina CDC. El ensayo 8 EHV-1 adaptada aquí detecta un importante patógeno respiratorio de los caballos que pueden causar abortos y las enfermedades neurológicas (revisado por Pusterla y Hussey 10). El significado de la adaptación de estas pruebas a una plataforma de alto rendimiento con un control interno especies independientes es que pueden ser incorporados en un enfoque de vigilancia OneHealth. Habiendo tanto de estos ensayos en una plataforma de pruebas de alto rendimiento facilitará la preparación de emergencia para las instalaciones clínicas, refugios y eventos de rendimiento.
Los resultados descritos anteriormente eran representativos de todos los objetivos en la placa con la excepción de Mycoplasma cynos, que mostró considerablemente más variación en el rendimiento analítico. Esto era probablemente debido a la temperatura subóptima de fusión (Tm) de los cebadores, lo que debería ser, idealmente, desde 58 hasta 60 y# 176; C (la sonda ideales Tm es 68-70 ° C). Una limitación de esta plataforma es que se necesita más tiempo para diseñar y fabricar las placas que para ordenar sondas individuales, lo que limita la capacidad de modificar rápidamente secuencias. Otra limitación de PCR en tiempo real en general es la incapacidad para detectar novela o patógenos inesperados. Esto se puede superar, hasta cierto punto mediante el diseño de ensayos que responden a secuencias en múltiples especies, pero metodologías basadas imparciales secuenciación de todo el genoma son más adecuadas para el descubrimiento de nuevos agentes. 11,12
Nanoescala-PCR en tiempo real permite a un nuevo paradigma para el lugar de las pruebas basadas en especie, que es útil para reducir los costes de reactivos y laborales en el diagnóstico molecular de alto rendimiento basado en el síndrome. Las pruebas de panel de gran escala por este enfoque puede facilitar los esfuerzos de vigilancia OneHealth tales como los descritos por Dunne y Gurfield 13 y Moutailler et al. 14. Recolección de muestras de frotis temprano,generalmente dentro de 3 días de la aparición clínica, proporciona la mejor oportunidad para identificar la presencia de patógenos respiratorios. la aparición de enfermedades infecciosas es a menudo impredecible, y las pruebas que se pueden realizar en diferentes especies, sin necesidad de modificación de los reactivos son ideales para la preparación. Las futuras aplicaciones de esta tecnología son propensos a estar en patotipificación, perfiles de resistencia a los antibióticos, y otros paneles de diagnóstico clínico basados en síndromes. Nanoescala-PCR en tiempo real es más útil para la detección rápida y de alto rendimiento de múltiples tipos de muestras y de patógenos, y se complementaría con enfoques imparciales o parcialmente sesgados a base de secuenciación para la identificación de nuevas y emergentes patógenos.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo sobre los ensayos de patógenos respiratorios descritos aquí fue apoyada por los fondos de desarrollo interno de Cornell Centro de Diagnóstico de Salud Animal. Desarrollo de la nanoescala flujo de trabajo PCR y sistemas de aseguramiento de la calidad fue financiado parcialmente (FOA PA-13-244) y realizado en colaboración con el Laboratorio de Investigación Veterinaria de la Administración de Drogas y Alimentos y la Red de Respuesta (FDA Vet-LIRN) con la subvención No. 1U18FD005144- 01. Los gastos de publicación fueron patrocinados por VWR y Quanta Biosciences. Agradecemos a Gabrielle Nickerson, Roopa Venugopalan, Veldina Camo, Xiulin Zhang, Jinzhi Yu, Wang Weihua, y Katrina Walker por su ayuda con la escritura y la revisión del protocolo. Agradecemos a Mike Carroll para filmar las entrevistas del autor. Finalmente Agradecemos al editor y tres revisores anónimos por sus útiles comentarios.
Materials
| Zap-OGlobin II lytic reagent | Beckman Coulter | 7546138 | Optional reagent for preparing blood samples. |
| Extraction kit (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | AM1840 | Other extraction kits appropriate for the desired sample types may be substituted. This kit comes with PBS, lysis buffer, and wash buffer. |
| 2X One-Step RT-qPCR mix (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix ) | Quanta Biosciences | 95134-500 | |
| Gene-specific primer pool | IDT | custom order | Can be generated by the user or purchased with the amplification plates. |
| Random primer mix | New England Biolabs | S1330S | |
| Standard 96-well plate | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | N8010560 | This can be any plate that fits into the conventional PCR machine used. |
| Amplification master mix (OpenArray master mix) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4462164 | |
| Clear adhesive seal | Thermo-Fisher | 430611 | |
| Foil seal | Excel Scientific | AF-100 | |
| 384-well plate | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4406947 | |
| Amplification plate (QuantStudio 12K Flex OpenArray plate) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4470813 | Can be customized with any assays conforming to standard TaqMan conditions. |
| Accessories kit | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4469576 | Contains the case lids, plugs, and immersion fluid. |
| AccuFill tips | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4457246 | |
| Amplification machine (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4471090 | |
| Liquid handler (OpenArray AccuFill System) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4457243 | This is purchased with the amplification machine. |
| Primer design software (Primer Express) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4363991 | See manufacturer's instructions for detailed primer and probe specifications. |
| Image analysis program (ImageJ) | NIH | Available at http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Spreadsheet program (Excel) | Microsoft | Available at https://products.office.com/en-us/excel | |
| PCR plate spinner | VWR | 89184-608 | This device has only one speed (2500 rpm); the rotor starts when the lid is closed and stops when the button is pushed. |
| TE buffer | Millipore | 8890-100ML | 10mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 1mM Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0 |
| DMEM | Thermo-Fisher/Gibco | 11965-092 | |
| Tissue disruptor (TissueLyser II) | Qiagen | 85300 | |
| Conventional thermal cycler (Veriti) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4375786 | Any conventional thermal cycler with a heated lid can be used. |
References
- Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. Nanoliter scale PCR with TaqMan detection. Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).
- Morrison, T., et al. Nanoliter high throughput quantitative PCR. Nucleic Acids Res. 34 (18), e123 (2006).
- Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J Mol Endocrinol. 29 (1), 23-39 (2002).
- McCall, M. N., et al. A benchmark for microRNA quantification algorithms using the OpenArray platform. BMC bioinformatics. 17 (1), 138 (2016).
- Pozzi, A., Previtali, C., Cenadelli, S., Gandini, L., Galli, A., Bongioni, G. Genetic traceability of cattle using an OpenArray genotyping platform. Anim Genet. 47 (1), 133-134 (2016).
- Grigorenko, E., et al. Multiplex screening for blood-borne viral, bacterial, and protozoan parasites using an OpenArray platform. J Mol Diagn. 16 (1), 136-144 (2014).
- Shu, B., et al. Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus. J Clin Microbiol. 49 (7), 2614-2619 (2011).
- Elia, G., et al. Detection of equine herpesvirus type 1 by real time PCR. J Virol Methods. 133 (1), 70-75 (2006).
- Dreier, J., Störmer, M., Kleesiek, K. Use of Bacteriophage MS2 as an Internal Control in Viral Reverse Transcription-PCR Assays. J Clin Microbiol. 43 (9), 4551-4557 (2005).
- Pusterla, N., Hussey, G. S. Equine Herpesvirus 1 Myeloencephalopathy. Vet Clin North Am Equine Pract. 30 (3), 489-506 (2014).
- Firth, C., Lipkin, W. I. The genomics of emerging pathogens. Annu Rev Genomics Hum Genet. 14, 281-300 (2013).
- Lecuit, M., Eloit, M. The potential of whole genome NGS for infectious disease diagnosis. Expert Rev Mol Diagn. 15 (12), 1517-1519 (2015).
- Dunne, G., Gurfield, N. Local Veterinary Diagnostic Laboratory, a Model for the One Health Initiative. Vet Clin North Am Small Anim Pract. 39 (2), 373-384 (2009).
- Moutailler, S., et al. Co-infection of Ticks: The Rule Rather Than the Exception. PLOS Negl Trop Dis. 10 (3), e0004539 (2016).
