analisi chemiotattica visivi sono essenziali per una migliore comprensione di come le cellule eucariotiche controllare la migrazione delle cellule direzionale chemoattractant-mediata. Qui, descriviamo i metodi dettagliati per: 1) in tempo reale, il monitoraggio ad alta risoluzione di molteplici analisi chemiotattica, e 2) visualizzando contemporaneamente il gradiente chemiotattico e le dinamiche spazio-temporali di eventi in cellule HL60 neutrofili simile segnalazione.
Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.
Le cellule eucariotiche senso e si muovono verso la maggiore concentrazione all'interno di un gradiente chemiotattico, un processo cellulare indicato come chemiotassi. Chemiotassi gioca un ruolo critico in molti processi fisiologici, come l'embriogenesi 1, neurone patterning 2, le metastasi delle cellule tumorali 3, il reclutamento dei neutrofili a siti di infiammazione 4, e lo sviluppo del modello di organismo Dictyostelium discoideum 5. In generale, le cellule eucariotiche senso chemoattractants utilizzando G-proteine recettori accoppiati 5. L'impegno di chemiotattici con questi recettori promuove la dissociazione delle proteine G eterotrimeriche Gα e Gβγ, che a loro volta attivano vie di trasduzione del segnale a valle che infine regolano l'organizzazione spazio-temporale del citoscheletro actina di guidare la migrazione delle cellule 5-9.
biologi cellulari stanno sviluppando e migliorando la chemiotassiè metodi per esaminare come recettori accoppiati a proteine g (GPCR) di segnalazione media la migrazione delle cellule dirette. Il saggio della camera o la migrazione transwell Boyden è stato sviluppato nel 1960 da Boyden 10. Il test funziona creando un gradiente di composti chemotattiche tra due pozzetti separati da una membrana microporosa. La sua semplicità e facilità d'uso rendono il saggio chemiotassi più usato fino ad oggi. Tuttavia, il test non consente al processo di migrazione delle cellule da visualizzare. La camera di Zigmond è il primo dispositivo a microfluidi visivo che permette l'imaging chiaro di migrazione delle cellule su un vetrino in una costrizione stretto verso una fonte chemoattrattante 11. Dunn 12 e 13 Insall modificati e migliorati ad alta risoluzione e la capacità di imaging a lungo termine del test chemiotassi camera di Zigmond. A causa delle caratteristiche, altamente prevedibili di diffusione dominante di flusso del fluido, microfluidica è stata fornitura di soluzioni per il prossimo-Generatisu analisi chemiotattica come EZ-TAXIScan (un dispositivo di analisi della mobilità delle cellule).
Con la stabilità del gradiente assicurato, il dispositivo consente sei chemiotassi test da effettuare contemporaneamente (Figura 1A). In contrasto con i gradienti direzionalmente fissi generati nei vari saggi camera sopra, il saggio ago o micropipetta sviluppato da Guenther Gerisch genera un gradiente con una sorgente mobile 14. Nel saggio, chemiotattico viene rilasciato da una micropipetta mobile per generare un gradiente stabile. Con questo test l'ago, i ricercatori hanno scoperto che le cellule diverse generano pseudopodi con caratteristiche fondamentalmente diverse. L'applicazione di microscopia a fluorescenza, siamo stati in grado di visualizzare il gradiente per facilitare la sua misurazione quantitativa tutto 15. In questo studio, descriviamo metodi dettagliati per la preparazione chemiotattica HL60 (leucemia promielocitica umana), le cellule, il monitoraggio contemporaneamente più assa chemiotassiys con il dispositivo di analisi della mobilità delle cellule, e la visualizzazione dei GPCR-mediata dinamiche spazio-temporali di molecole di segnalazione come la proteina chinasi D1 in singole cellule vive in risposta a stimoli visibili, chemotattiche spatiotemporally controllabili. I nostri metodi di imaging avanzati possono essere applicati a studi generali chemiotassi, e sono particolarmente adatti per sistemi cellulari di mammifero.
Nel presente studio, mostriamo due esempi di analisi chemiotattica: in primo luogo, il monitoraggio simultaneo di molteplici analisi chemiotattica dal dispositivo di analisi della mobilità delle cellule; e in secondo luogo, la visualizzazione del gradiente chemiotattico e le dinamiche spazio-temporali degli eventi nelle stesse celle in tempo reale di segnalazione.
dispositivo di analisi della mobilità cellulare per più analisi chemiotattica simultanei
Nel presente studio, abbiamo introdotto un protocollo dettagliato per eseguire più analisi chemiotattica simultanea utilizzando un dispositivo di analisi della mobilità delle cellule. Questo dispositivo permette di osservare il comportamento chemiotassi cellulare con una lente obiettivo 10X in osservazione in campo chiaro convenzionale. A causa delle caratteristiche di diffusione dominante del flusso di fluido, il dispositivo di analisi della mobilità cellulare genera altamente prevedibili, gradienti stabili e consente fino a sei analisi chemiotattica essere effettuate simultaneamente. I passaggi critici del protocollo sonoavere gradienti affidabili e allineare le celle nella riga terrazza. L'utente deve seguire rigorosamente le istruzioni del produttore per il montaggio titolare e l'iniezione di fattori chemiotattici e cellule. Istruzioni dettagliate sono disponibili anche online. Rispetto ai metodi alternativi chemiotassi 11-13,15, questo dispositivo migliora notevolmente l'affidabilità e l'efficienza di analisi chemiotattica. Quattro formati di mobilità cellulare chip del dispositivo di analisi in dimensioni di 4, 5, 6, e 8 micron sono disponibili per ospitare diversi tipi e dimensioni di cellule. Abbiamo scoperto che una mobilità cellulare chip del dispositivo di analisi 4 o 5 micron è adatto per l'HL60 e D. cellule discoideum, che sono circa il 10-15 micron di diametro. Tuttavia, una limitazione è che questo dispositivo non è adatto per tutti i tipi di cellule. Abbiamo avuto poco successo con il saggio chemiotassi dispositivo di analisi della mobilità delle cellule con le cellule Raw267.4. La ragione può essere che le cellule migrano Raw267.4 troppo lentamente. Il tempo necessario per Che efficientemotaxis di cellule Raw267.4 potrebbe essere molto più lungo del tempo di un gradiente viene mantenuta dal dispositivo. Invece, un test di migrazione transwell ha funzionato bene per le cellule Raw267.4 9. Un'altra limitazione è che l'osservazione fluorescente non è possibile con il dispositivo corrente. Una direzione futura è quello di monitorare l'imaging a fluorescenza con ingrandimento maggiore. Questo è possibile con il dispositivo perfezionato analisi della mobilità cellulare, che è dotato di rilevazione fluorescente ed una lente obiettivo 100X. Inoltre, il numero di saggi simultanee è anche aumentata a 12. Tutti questi miglioramenti facilitano la maggiore throughput analisi chemiotattica e l'osservazione delle dinamiche subcellulari nella migrazione delle cellule.
Elevata efficienza di trasfezione di cellule HL60 per esprimere la proteina proteina fluorescente-tag
cellule HL60 sono una linea cellulare di leucemia dividendo attivamente e crescono in sospensione. Come precedentemente riportato 18-20, cellule HL60 sono resistenti gtrasferimento ene. Sia lipidi e il trasferimento genico elettroporazione sono stati testati, e una maggiore efficienza di trasfezione è stato ottenuto con elettroporazione, come descritto in dettaglio nel capitolo 4. Recupero alta vitalità dopo l'elettroporazione è fondamentale per l'ottenimento di alta efficienza di trasfezione a causa del grave danno che deriva dalla elettroporazione. Successivamente, la gestione accurata e delicata delle cellule sono necessari, soprattutto dopo l'elettroporazione. Tutti i supporti devono essere pre-riscaldato e delicatamente aggiunto alle cellule in tutte le misure dopo l'elettroporazione. È anche fondamentale ridurre al minimo il tempo di esposizione delle cellule alla reagente elettroporazione. Per evitare la morte delle cellule, dopo l'elettroporazione, RPMI 1640 medium recupero elettroporazione deve essere aggiunto alle cellule immediatamente. Abbiamo scoperto che il 20% FBS a medio recupero dà un tasso di recupero delle cellule molto superiore al 10% FBS. Dopo l'elettroporazione, incubazione in RPMI medio recupero 1640 elettroporazione per 30 minuti è fondamentale per una maggiore vitalità e trasfezioneefficienza. Per aumentare ulteriormente l'efficienza di trasfezione, abbiamo usato anche 4 mg plasmide DNA per trasfezione, che è quasi la quantità doppia di plasmide consigliato dal produttore.
Ci sono due principali limitazioni su elettroporazione trasfezione: la transitorietà della espressione della proteina e il limite di numero di cellule (2 x 10 6 cellule per trasfezione). In cellule indifferenziate, espressione è rilevabile solo durante il primo paio di divisioni cellulari, poiché il vettore plasmidico è diluito metà dopo ogni divisione cellulare. Per Il HL60 differenziate cellule sopravvivono non più di 48 ore. Come risultato, ogni esperimento richiede trasfezioni freschi 6 ore prima dell'esperimento. Il numero di cellule per una elettroporazione solo soddisfa il requisito minimo per tutti i saggi biochimici. Ai fini di uso ripetitivo o grande quantità, si raccomanda vivamente che si stabilisca una linea di cellule HL60 indifferenziata che stabilmente esprime la proteina di interesse WHIch è stato etichettato con una proteina fluorescente da un vettore virale, se un vettore virale è disponibile o può essere costruito.
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the intramural fund of NIAID, NIH.
RPMI 1640 Medium GlutaMAX | Life technologies | 61870-036 | |
Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scietific | 11360-070 | |
Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
1M HEPES sterile solution, pH7.3 | Quality Biological Inc. | A611-J848-06 | |
Penicillin streptomycin solution | Fisher Scientific | 15140122 | |
NucleofectorTM 2b | Lonza | AAB-1001 | |
AmaxaTM Cell Line NucleofectorTM Kit V including NucleofectorTM Solution, Singe use pipettes, AmaxaTM certified 100 ml aluminum electrode cuvettes | Lonza | VCA-1003 | |
Lab-Tek chambered #1.0 Borosilicate Coverglass | Nalge Nunc International Inc | 155383 | |
2 % Gelatin solution | Sigma-Aldrich | G1393 | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
HBSS (Hanks’ Balanced Salt Solution) | Life technologies | 14025-076 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3803 | |
Single well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International Inc | 155361 | |
Four-well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International Inc | 155383 | |
Alexa 594 | Thermo Fisher Scientific | A-10438 | |
fMLP | Sigma -Aldrich | F3506-5MG | |
Cover glass thickness 2 22 x 22 mm | Corning | 2855-22 | |
EZ-TAXIScan | Effector Cell Institute, Inc. | MIC-1001 | |
EZ-TAXIScan chip (5 mm) | Effector Cell Institute, Inc. | EZT-F01-5 | |
1701RN 10ul syringe | Hamilton | 80030 | |
Femtotips II Injection tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | |
TransferMan NK2, including motor module, X head with angle adjuster, and Positioning aids. | Eppendorf | 5188900056 | |
DIAS software | Solltech Inc. | ||
LSM 780 META or equivalent confocal microscope with a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens | Carl Zeiss |