Hochdurchsatz-Nachweis von Respiratory Pathogens in Tier Proben durch nanoskalige PCR
Summary
Hochdurchsatz-Untersuchung von DNA und RNA basieren Pathogenen durch nanoskalige PCR beschrieben wird ein syndromic Eckzahn und equine Atmungs PCR Panel.
Abstract
Nano- Maßstab real-time PCR verwendet Spatial Multiplexing mehrere Tests zu ermöglichen, parallel auf einer einzigen Platte ohne die typischen Nachteile der Kombination von Reaktionen zusammen ausgeführt werden. Wir entwarfen und ausgewertet, um eine Platte auf diesem Prinzip beruhen, um schnell das Vorhandensein von gemeinsamen Krankheitserregern bei Hunden und Pferden mit akuten Atemwegserkrankungen zu identifizieren. Dieses Manuskript beschreibt einen nanoskaligen diagnostischen PCR-Workflow für die Probenvorbereitung, Amplifikation und Analyse von Zielpathogens Sequenzen, auf Verfahren konzentrieren, die von Mikrolitermaßstab Reaktionen unterschiedlich sind. In der Atem Panel vorgestellt wurden 18 Tests jeweils dreifach angesetzt, zu 48 Proben pro Platte aufnehmen können. Eine universelle Extraktion und Vorverstärkung Workflow wurde für Hochdurchsatz-Probenvorbereitung optimiert, um mehrere Matrizen und DNA- und RNA-basierte Krankheitserreger beherbergen. Repräsentative Daten sind für eine Ziel-RNA (Influenza-A-Matrix) und eine Ziel-DNA (Pferde-Herpesvirus vorgestellt1). Die Fähigkeit, schnell und genau zu prüfen, für eine umfassende, Syndrom-basierte Gruppe von Krankheitserregern ist ein wertvolles Instrument zur Verbesserung der Effizienz und Ergonomie von Diagnostik-Tests und für akute Atemwegserkrankungen Diagnose und Behandlung.
Introduction
Mit der Nachfrage nach schnellen und umfassenden Nachweis von mehreren Agenten in der klinischen Diagnostik für Mensch und Tier, Einzelorganismus molekulardiagnostischen Methoden zur Erregernachweis sind beschwerlich verwendet, es sei denn für eine große Anzahl von Proben für eine einzelne Krankheit getestet. Im Veterinär Zusammenhang sind Hochdurchsatz-Diagnosemethoden besonders wichtig aufgrund der zusätzlichen Bedarf an Pathogenen aus einer Vielzahl von Arten abdecken. OneHealth Ansätze zur Verwaltung von lebensmittelbedingten Erkrankungen und Schwellen Erreger Überwachung Beispiele für Testanforderungen sind, die eine Reihe von Bakterien enthalten, Viren (DNA oder RNA-Basis), Parasiten und Pilze. Die Herausforderung an Tests für mehrere Analyten kombiniert zusammen (Multiplexing), um Testeffizienz zu verbessern, ist ein möglicher Verlust der Empfindlichkeit und eine große Belastung für die Optimierung und Validierung von Assays.
Nano- Maßstab real-time Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein alterauf die Praxis der Multiplex nativen , die viele getrennte Reaktionen laufen gleichzeitig auf derselben Probe 1 ermöglicht. Die Openarray – Plattform ist eine Anwendung dieses Prinzips 2; es kombiniert Microarray-Technologie mit Echtzeit-PCR. Basierend auf dem Konzept der räumlichen Multiplexen wird jede Probe für eine Vielzahl von Zielen in getrennten Durchgangslöchern getestet. Diese Plattform wurde zunächst mit Cyanin-basierten doppelsträngigen DNA – Bindungs Chemie 2 und ist jetzt für sondenbasierte Chemie mit dunklen Lösch Sonden 3 verwendet. Diese Plattform hat in den Menschen 4 und Tiere für die genetische Profilierung 5 verwendet in erster Linie sind. Es wurde vor kurzem durch Blut übertragbaren DNA und RNA Pathogenen durch Grigorenko et al zu erfassen. 6 einen zweistufigen Reverse-Transkriptions / Vorverstärkung (Vorverstärker) Verfahren.
Wir beschreiben hier ein Ein-Schritt-Vorverstärker-basierte Verfahren für beide Arten von Krankheitserregern in der Atem sec Erkennungretions und eine Vielzahl von anderen Probentypen, die vollständig in einem Standard-Arbeitstag durchgeführt werden kann. Nach Beendigung der Ein-Schritt-Vorverstärker werden Proben auf eine Platte mit 384 Vertiefungen überführt, die das Format durch das automatisierte Flüssigkeitshandhabungssystem angenommen ist, die mit dieser nanoskaligen PCR Plattform kommt. Das System zeichnet die Master-Mix und die Probe über die Oberfläche von bis zu 4 Platten (192 Proben und Kontrollen) zu einer Zeit. Im Anschluss an diese Ladevorgang beschreiben wir, wie Proben verstärkt und analysiert, um eine Makro-Tabelle verwenden, die den Durchschnitt der drei technische Replikate für jede Probe / Ziel-Kombination in einer Tabelle zusammengefasst, die auf einer gedruckten Seite passt.
Ein einheitliches Verfahren zur Analyse von extrahierten DNA und / oder RNA aus Proben mit Hilfe dieser Plattform etabliert. Eine große Vielfalt von Proben wurden extrahiert, revers transkribiert und in einer 96-Well-Format-Pre verstärkt, das Potenzial für Fehler zu minimieren. Atemproben getestet enthalten Nasenabstrichen, tiefe Pharynxabstriche,trans-tracheale wäscht, Bronchiallavage und Lungengewebe. Da einige der Agenten im peripheren Blut vorhanden sein können, auch getestet oder Kot, eingebaut wir diese Arten von Proben in das Verfahren. durch eine effiziente Prüfung durch Panel-basierte Erreger und Toxin-Gen Detektion anstelle einzelner Test Diese optimierten Workflow hilft, Zeit und Ressourcen zu sparen im Vergleich zu Experimenten in mehreren Platten ausgeführt wird. Die Atem Panel hier gezeigt hatte 18 Assays in dreifacher Ausfertigung Durchgangslöcher gedruckt jeweils zu 48 Proben pro Platte aufnehmen können. Die Pferde-Erreger nachgewiesen enthalten Pferde-Adenovirus 1 und 2, Pferde-Arteriitis – Virus, Pferde-Rhinitis Virus A und B, Pferde – Herpesvirus (EHV) Typen 1 und 4 und Streptococcus equi. Die Hunde-Erreger enthalten Hunde-respiratorischen corona (betacoronavirus), Hundestaupevirus, Hunde – Adenovirus, Hunde-Parainfluenza – Virus, Eckzahn Pneumovirus, Bordetella bronchiseptica und Mycoplasma Cynos. EINuniversellen Influenza-A-Test und eine interne Kontrolle (MS2 RNA-Phagen) wurden ebenfalls enthalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Verfahren wurde für die Routineprüfung von respiratorischen Pathogenen in unserem Labor im Laufe von sechs Monaten (2-3 mal pro Woche) verwendet. Wir haben auch Erfolg das gleiche Verfahren für magensaftresistente Erreger Profilierung in Kotproben und bakterielle Isolate auf einem separat angepasst Platte verwenden. Sobald die Platten hergestellt werden, können erfahrene Mitarbeiter Schritte abgeschlossen innerhalb einer Standard Arbeitstag 2-7. Die kritischsten Schritte sind die einwandfreie Abdichtung des Vorverstärkers Platte, wobei die Übertragung von vorverstärkt Proben zwischen den Platten, und die endgültige Überdeckung der Verstärkungsplatte (die schnell Verdampfung durchgeführt werden müssen, um zu verhindern). Verwendung des Makro-Tabelle als Leitfaden für die Ergebnisanalyse (Kurven für Proben und Kontrollen Kontrolle) war ebenfalls wichtig, da sie stark die Menge an Zeit und Papiere für diesen Prozess benötigt reduziert. Die bereitgestellte Makro-Tabelle ist ein Beispiel; es müssten für Platten mit unterschiedlichen Konfigurationen modifiziert oder neu erstellt werden. Dies kann leicht sein performed von jemandem mit grundlegenden Tabellen Wissen.
Aufgrund der sehr geringen Menge an Probe geladen auf die Verstärkungsplatte (33 nl) wird Vorverstärkung erforderlich. Bei der Optimierung dieses Protokolls (nicht gezeigt) verglichen wir eine Reihe von Vorverstärkung Parameter einschließlich der Master-Mix, Zugabe von Zufallsprimern, die Anzahl der Zyklen, Glühzeit und Verdünnung vor der Amplifikation. Jedes Ziel hatte seine eigenen optimalen Bedingungen und die hier beschriebenen repräsentieren diejenigen, die die besten Nachweisgrenze insgesamt für unsere Platte ergab. Dieses Panel deckt ein breites Spektrum von pathogenen Ziele und Probentypen, die in der Routine Veterinärdiagnostik angetroffen werden, aber Änderungen an den Vorverstärkung Verfahren können für verschiedene Platten erforderlich sein. Die Hersteller optimierte Amplifikationsbedingungen sind auf einem Standard-Sonde-basierte Echtzeit-PCR-Protokoll mit einem 10 min bei 95 ° C Enzymaktivierung, gefolgt von einer Denaturierung bei 95 ° C und ann basierendEaling / Extension bei 60 ° C. Die Primer und Sonden sind vorgedruckt auf den Platten auch hersteller optimierten Bedingungen verwenden und benötigen daher keine Titration. die Reverse-Transkription und Vorverstärkung Schritte Kombination für alle Proben (unabhängig von der Art des Ziels) war notwendig, um die Effizienz in der Arbeitsablauf zu halten. alle Proben transkribierten umkehren zu haben, ist auch von Vorteil für die Maximierung der Empfindlichkeit. Weiterhin kann die Verwendung eines Master-Mix für den Vorverstärker, die zur Minimierung Inhibitoren optimiert ermöglicht Vielseitigkeit in verschiedenen Probentypen auf der gleichen Platte verbinden.
Das Center for Disease Control (CDC) Influenza – Matrix – Test von Shu et al. 7 und hier für Nano- Maßstab Reaktionen angepasst ist ein universelles Influenza – A – Test, der für die Prüfung Proben von Menschen und Haustieren geeignet ist. Es wurde für den universellen Erfassung des Matrix-Gen aller Influenza-A-Viren mit Mikrolitermaßstab rea entworfenctions. Es wurde auf der ganzen Welt als Teil einer CDC humanen Influenzavirus-Panel und einer CDC Schweinegrippe-Panel verwendet. Der EHV-1 – Test 8 angepasst hier erkennt einen wichtigen respiratorischen Erreger der Pferde , die Abtreibungen und neurologische Krankheit (rezensiert von Pusterla und Hussey 10) verursachen können. Die Bedeutung dieser Tests zu einer Hochdurchsatz-Plattform mit einer Spezies-unabhängige interne Kontrolle der Anpassung ist, dass sie in eine OneHealth Überwachung Ansatz integriert werden können. beide dieser Tests auf einem Hochdurchsatz-Testplattform hat, wird die Notfallplanung für die klinische Einrichtungen, Schutz und Performance-Events erleichtern.
Die oben beschriebenen Ergebnisse waren repräsentativ für alle Ziele auf der Platte mit Ausnahme von Mycoplasma Cynos, die in der analytischen Leistung deutlich mehr Variation zeigte. Dies war wahrscheinlich auf die suboptimale Schmelztemperatur (T m) der Primer, die im Idealfall sein sollte 58-60 &# 176; C (die ideale Sonde Tm 68-70 ° C). Eine Einschränkung dieser Plattform ist, dass es länger als die Platten für die Bestellung von einzelnen Sonden, die die Fähigkeit, Sequenzen zu schnell ändern begrenzt zu entwerfen und herzustellen braucht. Eine weitere Einschränkung der Echtzeit-PCR in der Regel ist die Unfähigkeit, neuartige und unerwartete Pathogene zu erkennen. Dies kann durch die Gestaltung Assays zu einem gewissen Grad überwunden werden , die Sequenzen in mehreren Spezies entsprechen, aber unvoreingenommene ganze Genom – Sequenzierung basierte Methoden sind besser geeignet für die Entdeckung von neuen Wirkstoffen. 11,12
Nanoskalige real-time PCR ermöglicht ein neues Paradigma für Syndrom-basierte eher als Spezies-basierte Tests, die für die Reduktionsmittel und Arbeitskosten im Hochdurchsatz-Molekulardiagnostik nützlich ist. Groß Panel Test durch diesen Ansatz kann OneHealth Überwachungs Bemühungen erleichtern, wie jene , die von Dunne und Gurfield 13 und Moutailler et al. 14. Sammlung von Tupferproben früh,Regel innerhalb von 3 Tagen nach dem Auftreten klinischer Symptome, bietet die beste Chance, das Vorhandensein von Atemwegserreger zu identifizieren. Infektionskrankheit Auflaufen ist oft unvorhersehbar, und Tests, die auf verschiedene Arten, ohne die Notwendigkeit einer Änderung der Reagenzien durchgeführt werden können für Bereitschafts- ideal sind. Zukünftige Anwendungen dieser Technologie sind wahrscheinlich in Pathotypisierung, Antibiotikaresistenz Profilierung zu sein, und weitere Syndrom basierten klinischen Diagnostik-Panels. Nanoskalige real-time PCR ist besonders nützlich für eine schnelle, Hochdurchsatz-Screening von Mehrfachproben und Erregertypen, und würde durch unvoreingenommene oder teilweise voreingenommen Sequenzierung basierte Ansätze zur Identifizierung neuer und entstehender Erreger ergänzt werden.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Arbeit an respiratorischen Erreger Assays hier beschrieben wurde von der Cornell Animal Health Diagnostic Center interne Entwicklungsfonds unterstützt. Die Entwicklung der nanoskaligen PCR-Workflow und die damit verbundenen Qualitätssicherungssysteme wurde teilweise finanziert (FOA PA-13-244) und in Zusammenarbeit mit der Food and Drug Administration Veterinary Laboratory Investigation and Response Network (FDA Vet-LIRN) unter Grant No 1U18FD005144- ausgeführt 01. Die Gebühren für die Veröffentlichung wurden von VWR und Quanta Biosciences gefördert. Wir danken Gabrielle Nickerson, Roopa Venugopalan, Veldina Camo, Xiulin Zhang, Jinzhi Yu, Weihua Wang, und Katrina Walker für ihre Unterstützung beim Schreiben und das Protokoll zu überprüfen. Wir danken Mike Carroll, die Autor Interviews für die Dreharbeiten. Wir danken schließlich den Editor und drei anonymen Gutachtern für ihre hilfreichen Kommentare.
Materials
| Zap-OGlobin II lytic reagent | Beckman Coulter | 7546138 | Optional reagent for preparing blood samples. |
| Extraction kit (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | AM1840 | Other extraction kits appropriate for the desired sample types may be substituted. This kit comes with PBS, lysis buffer, and wash buffer. |
| 2X One-Step RT-qPCR mix (qScript XLT One-Step RT-qPCR ToughMix ) | Quanta Biosciences | 95134-500 | |
| Gene-specific primer pool | IDT | custom order | Can be generated by the user or purchased with the amplification plates. |
| Random primer mix | New England Biolabs | S1330S | |
| Standard 96-well plate | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | N8010560 | This can be any plate that fits into the conventional PCR machine used. |
| Amplification master mix (OpenArray master mix) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4462164 | |
| Clear adhesive seal | Thermo-Fisher | 430611 | |
| Foil seal | Excel Scientific | AF-100 | |
| 384-well plate | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4406947 | |
| Amplification plate (QuantStudio 12K Flex OpenArray plate) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4470813 | Can be customized with any assays conforming to standard TaqMan conditions. |
| Accessories kit | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4469576 | Contains the case lids, plugs, and immersion fluid. |
| AccuFill tips | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4457246 | |
| Amplification machine (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4471090 | |
| Liquid handler (OpenArray AccuFill System) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4457243 | This is purchased with the amplification machine. |
| Primer design software (Primer Express) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4363991 | See manufacturer's instructions for detailed primer and probe specifications. |
| Image analysis program (ImageJ) | NIH | Available at http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Spreadsheet program (Excel) | Microsoft | Available at https://products.office.com/en-us/excel | |
| PCR plate spinner | VWR | 89184-608 | This device has only one speed (2500 rpm); the rotor starts when the lid is closed and stops when the button is pushed. |
| TE buffer | Millipore | 8890-100ML | 10mM Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, 1mM Ethylenediaminetetraacetic acid, pH 8.0 |
| DMEM | Thermo-Fisher/Gibco | 11965-092 | |
| Tissue disruptor (TissueLyser II) | Qiagen | 85300 | |
| Conventional thermal cycler (Veriti) | Thermo-Fisher/Applied Biosystems | 4375786 | Any conventional thermal cycler with a heated lid can be used. |
References
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