ensaios de quimiotaxia visuais são essenciais para um melhor entendimento de como as células eucarióticas controlar a migração celular mediada por direccional quimioatractor. Aqui, descrevemos métodos detalhados para: 1) em tempo real, monitoramento de alta resolução de vários ensaios de quimiotaxia, e 2) visualizando simultaneamente o gradiente quimioatrativo ea dinâmica espaço-temporais de eventos de sinalização em células HL60 neutrófilos-like.
Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.
As células eucarióticas sentir e se mover em direção a concentração mais elevada dentro de um gradiente de quimioatrativo, um processo celular referido como quimiotaxia. Quimiotaxia desempenha um papel crítico em diversos processos fisiológicos, tais como a embriogénese 1, neurónio padronização 2, a metástase de células cancerosas 3, o recrutamento de neutrófilos a locais de inflamação 4, e o desenvolvimento do organismo modelo Dictyostelium discoideum 5. Em geral, as células eucarióticas sentir quimioatractores utilizando receptores acoplados à proteína G 5. O acoplamento de quimioatractores com estes receptores promove a dissociação das proteínas G heterotriméricas Gu e Gβγ, que por sua vez activam as vias de transdução de sinal a jusante que, em última instância regulam a organização espaço-temporal do citoesqueleto de actina para dirigir a migração de células 9/5.
biólogos celulares têm vindo a desenvolver e melhorar chemotaxé ensaios para examinar o modo como medeia receptor acoplado a proteína G (GPCR) de sinalização dirigidas a migração celular. O ensaio de câmara ou migração transpoço Boyden foi desenvolvido em 1960 por Boyden 10. O ensaio funciona através da criação de um gradiente de compostos quimioatractivas entre dois poços que são separados por uma membrana microporosa. A sua simplicidade e facilidade de uso tornam o ensaio de quimiotaxia mais utilizado até à data. No entanto, o ensaio não permite que o processo de migração das células para ser visualizado. A câmara de Zigmond é o primeiro dispositivo microfluídico visual que permite imagens claras da migração celular em uma lamela através de uma constrição estreita em direção a um quimioatrativo fonte 11. Dunn 12 e 13 Insall modificada e melhorada a alta-resolução e capacidade de imagiologia de longo prazo do ensaio de quimiotaxia câmara Zigmond. Devido às características altamente previsíveis, difusão dominante de fluxo de fluido, microfluídica tem sido fornecendo soluções para a próxima geraçãem ensaios de quimiotaxia, tais como o EZ-TAXIScan (um dispositivo de análise de mobilidade celular).
Com a estabilidade do gradiente assegurada, o dispositivo permite seis ensaios de quimiotaxia de ser realizadas simultaneamente (Figura 1A). Em contraste com os gradientes direccionalmente fixos gerados nos vários ensaios câmara acima, o ensaio de agulha ou micropipeta desenvolvido por Guenther Gerisch gera um gradiente com uma fonte de móvel 14. No ensaio, quimioatractora é libertado a partir de uma micropipeta móvel para gerar um gradiente estável. Com este ensaio agulha, os pesquisadores descobriram que as células diferentes gerar pseudopods com características fundamentalmente diferentes. Aplicando a microscopia fluorescente, fomos capazes de visualizar a inclinação para facilitar a sua medição quantitativa todo 15. Neste estudo, descrevemos métodos detalhados para preparar HL60 quimiotático células (leucemia promielocítica humana), o monitoramento simultâneo múltiplos assa quimiotaxiays com o dispositivo de análise da mobilidade celular, e visualizando a dinâmica espaço-temporais mediada por GPCR de moléculas de sinalização, tais como a proteína quinase D1 em células vivas individuais, em resposta a estímulos visíveis quimioatractivas, espaço-temporalmente controlável. Os nossos métodos avançados de imagem pode ser aplicado a estudos de quimiotaxia gerais, e são especialmente adequados para os sistemas de células de mamíferos.
No presente estudo, nós mostram dois exemplos de ensaios de quimiotaxia: em primeiro lugar, a monitorização simultânea de vários ensaios de quimiotaxia por o dispositivo de análise da mobilidade celular; e segundo, a visualização do gradiente quimioatractor e a dinâmica espaço-temporais de eventos de sinalização nas mesmas células em tempo real.
dispositivo de análise da mobilidade celular para vários ensaios de quimiotaxia simultâneas
No presente estudo, nós introduzimos um protocolo detalhado para executar vários ensaios de quimiotaxia em simultâneo, utilizando um dispositivo de análise da mobilidade celular. Este dispositivo permite ao usuário observar o comportamento quimiotaxia celular com uma lente objetiva de 10X na observação de campo claro convencional. Por causa das características de difusão-dominante do fluxo de fluido, o dispositivo de análise da mobilidade celular gera gradientes altamente previsível, estável e permite até seis ensaios de quimiotaxia de ser efectuados simultaneamente. As etapas críticas do protocolo sãoobter gradientes confiáveis e alinhar as células na linha terraço. O usuário deve seguir rigorosamente as instruções do fabricante para a montagem de suporte e injeção de chemoattractants e células. Instruções detalhadas também estão disponíveis online. Comparado com os métodos alternativos de quimiotaxia 11-13,15, este dispositivo melhora significativamente a eficiência e fiabilidade de ensaios de quimiotaxia. Quatro tamanhos de mobilidade celular chip de dispositivo de análise de tamanhos de 4, 5, 6, e 8 uM estão disponíveis para acomodar diferentes tipos e tamanhos de células. Descobrimos que um chip de mobilidade celular dispositivo de análise 4 ou 5 mm é adequado para o HL60 e D. células discoideum, que são cerca de 10-15 um de diâmetro. No entanto, uma limitação é que este dispositivo não é adequado para todos os tipos de células. Tivemos pouco sucesso usando o ensaio de quimiotaxia dispositivo de análise da mobilidade celular com células Raw267.4. A razão pode ser que as células Raw267.4 migra muito lentamente. O tempo necessário para che eficientemotaxis de células Raw267.4 pode ser muito mais longo do que o tempo de um gradiente é mantida pelo dispositivo. Em vez disso, um ensaio de migração Transwell funcionou bem para células Raw267.4 9. Outra limitação é que a observação de fluorescência não é possível com o dispositivo de corrente. A direção futura é monitorar imagens fluorescentes com maior ampliação. Isso é possível com o dispositivo de análise da mobilidade celular melhorada, que está equipado com detecção fluorescente e uma lente objectiva 100X. Além disso, o número de ensaios simultâneos também é aumentada para 12. Todas estas melhorias facilitar a transferência melhorada de ensaios de quimiotaxia e a observação da dinâmica subcelulares em células migratórias.
Elevada eficiência de transfecção de células HL60 para expressar a proteína marcada com proteína fluorescente
células HL60 são uma linha celular de leucemia dividindo activamente e crescer em suspensão. Como relatado anteriormente 18-20, células HL60 são resistentes a Gtransferência eno. Tanto o lípido e a transferência de genes de electroporação foram testados, e maior eficiência de transfecção foi obtida com electroporação, como descrito em detalhe na secção 4. Obtendo a alta viabilidade após a electroporação é crítico para a obtenção de alta eficiência de transfecção por causa do dano grave que resulta da electroporação. Posteriormente, a manipulação de células profunda e suave são necessárias, especialmente após a eletroporação. Todos os suportes têm de ser pré-aquecido e gentilmente adicionado às células em todos os passos após a electroporação. Também é crítico para minimizar o tempo de exposição das células ao reagente de electroporação. Para evitar a morte celular, após a electroporação, meio RPMI 1640 recuperação electroporação tem de ser adicionada às células imediatamente. Verificou-se que 20% de FBS em meio de recuperação dá uma taxa de recuperação de células muito mais elevada do que 10% de FBS. Após a eletroporação, incubação em meio RPMI recuperação 1640 eletroporação para 30 min é fundamental para uma maior viabilidade e transfecçãoeficiência. Para aumentar ainda mais a eficiência da transfecção, foi também utilizado 4 ug de DNA de plasmídeo por transfecção, que é quase o dobro da quantidade de plasmídeo recomendado pelo fabricante.
Existem duas grandes limitações à transfecção de electroporação: a fugacidade da expressão da proteína e o limite do número de células (2 x 10 6 culas por transfecção). Em células indiferenciadas, a expressão é detectável apenas durante o primeiro par de divisões celulares, uma vez que o plasmídeo vector é diluído pela metade após cada divisão celular. Para HL60 diferenciadas células sobreviver não mais do que 48 h. Como resultado, qualquer experiência requer transfecções frescos 6 horas antes da experiência. O número de células para uma eletroporação apenas atende ao requisito mínimo para todos os ensaios bioquímicos. Para efeitos do uso repetitivo ou grande quantidade, é altamente recomendável que uma linha de células HL60 indiferenciado ser estabelecido que expressa de forma estável a proteína de interesse whiCH foi marcado com uma proteína fluorescente por um vector viral, um vector viral, se está disponível ou pode ser construído.
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the intramural fund of NIAID, NIH.
RPMI 1640 Medium GlutaMAX | Life technologies | 61870-036 | |
Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scietific | 11360-070 | |
Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
1M HEPES sterile solution, pH7.3 | Quality Biological Inc. | A611-J848-06 | |
Penicillin streptomycin solution | Fisher Scientific | 15140122 | |
NucleofectorTM 2b | Lonza | AAB-1001 | |
AmaxaTM Cell Line NucleofectorTM Kit V including NucleofectorTM Solution, Singe use pipettes, AmaxaTM certified 100 ml aluminum electrode cuvettes | Lonza | VCA-1003 | |
Lab-Tek chambered #1.0 Borosilicate Coverglass | Nalge Nunc International Inc | 155383 | |
2 % Gelatin solution | Sigma-Aldrich | G1393 | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
HBSS (Hanks’ Balanced Salt Solution) | Life technologies | 14025-076 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3803 | |
Single well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International Inc | 155361 | |
Four-well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International Inc | 155383 | |
Alexa 594 | Thermo Fisher Scientific | A-10438 | |
fMLP | Sigma -Aldrich | F3506-5MG | |
Cover glass thickness 2 22 x 22 mm | Corning | 2855-22 | |
EZ-TAXIScan | Effector Cell Institute, Inc. | MIC-1001 | |
EZ-TAXIScan chip (5 mm) | Effector Cell Institute, Inc. | EZT-F01-5 | |
1701RN 10ul syringe | Hamilton | 80030 | |
Femtotips II Injection tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | |
TransferMan NK2, including motor module, X head with angle adjuster, and Positioning aids. | Eppendorf | 5188900056 | |
DIAS software | Solltech Inc. | ||
LSM 780 META or equivalent confocal microscope with a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens | Carl Zeiss |