À haut débit de détection de pathogènes dans respiratoires Spécimens animaux par Nanoscale PCR
Summary
test à haut débit d'agents pathogènes à base d'ADN et d'ARN par PCR à l'échelle nanométrique est décrit en utilisant un chien syndromique et le panneau PCR respiratoire équine.
Abstract
PCR échelle nanolitres en temps réel utilise le multiplexage spatial pour permettre à plusieurs essais pour être exécutés en parallèle sur une seule plaque sans les inconvénients typiques de la combinaison de réactions ensemble. Nous avons conçu et évalué un groupe basé sur ce principe pour identifier rapidement la présence d'agents pathogènes courants chez les chiens et les chevaux souffrant d'une maladie respiratoire aiguë. Ce manuscrit décrit un flux de PCR de diagnostic à l'échelle nanométrique pour la préparation des échantillons, l'amplification et l'analyse de séquences cibles d'agents pathogènes, en se concentrant sur les procédures qui sont différentes des réactions à l'échelle du microlitre. Dans le panneau respiratoire présenté, 18 essais ont été chacun mis en place en trois exemplaires, pouvant accueillir jusqu'à 48 échantillons par plaque. Une extraction et de pré-amplification flux de travail universel a été optimisé pour haut débit préparation d'échantillons pour accueillir plusieurs matrices et des agents pathogènes à base d'ADN et d'ARN. Des données représentatives sont présentées pour un ARN cible (grippe A de la matrice) et une cible d'ADN (herpesvirus équin1). La possibilité de tester rapidement et avec précision pour un groupe complet, basé sur les syndromes d'agents pathogènes est un outil précieux pour améliorer l'efficacité et l'ergonomie des tests de diagnostic et pour le diagnostic de la maladie respiratoire aiguë et la gestion.
Introduction
Avec la demande pour la détection rapide et complète de plusieurs agents dans le diagnostic clinique pour les humains et les animaux, les méthodes de diagnostic moléculaire unique organisme pour la détection des pathogènes sont lourdes à moins utilisé pour un grand nombre d'échantillons ont été soumis à une seule maladie. Dans le contexte vétérinaire, les méthodes de diagnostic à haut débit sont particulièrement importants en raison de la nécessité supplémentaire pour couvrir les agents pathogènes à partir d'une grande variété d'espèces. OneHealth approches pour la gestion des maladies d'origine alimentaire et à la surveillance des agents pathogènes émergents sont des exemples de besoins de test qui incluent un certain nombre de bactéries, (à base d'ADN ou ARN) des virus, des parasites et des champignons. Le défi de combiner des tests pour plusieurs analytes ensemble (multiplexage) afin d'améliorer l'efficacité des tests est une éventuelle perte de sensibilité et d'une grande charge pour l'optimisation et la validation des tests.
En temps réel échelle nanolitres réaction en chaîne par polymérase (PCR) est un alternative à la pratique de multiplexage qui permet de nombreuses réactions séparées de fonctionner simultanément sur le même échantillon 1. La plate – forme OpenArray est une application de ce principe 2; il combine la technologie des microréseaux avec la PCR en temps réel. Basé sur le concept de multiplexage spatial, chaque échantillon est testé pour un grand nombre de cibles dans séparés par des trous. Cette plate – forme a été initialement utilisée avec la chimie de liaison d' ADN double brin à base de cyanine-2 et est maintenant disponible pour la chimie à base de sonde en utilisant des sondes de trempe sombres 3. Cette plate – forme a été principalement utilisé pour le profilage génétique chez les humains et les animaux 4 5. Il a récemment été conçu pour détecter l' ADN et l' ARN des agents pathogènes transmis par le sang par Grigorenko et al. , 6 en utilisant une transcription inverse / préamplification (préamplificateur) , procédure en deux étapes.
Nous décrivons ici une procédure basée préampli-en une seule étape pour détecter les deux types d'agents pathogènes dans les sec respiratoiresretions et une variété d'autres types d'échantillons qui peuvent être exécutées entièrement dans une journée normale de travail. Après achèvement de la pré-ampli en une seule étape, les échantillons sont transférés à une plaque à 384 puits, ce qui est le format accepté par le système de manipulation de liquides automatisé qui vient avec cette plate-forme par PCR à l'échelle nanométrique. Le système dessine le mélange maître et de l'échantillon à travers la surface jusqu'à 4 plaques (192 échantillons et contrôles) à la fois. Suite à ce processus de chargement, nous décrivons comment les échantillons sont amplifiés et analysés en utilisant une feuille de calcul macro qui résume la moyenne de 3 répétitions techniques pour chaque combinaison échantillon / cible dans une table qui tient sur une page imprimée.
Un procédé uniforme pour l'analyse de l'ADN extrait et / ou de l'ARN à partir d'échantillons à l'aide de cette plate-forme a été établie. Une grande variété d'échantillons ont été extraits, une transcription inverse, et pré-amplifié dans un format de 96 puits, ce qui minimise les risques d'erreurs. échantillons respiratoires testés comprenaient des écouvillons nasaux, écouvillons pharyngés profonds,lavage trans-trachéale, lavage broncho-alvéolaire et le tissu pulmonaire. Étant donné que certains des agents testés peuvent également être présents dans le sang périphérique ou des matières fécales, nous avons incorporé les types d'échantillons dans la procédure. Ce flux de travail simplifié permet d'économiser du temps et des ressources par rapport à l'exécution d'expériences dans de multiples plaques en permettant le test efficace par l'agent pathogène et la toxine détection de gènes à base de panneau en place des tests individuels. Le panneau respiratoire démontré ici avait 18 essais chacun imprimés en triple trous traversants, pouvant accueillir jusqu'à 48 échantillons par plaque. Les agents pathogènes équins détectés inclus adénovirus équin 1 et 2, le virus de l' artérite équine, le virus de la rhinite équine A et B, virus de l' herpès équin (EHV) de types 1 et 4, et Streptococcus equi. Les agents pathogènes canins inclus coronavirus canin respiratoire (betacoronavirus), le virus de la maladie de Carré, l' adénovirus canin, le virus parainfluenza canin, pneumovirus canine, Bordetella bronchiseptica et cynos Mycoplasma. UNEla grippe universelle Un dosage et un contrôle interne (MS2 ARN du phage) ont également été inclus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette procédure a été utilisée pour les tests de routine des agents pathogènes respiratoires dans notre laboratoire au cours des six mois (2-3 fois par semaine). Nous avons également eu du succès en utilisant la même procédure pour entérique profilage des agents pathogènes dans des échantillons fécaux et isolats bactériens sur une plaque séparément sur mesure. Une fois que les plaques sont produites, le personnel expérimenté peut effectuer les étapes 2-7 en une journée normale de travail. Les étapes les plus critiques sont la bonne étanchéité de la plaque de préamplification, le transfert d'échantillons préamplifiés entre les plaques (ce qui doit être fait rapidement afin d'éviter l'évaporation), et le revêtement final de la plaque d'amplification. L'utilisation de la feuille de macro comme un guide pour l'analyse des résultats (vérification des courbes pour les échantillons et les témoins) était également essentielle, car elle réduit considérablement la quantité de temps et de documents nécessaires pour ce processus. La feuille de calcul fournie macro est un exemple; il serait nécessaire de modifier ou recréées pour des plaques avec des configurations différentes. Cela peut facilement être performed par une personne ayant des connaissances de base de la feuille de calcul.
En raison de la très petite quantité d'échantillon a été chargé sur la plaque d'amplification (33 nl), pré-amplification est nécessaire. L'optimisation de ce protocole (non représenté), nous avons comparé un certain nombre de paramètres de préamplification comprenant le mélange maître, l'addition d'amorces aléatoires, le nombre de cycles, le temps de recuit, et une dilution avant l'amplification. Chaque cible a ses propres conditions optimales, et celles qui sont décrites ici représentent ceux qui a abouti à la meilleure limite de détection globale de notre panel. Ce panneau couvre un large éventail de cibles pathogènes et les types d'échantillons que l'on rencontre dans les tests de diagnostic vétérinaire de routine, mais des modifications aux procédures de préamplification peut être nécessaire pour les différents panneaux. Les conditions d'amplification du fabricant optimisées sont basées sur un système en temps réel protocole de PCR standard à base de sonde avec une 10 min à 95 ° C activation enzymatique suivie d'une dénaturation à 95 ° C et Annealing / allongement à 60 ° C. Les amorces et les sondes sont pré-imprimé sur les plaques en utilisant des conditions aussi du fabricant optimisé et ne nécessitent donc pas de titrage. En combinant les reverse-transcription et de pré-amplification étapes pour tous les échantillons (quel que soit le type de cible) était nécessaire afin de maintenir l'efficacité du flux de travail. Tous les échantillons ayant subi une transcription inverse est également bénéfique pour maximiser la sensibilité. En outre, l'utilisation d'un mélange maître pour le préampli qui est optimisé pour les inhibiteurs minimisant permet une polyvalence en combinant différents types d'échantillons sur la même plaque.
Le Center for Disease Control (CDC) de dosage de la matrice de la grippe décrite par Shu et al. 7 et adapté ici pour des réactions à l'échelle de nanolitre est une grippe universelle Un test qui est approprié pour tester des échantillons provenant d' êtres humains et les animaux de compagnie. Il a été conçu pour la détection universelle du gène de la matrice de tous les virus de la grippe A en utilisant rea échelle microlitresctions. Il a été utilisé dans le monde entier dans le cadre d'un groupe spécial de virus CDC grippe humaine et un groupe spécial de la grippe porcine CDC. Le EHV-1 test 8 adapté ici détecte un important pathogène respiratoire des chevaux qui peuvent causer des avortements et des maladies neurologiques (revue par Pusterla et Hussey 10). L'importance de l'adaptation de ces tests pour une plate-forme à haut débit avec un contrôle interne des espèces indépendantes est qu'elles peuvent être intégrées dans une approche de surveillance OneHealth. Ayant à la fois de ces essais sur une plate-forme de test à haut débit facilitera la préparation aux urgences pour les installations cliniques, des abris et des événements de performance.
Les résultats décrits ci – dessus sont représentatifs de toutes les cibles sur la plaque à l'exception de Mycoplasma cynos, qui a montré beaucoup plus de variation dans la performance analytique. Cela était probablement due à la température sous-optimale fusion (Tm) des amorces, ce qui devrait idéalement être 58-60 &# 176; C (la sonde idéale Tm est 68-70 ° C). Une limitation de cette plate-forme est que cela prend plus de temps pour concevoir et fabriquer les plaques que pour commander des sondes individuelles, ce qui limite la capacité de modifier rapidement des séquences. Une autre limitation de la PCR en temps réel, en général, est l'incapacité à détecter des agents pathogènes nouveaux ou inattendus. Ceci peut être surmonté dans une certaine mesure par la conception des dosages qui correspondent à des séquences dans plusieurs espèces, mais méthodologies basées sur le séquençage du génome entier authentiques sont plus appropriés pour la découverte de nouveaux agents 11,12 .
PCR Nanoscale en temps réel permet à un nouveau paradigme pour les tests plutôt que sur la base des espèces, ce qui est utile pour réduire réactifs et le coût du travail dans le diagnostic moléculaire à haut débit basé sur les syndromes. Test du panneau à grande échelle par cette approche peut faciliter les efforts de surveillance OneHealth tels que ceux décrits par Dunne et Gurfield 13 et Moutailler et al. 14. Prélèvement d'échantillons de frottis tôt,généralement dans les 3 jours suivant l'apparition clinique, fournit la meilleure chance d'identifier la présence d'agents pathogènes respiratoires. l'émergence de maladies infectieuses est souvent imprévisible, et des tests qui peuvent être effectuées sur des espèces différentes sans nécessiter de modification des réactifs sont idéales pour la préparation. Les futures applications de cette technologie sont susceptibles d'être en pathotypage, antimicrobien profilage de la résistance, et d'autres panneaux cliniques de diagnostic basés sur le syndrome. PCR Nanoscale en temps réel est très utile pour rapide, criblage à haut débit de types d'échantillons et d'agents pathogènes multiples, et serait complétée par des approches fondées séquençage impartiales ou partiellement biaisées pour identifier les agents pathogènes nouveaux et émergents.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les travaux sur les tests de pathogènes respiratoires décrites ici a été soutenu par Cornell animaux Centre de diagnostic de la santé des fonds de développement interne. Développement de l'échelle nanométrique de workflow PCR et des systèmes d'assurance qualité associés a été partiellement financé (FOA PA-13-244) et réalisée en collaboration avec Veterinary Laboratory Investigation de la Food and Drug Administration et Response Network (FDA Vet-LIRN) sous Grant No. 1U18FD005144- 01. Les frais de publication ont été parrainés par VWR et Quanta Biosciences. Nous remercions Gabrielle Nickerson, Roopa Venugopalan, Veldina Camo, Xiulin Zhang, Jinzhi Yu, Weihua Wang, et Katrina Walker pour leur aide à l'écriture et la révision du protocole. Nous remercions Mike Carroll pour filmer les entrevues avec des auteurs. Nous remercions enfin le rédacteur en chef et trois examinateurs anonymes pour leurs commentaires utiles.
Materials
| Zap-OGlobin II lytic reagent | Beckman Coulter | 7546138 | Optional reagent for preparing blood samples. |
| Extraction kit (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | AM1840 | Other extraction kits appropriate for the desired sample types may be substituted. This kit comes with PBS, lysis buffer, and wash buffer. |
| 2X One-Step RT-qPCR mix (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix ) | Quanta Biosciences | 95134-500 | |
| Gene-specific primer pool | IDT | custom order | Can be generated by the user or purchased with the amplification plates. |
| Random primer mix | New England Biolabs | S1330S | |
| Standard 96-well plate | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | N8010560 | This can be any plate that fits into the conventional PCR machine used. |
| Amplification master mix (OpenArray master mix) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4462164 | |
| Clear adhesive seal | Thermo-Fisher | 430611 | |
| Foil seal | Excel Scientific | AF-100 | |
| 384-well plate | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4406947 | |
| Amplification plate (QuantStudio 12K Flex OpenArray plate) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4470813 | Can be customized with any assays conforming to standard TaqMan conditions. |
| Accessories kit | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4469576 | Contains the case lids, plugs, and immersion fluid. |
| AccuFill tips | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4457246 | |
| Amplification machine (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4471090 | |
| Liquid handler (OpenArray AccuFill System) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4457243 | This is purchased with the amplification machine. |
| Primer design software (Primer Express) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4363991 | See manufacturer's instructions for detailed primer and probe specifications. |
| Image analysis program (ImageJ) | NIH | Available at http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Spreadsheet program (Excel) | Microsoft | Available at https://products.office.com/en-us/excel | |
| PCR plate spinner | VWR | 89184-608 | This device has only one speed (2500 rpm); the rotor starts when the lid is closed and stops when the button is pushed. |
| TE buffer | Millipore | 8890-100ML | 10mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 1mM Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0 |
| DMEM | Thermo-Fisher/Gibco | 11965-092 | |
| Tissue disruptor (TissueLyser II) | Qiagen | 85300 | |
| Conventional thermal cycler (Veriti) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4375786 | Any conventional thermal cycler with a heated lid can be used. |
References
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