Imaging G Protein-Coupled Receptor-médiée chimiotactisme et ses événements de signalisation dans les cellules HL60 neutrophiles comme

1. Culture et Différenciation des humains neutrophiles comme cellules HL60 Préparer un milieu RPMI (Roswell Park Institute Memorial) 1,640 milieu de culture contenant du milieu RPMI 1640, 10% (v / v) de sérum de fœtus bovin (FBS), du pyruvate de sodium 0,1 mM, et 25 mM de HEPES (acide 4- (2-hydroxyéthyl) -1 l'acide -piperazineethanesulfonic). Chauffer le milieu de culture RPMI 1640 et 37 ° C. En utilisant un hémocytomètre déterminer la densité cellulaire des cellules HL60 pour vérifier que les cellules sont en phase de croissance en phase logarithmique. NOTE: Les cellules sont généralement en phase logarithmique le troisième jour après repiquage. La densité des cellules en phase logarithmique est généralement 6-8 x 10 5 cellules / ml. La densité cellulaire nécessaire pour démarrer une nouvelle culture est d' environ 1,5 x 10 5 cellules / ml. NOTE: Par exemple, pour une 10 ml nouvelle culture dans un flacon plat T-75, si la densité cellulaire des cellules en phase logarithmique est de 6 x 10 5 cellules / ml, puis 2,5 ml de cellules en phase logarithmique (6 x 10 5 ) est diluée à 1,5 x 10 5 cellules / ml dans 10 ml nouvelle culture. Pour un volume final de 10 ml de culture, 7,5 ml de RPMI 1640 milieu de culture est ajouté. Placez le volume calculé de chaud RPMI 1640 milieu de culture dans un flacon plat. Pour une culture en flacon T-75 plat, le volume total de la culture cellulaire est de 10 ml. Ajouter le volume calculé de cellules HL60 phase logarithmique de croissance dans le flacon à plat pour atteindre une densité cellulaire de 1,5 x 10 5 cellules / ml. Incuber les cellules à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2. NOTE: Le temps de doublement de HL60 est presque 24 h. Passage des cellules avec du RPMI 1640 du milieu de culture tous les 2-3 jours. Il est important que la densité cellulaire des cellules HL – 60 ne dépasse jamais 1,5 x 10 6 cellules / ml et le passage cellulaire ne dure pas plus de 2 mois. Différencier les cellules HL60 5 jours avant les expériences. REMARQUE: le milieu RPMI 1640 de différenciation contient du milieu RPMI 1640, 10% (v / v) de sérum de fœtus bovin (FBS), du pyruvate de sodium 0,1 mM, 25 mM d'HEPES et 1,3% de diméthylsulfoxyde (DMSO). En d'autres termes, elle est de 1,3% de DMSO dans du RPMI 1640 du milieu de culture. Pour différencier les cellules HL60, préchauffer le milieu de culture RPMI 1640 et 37 ° C. Ajouter le RPMI 1640 milieu de culture chaud dans un flacon plat. Pour une culture de 10 ml de la différenciation des cellules HL60 finale, ajouter 130 ul de DMSO directement au milieu de culture RPMI 1640 dans le ballon plat et en agitant le flacon de sorte que le DMSO est rapidement dilué par du milieu de culture RPMI 1640. Ajouter des cellules HL60 phase logarithmique jusqu'à une densité cellulaire finale de 1,5 x 10 5 cellules / ml dans 10 ml de milieu RPMI 1640 finale de différenciation. Cultiver les cellules dans du RPMI 1640 HL60 milieu de différenciation à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2 pendant 5 jours. 2. revêtement de la surface de couverture en verre de la Chambre 4well Prenez la bouteille de solution de gélatine de stock 2% par rapport au réfrigérateur, nettoyer avec 70% d'éthanol, et le placer dans la hotte. Take 1 ml solution à 2% de gélatine de stock et retourner immédiatement la gélatine solution mère restante au réfrigérateur. Laisser la solution de gélatine pour liquéfier complètement à 37 ° C et la pipette à fond. Diluer la solution à 2% de gélatine d'actions avec une solution saline équilibrée de 9 ml préchauffé 1x Hanks (HBSS) tampon à une concentration finale de 0,2% de gélatine. Ajouter 0,5 ml ou 2 ml de 0,2% de gélatine dans HBSS les deux puits moyen d'une chambre 4 puits ou une chambre 1 puits avec un couvercle en verre dans le fond, respectivement. Inclinez les plaques dans plusieurs directions pour que le liquide recouvre la totalité de la surface. Placer les plaques dans un incubateur à 37 °. Les plaques seront prêtes pour une utilisation dans 1 h. Ils peuvent être utilisés pour 5 jours. Juste avant l'ensemencement des cellules, enlever la solution de gélatine à partir des 4 puits ou 1 puits chambres. 3. chimiotactisme Assay Utilisation Cellule d'analyse Mobilité périphérique Préparer et réchauffer RPMI 1640 faim, qui est RPMIun milieu contenant 0,1 mM de pyruvate de sodium (en option) et HEPES 25 mM. Préparer 100 pi de 100 nM de fMLP (N-formylméthionyl-leucyl-phénylalanine) dans RPMI 1640 affamés moyen. Préparer 3 ml de 1% d'albumine de sérum bovin (BSA) / milieu RPMI 1640 contenant 1% de BSA dans du RPMI 1640 affamés milieu et 10 ml de BSA à 0,1% / RPMI 1640. Enduire une lamelle carré de 22 mm et d'une mobilité cellulaire puce de dispositif d'analyse de 5 um avec fraîchement préparé 1% de BSA / RPMI 1640 pendant 1 heure à température ambiante. Assembler le porteur selon la procédure suivante: Positionner la base de support avec les leviers dans la position verticale, de sorte que les leviers peuvent basculer vers l'utilisateur. Appliquer une solution d'éthanol à 70% à la surface du verre 41 mm. Essuyez soigneusement les surfaces avec une lingette, en prenant soin de ne pas les rayer. Insérez le verre de 41 mm dans la base de support. Mettez le 22 mm lamelle carré BSA revêtu sur le dessus du verre de 41 mm dans la base de support. NOTE: Le carré revêtu coverslip entre le verre de 41 mm et la puce permet chimiotaxie de se produire sur le substrat de la surface de revêtement. Insérer le joint torique (faible) dans le fond du logement de plaquette, et monter le logement de plaquette dans la base de support avec le trou elliptique à l'arrière. Tirez le niveau interne de la base de support vers la position horizontale pour verrouiller le logement de plaquette en position. Souffler toute poussière de l'intérieur du logement de plaquette avec un chiffon à poussière de l'air. Ajouter 4 ml de BSA à 0,1% / RPMI 1640 dans le logement de plaquette. Monter la puce du dispositif d'analyse de la mobilité cellulaire BSA revêtu dans le centre du logement de plaquette avec la face vers le bas de structure en contact avec le verre. NOTE: Que la puce doit être insérée avec la marque de positionnement (le trou dans la partie supérieure de la puce) à l'arrière. Fixer le joint d'étanchéité en caoutchouc sur la partie inférieure de la pince de la plaquette en ajustant les deux saillies sur le joint en caoutchouc dans les trous. Monter le joint torique (grande) surla partie supérieure du logement de plaquette. Monter la pince de tranche avec le trou de détection à l'arrière. Tirez le levier externe de la base du boîtier vers l'avant en position horizontale pour verrouiller la pince de la plaquette en place. Après le montage du support, placez le fond du support sur la boîte à lumière pour confirmer qu'il n'y a pas de bulles d'air dans les puits. Si des bulles d'air sont détectées, retirez-les à l'aide de la seringue en plastique fourni équipé d'un embout de chargement d'échantillon. Retirez le couvercle et placez l'ensemble sur la plaque sur le dessus de l'unité de dispositif d'analyse de la mobilité cellulaire. Fixer le bloc capteur sur le support. Préparer des cellules HL60 pour la chimiotaxie dosage: Calculer la densité cellulaire des cellules HL60 différenciées avec un hémocytomètre. Au bout de 5 jours de différenciation, de la densité des cellules est d' environ 1,0 x 10 6 cellules / ml. Calculer le volume final de cellules HL60 à une densité cellulaire finale de 2 x 10 6 cellules / ml. Par exemple, si la densité cellulaire de lacellules HL60 différenciées est de 1,0 x 10 6 cellules / ml, puis 10 ml de cellules HL60 différenciées seront remises en suspension avec 5 ml de 0,1% de BSA / milieu RPMI 1640 pour atteindre 2 x 10 6 cellules / ml. Centrifugeuse différenciée cellules HL60 à 200 xg pendant 5 min à température ambiante. Eliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules avec le volume calculé de 0,1% de BSA / milieu RPMI 1640 à l' étape 3.6.2) à une densité cellulaire finale de 2 x 10 6 cellules / ml. Démarrez l'unité de dispositif d'analyse de la mobilité cellulaire et PC pour l'acquisition d'image. Branchez l'appareil à l'ordinateur. Activer le dispositif d'analyse de la mobilité cellulaire. Allumez le PC. Start Up Cell Analysis Mobility Device Software. Observer 5 panneaux de contrôle: images caméra, chauffage, prise de vue, mémo, et l'appareil photo. Sur le panneau de contrôle de l'image de la caméra, utilisez "ligne horizontale" ou "ligne verticale" pour régler la position support / vue en temps réel pour centrer la caméra dans le panneau d'image de la caméra. Sur le panneau de contrôle de la caméra, sélectionnez CH1 à CH6 pour déplacer la caméra vers le canal défini. Pour centrer les champs d'un canal d'affichage, cliquez sur "Déplacer L" ou "Déplacer R" pour régler la coordonnée X de la caméra et centrer la position de l'appareil photo horizontalement. Réglez la coordonnée Y de la caméra en tournant le bouton de position sur le panneau avant de l'unité de dispositif d'analyse de la mobilité cellulaire pour ajuster verticalement l'image pour centrer l'écran. Sur le panneau de commande de chauffage, réglez le "temp de support" à 37,0 ° C et la "température de la plaque" à 39 ° C. Cliquez sur "Heat" pour commencer le chauffage. Également cliquer "titulaire" pour contrôler la température à l'aide du capteur thermique relié au support. Sur le panneau de tir, entrez "15 ​​sec" à "Interval" et "30 min" à "Time" pour les intervalles et la durée de l'essai de chimiotaxie. Cochez la case "appareil de chauffage à la fin de la prise de vue" pour des raisons de sécurité. Désigner un destination pour les images enregistrées. Sur le panneau de mémo, entrée les spécificités des expériences, telles que la lignée cellulaire utilisée, si oui ou non le traitement a été appliqué, et la concentration de chimio-attractants appliquées. Confirmer la position du centre de tous les canaux qui seront utilisés dans les expériences, et répéter l'ajustement pour tous les canaux si nécessaire. Injecter et Aligner les cellules comme suit: Retirer le tampon du support, et sortez 8 pi de tampon du troisième puits du haut pour chaque canal. Utiliser une seringue pour injecter 2 pi de cellules dans le deuxième puits dans le même canal, tout en surveillant l'écran en temps réel pour contrôler le nombre de cellules et le débit lors de l'injection. Après que les cellules sont bien alignées, ajouter immédiatement les 8 pi de tampon de retour. Répétez la même procédure pour les autres canaux (figure 1B). Ajouter 2 ml de tampon de retour sur le support, et ajouter 1 pl 100 nM fMLP au troisième puits du haut. Lancer l'acquisition d'image et enregistrer les données. Analyser les données obtenues en utilisant un logiciel de traçage 9 image (Figure 2). 4. Transfection avec électroporation Différencier cellules HL60 5 jours avant l'expérience comme décrit dans la section 1. Coat 4 puits ou 1 puits chambres comme indiqué à la section 2. Préparer et chauffer le milieu RPMI 1640 de récupération de l'électroporation, contenant du milieu RPMI 1640, 20% (v / v) de FBS, du pyruvate de sodium 0,1 mM, et 25 mM de HEPES, à 37 ° C. Juste avant de commencer l'expérience de transfection, soit ajouter 300 pi ou 3 ml de RPMI 1640 du milieu de culture dans les puits des chambres de pré-enduites 4 puits ou cupules 1, respectivement. Incuber les chambres humidifiée dans un incubateur à 37 ° C avec 5% de CO 2. Utilisez ces chambres immédiatement ou conserver dans l'incubateur pour une utilisation future (deux semaines). Compter la densité des cellules différenciées du HL60 cellules avec un hémocytomètre. REMARQUE: La densité cellulaire atteint souvent d' environ 1,0 x 10 6 cellules / ml. La densité cellulaire supérieure à 3,0 x 10 cellules 6 / ml donne généralement l' efficacité de transfection indésirable. Comme les cellules HL60 sont des cellules en suspension, aucune remise en suspension est requise. Centrifuger les cellules à 200 xg pendant 5 min à température ambiante. Eliminer le surnageant et remettre en suspension de 2 x 10 6 cellules HL60 dans 100 ul de réactif de transfection. Ajouter 4 pg de GFP-PKD1 plasmidique 9 dans le mélange de 100 pi de cellules et de réactifs de transfection et mélanger doucement et soigneusement. Ajouter le mélange dans la cuvette prévue. Sélectionnez le programme de pré-série du fabricant pour la lignée cellulaire leucocytaire humain et effectuer la électroporation. NOTE: Des informations complémentaires sont disponibles sur le site Web du fabricant. Après l'électroporation, immédiatement et lentement ajouter préchauffée 500 ul de RPMI 6140 milieu de récupération d'électroporation aux cellules, ettransférer doucement les cellules de la cuvette dans un tube de 1,6 ml à la pipette en plastique fournis. Incuber les cellules pendant 30 min dans un humidifiée à 37 ° C incubateur avec 5% de CO 2. Graine de 100 pi ou 500 pi de cellules dans un puits d'une 4 puits ou une chambre 1 puits, respectivement. Ajouter du RPMI 1640 du milieu de culture jusqu'à un volume final de 1 ml ou 4 ml de ce même puits d'un puits 4 ou d'une chambre 1 puits, respectivement. Incuber les cellules dans un humidifiée à 37 ° C incubateur avec 5% de CO2 pendant 3 h. Préchauffer RPMI 1640 affamés à 37 ° C. En utilisant une pipette de 1ml, retirez délicatement 0,8 ml ou 3 ml de milieu RPMI 1640 culture du puits d'une chambre 4 puits ou une chambre 1 puits, respectivement. Soyez doux et éviter aspirer les cellules HL60 adhèrent. NOTE: les cellules HL60 se développent et se différencient dans les milieux de suspension. Après avoir été différenciés ou avec certains traitements, les cellules HL60 adhèrent au substrat revêtu avec de la polylysine, le collagène, la gélatine, ou fifibronectine. Ajouter 0,8 ml ou 3 ml de RPMI 1640 affamés milieu dans le puits d'une chambre 4 puits ou 1 puits, respectivement. Attendre 1 h. NOTE: A ce stade , les cellules sont prêtes pour des expériences d'imagerie 9. 5. Suivi GPCR médiée Membrane translocation de PKD1 par Multi-canal Fluorescent Microscopie Préparer un nouveau mélange de 100 nM de fMLP et 1 pg / ml Alexa 594 dans RPMI 1640 affamés moyen comme stimuli. NOTE: Le mélange de fMLP et Alexa 594 a besoin d'être fraîchement préparé pour assurer une efficacité maximale. Monter une chambre 4 puits ensemencé avec des cellules sur une lentille d'huile 40X. Réglez le microscope à fluorescence dans la configuration multicanal comme suit: Réglez le canal vert d'émission (500-530 nm) pour la GFP-tagged PKD1, canal d'émission rouge (580-620 nm) pour chimiotactique fMLP (Alexa 594), et le canal de lumière transmise pour identifier les cellules HL60 adhèrent. Lancer acquisition "live" etoptimiser les conditions d'acquisition des trois canaux: Affiner entre l'intensité et la puissance du laser pour les trois canaux afin de minimiser photoblanchiment pendant une période plus longue de l'imagerie. Si nécessaire, en moyenne tous les 2 à 4 cadres pour diminuer le bruit de fond pour une meilleure qualité des images. Utilisez un intervalle de 1 sec. Recherche pour faire adhérer les cellules qui expriment une forte PKD1-GFP dans la vue du canal GFP et DIC (contraste d'interférence différentiel). les cellules adhérentes sont morphologiquement plat et ne se déplacent pas rapidement. Après avoir identifié les cellules HL60 adhèrent fortement que expriment la GFP-PKD1, d' optimiser les conditions d'acquisition en diminuant la puissance du laser , tout en augmentant le gain du détecteur pour chaque canal pour diminuer le photoblanchiment pour l' imagerie à long terme (figure 3A). Prenez 100 pi de fMLP / Alexa 594 solution avec une pipette ul 200 et mettre de côté. Sélectionnez l'option "acquisition time-lapse" et définir les intervalles de2 s et le nombre d'images à acquérir pour cent. REMARQUE: les intervalles et le nombre d'images à acquérir dépendent des fins d'expérimentation. 1-2 intervalles sec et 100 cadres sont souvent utilisés pour des expériences d'imagerie, comme dans la figure 3. Pour migrer lentement les cellules, des intervalles plus longs sont nécessaires pour l' imagerie à long terme. En revanche, pour la migration rapide des cellules, des intervalles plus courts sont nécessaires pour observer les détails continus de la migration cellulaire. prendre avec précaution le couvercle d'une chambre 4 puits de telle sorte que la position de la chambre ne change pas. Lancer acquisition immédiatement et acquérir 3-5 images des cellules non stimulées tout en positionnant la pipette 200 pi directement sur les cellules en utilisant la tache de lumière laser comme guide. Pipette le 594 mélange fMLP / Alexa sur les cellules étant imagée avec un rapide et même débit et terminer le jeu complet d'acquisition time-lapse. Nom et enregistrer les données qui seront soumis à une analyse plus approfondie des données. </ol> 6. Cellules Imaging Chemotaxing dans Stimuli de Chemo-attractant visibles et contrôlables L'utilisation d'un 10 micropipetteur et d'injection des conseils pi, remblayer une micropipette avec 30 ul fraîchement mélange de fMLP et Alexa594 préparés. Attacher la micropipette à un support de micro-pipette monté sur une platine de microscope, et raccorder le tuyau à l'unité d'alimentation en pression, un appareil qui fournit une pression constante pour libérer la solution fMLP / Alexa594 de la micropipette pour produire un gradient constant. Allumez l'alimentation en pression et régler la pression de compensation (Pc) à 70 hPa. Monter une lamelle 1 puits chambré ensemencées avec des cellules HL60 exprimant PKD1-GFP sur une lentille d'huile 40X sur un microscope confocal ou son microscope à fluorescence équivalent. Réglez l'acquisition en mode canal dans la configuration suivante: canal vert (500-530 nm) pour PKD1 GFP-tagged; canal rouge (580-620 nm) pour chimiotactique fMLP (Alexa594); et transMitted canal de lumière pour identifier les cellules HL60 adhèrent. Lancer acquisition "live" et d'optimiser les conditions d'acquisition pour les trois canaux: ajuster les intensités de chaque canal pour l'analyse quantitative des données d'imagerie; affiner entre l'intensité et la puissance du laser pour les trois canaux pour obtenir des images avec la meilleure qualité et de minimiser la photo-blanchiment. Si nécessaire, en moyenne tous les 2 à 4 cadres pour une meilleure qualité d'image. Nous utilisons habituellement un intervalle de 1 sec. Lancer acquisition "live" et la recherche de l'adhésion des cellules qui expriment une forte PKD1-GFP dans la vue de la GFP et les canaux de lumière transmise. En utilisant l' optique champ clair, centre du micropipette dans le domaine du centre de vue (figure 4A) afin de visualiser le gradient fMLP et les cellules HL60 adhérentes exprimant PKD1-GFP. Sélectionnez acquisition time-lapse et définir les intervalles à 2 seconde d'intervalle et le nombre d'images à acquérir 100. NOTE: Après la collecte de chaque tsérie ime-lapse, le nom et enregistrer les données qui seront soumis à une analyse plus approfondie des données.