イメージングGタンパク質共役型受容体媒介走化性及び好中球様HL60細胞におけるそのシグナル伝達のイベント

1.文化と人間の分化好中球様HL60細胞準備RPMI（ロズウェルパーク記念研究所）、RPMI 1640培地、10％（v / v）のウシ胎児血清（FBS）、0.1mMのピルビン酸ナトリウムを含有する1640培地、及び25mMのHEPES（4-（2-ヒドロキシエチル）-1- -piperazineethanesulfonic酸）。 37°CまでRPMI 1640培地を温めます。 血球計数器を使用することで、細胞が対数増殖期の段階にあることを確認するHL60細胞の細胞密度を決定します。 注：細胞は、継代後の第3日目の対数期であるのが普通です。対数期の細胞の密度は、通常、6~8×10 5細胞/ mlです。新しい培養を開始するために必要な細胞密度は、約1.5×10 5細胞/ mlです。 注：例えば、T-75フラットフラスコ中で10 mlの新しい培養に、対数期の細胞の細胞密度は、その後、6×10 5細胞/ ml、対数期の細胞（2.5mlの6×10 5である場合）10 mは1.5×10 5細胞/ mlに希釈しリットル新しい文化。 10mLの培養物の最終容量を作成するために、たRPMI1640培地7.5mlを添加します。 フラットフラスコに温かいRPMI 1640培地の計算されたボリュームを置きます。 T-75フラットフラスコ培養のために、細胞培養の全体積を10mlです。 1.5×10 5細胞/ mlの細胞密度に達するために平坦なフラスコに対数期成長HL60細胞の計算されたボリュームを追加します。 5％CO 2の加湿インキュベーター中37℃で細胞をインキュベートします。 注：HL60の倍加時間は、ほぼ24時間です。 継代RPMI 1640培地で細胞を2〜3日ごと。 HL60細胞の細胞密度が決して1.5×10 6細胞/ mlを超えず、セル流路がもはや2ヶ月以上続くことが重要です。 5日間の実験の前にHL60細胞を分化します。 注：RPMI 1640分化培地に含まれているRPMI 1640培地、10％（v / v）のウシ胎児血清（FBS）、0.1mMのピルビン酸ナトリウム、25mMのHEPES、1.3％ジメチルスルホキシド（DMSO）。言い換えれば、それは、RPMI1640培地中の1.3％のDMSOです。 HL60細胞を区別するために、37°C​​までのRPMI1640培地を予め温めます。フラットフラスコに温かいRPMI 1640培地を追加します。 DMSOは、急速に、RPMI1640培地によって希釈されるように、フラスコを旋回しながら、最終的な10 mlのHL60分化培養のために、平坦なフラスコに、RPMI1640培地に直接に130μlのDMSOを加えます。 最終的な10 mlのRPMI1640中の分化培地で1.5×10 5細胞/ mlの最終細胞密度に対数期のHL60細胞を加えます。 5日間、5％CO 2の加湿インキュベーター中、37℃で培養したRPMI 1640中でHL60細胞は、分化培地。 2. 4well商工会議所のカバーガラスの表面をコーティング 、冷蔵庫から2％ゼラチンストック溶液のボトルを取り、70％エタノールでそれをきれいにし、フード内に配置します。 T1ミリリットルの2％ゼラチン原液AKEとすぐに冷蔵庫に残っているゼラチン原液を返します。 ゼラチン溶液が完全に37℃で液化し、徹底的にピペットを許可します。 0.2％ゼラチンの最終濃度までバッファ9 mlの2％ゼラチンストック溶液の予熱した1×ハンクス平衡塩溶液（HBSS）で希釈します。 それぞれ、底部のカバーガラスで4ウェルチャンバーの2つの中間のウェルまたは1ウェルチャンバーにHBSSに0.5ミリリットルまたは2ミリリットル0.2％のゼラチンを追加します。液体が表面領域全体を覆うように、いくつかの方向にプレートを傾けます。 37℃のインキュベーターでプレートを置きます。プレートを1時間で使用できるようになります。彼らは、最大5日間使用することができます。ただ細胞を播種する前に、4ウェルまたは1ウェルチャンバーからゼラチン溶液を除去します。 3.走化性アッセイ用いた細胞モビリティ分析装置準備し、RPMIで暖かいRPMI 1640飢え培地、0.1mMのピルビン酸ナトリウム（オプション）と25mMのHEPESを含む培地。 培地を飢えRPMI 1640中100 nMでのfMLP（N-ホルミル – ロイシル – フェニルアラニン）の100μlのを準備します。 1％ウシ血清アルブミン（BSA）/ 0.1％BSA / RPMI 1640培地の培地10 mlで飢餓RPMI 1640中の1％BSAを含有するRPMI 1640培地を3mlを準備します。 コー​​ト22ミリメートルの正方形のカバースリップし、室温で1時間、新たに調製した1％BSA / RPMI 1640培地で5μmのセル移動度分析素子チップ。 以下の手順を使用して、ホルダーを組み立て： レバーは、ユーザーに向けて傾けることができるように垂直位置にあるレバーとホルダベースを置きます。 70％エタノール溶液41ミリメートルのガラスの表面に適用されます。慎重にそれらを傷つけないように注意しながら、ワイプで表面を拭いてください。 ホルダベースに41ミリメートルのガラスを挿入します。ホルダベースで41ミリメートルのガラスの上に、BSAでコーティングした22ミリメートルの正方形カバーグラスを置きます。 注：コーティングされた正方形のC41ミリメートルのガラスとチップ間のoverslipは走化性は、塗膜表面の基層上で発生することができます。 ウエハハウジングの底部にOリング（小）を挿入し、背面にある楕円形の穴を持つホルダーベースにウェーハ収納をマウントします。位置にウェーハ収納をロックするために前方に水平位置にホルダーベースの内側のレベルを引き上げます。 エアダスターでウエハハウジングの内部からほこりを飛ばし。ウェーハ収納に0.1％BSA / RPMI 1640培地の4ミリリットルを追加します。 ガラスと接触して下方に構造的な顔をしたウェーハ収納の中心部にあるBSAでコーティングされた細胞の移動度分析素子チップをマウントします。 注：チップは後方に位置合わせマーク（チップの上部の穴）に挿入する必要があること。 穴にゴム製のガスケット上の2つの突起を嵌合することにより、ウェハクランプの底部にゴムパッキンを貼り付けます。 上にOリング（大）をマウントウェーハ収納のトップ。後部にセンサー穴を有するウェハクランプをマウントします。代わりに、ウェハクランプをロックする水平位置に前方ハウジングベースの外側のレバーを引きます。 ホルダーを組み立てた後、ウェル中に気泡がないことを確認するために、光ボックスのホルダーの底に置きます。気泡が検出された場合は、サンプルローディングチップを装着し提供プラスチック注射器を使用してそれらを削除します。 カバーを外し、セル移動度分析装置ユニットの上部にプレート上にアセンブリを置きます。ホルダにセンサブロックを取り付けます。 走化性アッセイのためにHL60細胞を準備します。 血球計数器で分化したHL60細胞の細胞密度を計算します。分化の5日後、細胞密度は約1.0×10 6細胞/ mlです。 2×10 6細胞/ mlの最終細胞密度でHL60細胞の最終体積を計算します。例えば、細胞密度分化したHL60細胞を1.0×10 6細胞/ mlであり、次いで、分化したHL60細胞を10mlの2×10 6細胞/ mlに到達するために、0.1％BSA / RPMI 1640培地5mlで再懸濁されます。 遠心分離機は200でHL60細胞を分化しました 室温で5分間XG。上清を除去し、ステップ3.6.2において0.1％BSA / RPMI 1640培地の計算された量で細胞を再懸濁さ）2×10 6細胞/ mlの最終細胞密度に。 画像取得のための細胞の移動度分析装置ユニットとPCを起動します。本機とパソコンを接続します。セル移動度分析装置の電源をオンにします。 PCの電源をオンにします。 セルモビリティ分析デバイスソフトウェアを起動します。 カメラ、ヒーター、撮影、メモ、およびカメラ画像：5コントロールパネルを確認します。 カメラ画像のコントロールパネルでは、カメラ画像パネルでカメラを中心にリアルタイムでホルダー/ビューの位置を調整する「水平線」または「縦線」を使用します。 カメラコントロールパネルで、定義されたチャンネルにカメラを移動するために、CH6にCH1を選択します。チャネルの視野を中心に、カメラのX座標と水平方向にカメラの位置を中央調整する「Rの移動」「移動L」をクリックしますか。 Y座標縦に画面を中央に画像を調整するための細胞移動度分析装置ユニットのフロントパネルに位置ノブを回してカメラのを調整します。 ヒーターコントロールパネルで、39℃に37.0℃までの「ホルダーの一時」と「プレートの温度」​​に設定します。加熱を開始するには「熱」をクリックしてください。また、ホルダに接続された温度センサを使用して温度を制御する「ホルダー」をクリックします。 撮影パネルで、「間隔」で「15秒」との間隔のための「時間」は、「30分」と走化性アッセイの期間を入力します。チェックし、安全上の理由から、「撮影の最後にオフヒーター」。ドを指定保存された画像のためのstination。 メモパネルに、そのような細胞株のような実験を入力詳細は、治療が適用されたかどうか、使用、および化学誘引物質の濃度は、適用しました。 実験に使用されるチャネルのすべての中心位置を確認し、必要に応じてすべてのチャンネルの調整を繰り返します。 下記のように細胞を注入し、揃えます： ホルダーからバッファを削除し、各チャンネルの上から第3ウェルからのバッファの8μLを取り出します。 細胞数を制御し、注入時に流れるように、リアルタイムで画面を監視しながら、同じチャンネルで第2のウェルへの細胞の2μLを注入するために注射器を使用してください。細胞がきれいに整列された後、すぐにバッファバックの8μlを添加します。他のチャンネル（ 図1B）に対して同じ手順を繰り返します。 バックホルダーにバッファ、および1μlの100 nMのFMは追加2ミリリットルを追加します。上から第3ウェルにLP。画像の取得を開始し、データを保存します。ソフトウェア9をトレースした画像（ 図2）を用いて得られたデータを分析します。 エレクトロポレーション4.トランスフェクション第1コート4ウェルまたは1ウェルチャンバーで説明したように第2の指示に従って5日間実験の前にHL60細胞を分化します。 準備し、37℃でRPMI 1640培地、20％（v / v）のFBS、0.1mMのピルビン酸ナトリウム、および25mM HEPESを含有する温かいたRPMI1640エレクトロ回収媒体。 右側のトランスフェクション実験を開始する前に、それぞれ、事前にコーティングされた4ウェルまたは1ウェルチャンバーのウェルに300μlあるいは3ミリリットルRPMI 1640培地のいずれかを追加します。 5％CO 2で加湿した37℃のインキュベーター中でチャンバーをインキュベートします。これらのチャンバは、直ちに使用するか、将来の使用のためのインキュベーター（2週間）に格納します。 分化したHL6の細胞密度をカウントし血球計数器で0細胞。 注：細胞密度は、多くの場合、約1.0×10 6細胞/ mlに達しました。 3.0×10 6細胞/ mlより高い細胞密度は、通常、望ましくないトランスフェクション効率を与えます。 HL60細胞は浮遊細胞であるため、全く再懸濁する必要はありません。 200で細胞を遠心分離 室温で5分間XG。上清を除去し、トランスフェクション試薬を100μlの2×10 6 HL60細胞を再懸濁。 細胞およびトランスフェクション試薬100μlの混合物にGFP-PKD1プラスミド9の4μgのを加え、穏やかにし、十分に混合します。提供キュベットに混合物を追加します。 ヒト白血球細胞株については、製造元の事前設定されたプログラムを選択し、エレクトロポレーションを行います。 注意：より詳細な情報については、製造元のWebサイトから入手可能です。 エレクトロポレーション後、すぐに、穏やかに細胞に予め温めておいた500μlのRPMI 6140エレクトロポレーション回復培地を追加し、静かに提供するプラスチック製のピペットで1.6ミリリットルチューブにキュベットから細胞を移します。 5％CO 2で加湿した37℃のインキュベーター中で30分間、細胞をインキュベートします。 4ウェルまたは1ウェルチャンバーの1つのウェルにシード100μlあるいは細胞を500μl、それぞれ。 それぞれ、4ウェルまたは1ウェルチャンバーの同じウェルに1 mlまたは4 mlの最終体積にしたRPMI1640培地を加えます。 3時間、5％CO 2で加湿した37℃のインキュベーター中で細胞をインキュベートします。 37°Cにプリ暖かいRPMI 1640飢え培地。 1ミリリットルピペットを用いて、静かにそれぞれ、4ウェルチャンバーのウェルまたは1ウェルチャンバーからRPMI 1640培地の0.8ミリリットルまたは3ミリリットルを削除します。穏やかなおよびHL60細胞を付着離れて吸引を避けます。 注：HL60細胞が成長し、懸濁媒体中で区別されます。差別化された後、または特定の治療と、HL60細胞は、ポリリジン、コラーゲン、ゼラチン、ま​​たはFi接続でコーティングされた基層に接着しますフィブロネクチン。 それぞれ、4ウェルまたは1ウェルチャンバーのウェルに培地を飢え0.8ミリリットルまたはRPMI 1640の3ミリリットルを追加します。 1時間待ちます。 注：この時点で、細胞は、イメージング実験9の準備ができています。 5.マルチチャネル蛍光顕微鏡によりPKD1のGPCRが媒介する膜トランスロケーションを監視刺激等の媒体を飢えRPMI 1640中100 nMでのfMLPとを1μg/ mlのAlexaの594の新鮮な混合物を準備します。 注：fMLPのおよびAlexa 594ニーズの混合物を新たに最大の効果を保証するために行われます。 マウント1 4ウェルチャンバーは、40X油レンズの上に細胞を播種しました。 下記のようにマルチチャンネル構成で、蛍光顕微鏡を設定します。 付着したHL60細胞を同定するための化学誘引物質fMLPのためのGFPタグPKD1、赤色発光チャネル（580から620 nm）を（アレクサ594）用の緑色発光チャネル（500から530ナノメートル）、および透過光チャネルを設定します。 「ライブ」の取得を開始し、3つのチャネルの取得条件を最適化します： イメージングの長い期間のための光退色を最小限に抑えるために、すべての3つのチャネルのための強度とレーザパワーと微調整。 必要であれば、画像の質の向上のためのバックグラウンドノイズ比を減少させる毎に2〜4フレームを平均化します。 1秒間隔を使用してください。 GFPおよびDIC（微分干渉コントラスト）チャネルの観点から強いPKD1-GFPを発現する細胞を接着させるための検索。付着した細胞は、形態学的に平坦であり、急速に移動しません。 高いGFP-PKD1を発現するHL60細胞の接着識別した後、長期的画像化（ 図3A）のための光退色を減少させるために、各チャンネルのための検出器利得を増加させながらレーザパワーを低下させることによって取得条件を最適化します。 200μlのピペッターでのfMLP /アレクサ594溶液100μlを取り、脇に置きます。 「タイムラプス取得」を選択し、に間隔を設定します2秒、フレーム数は100に取得します。 注：間隔と取得するフレームの数は、実験の目的に依存します。 1~2秒間隔と100のフレームは、多くの場合、 図3に示すように、画像化実験のために使用されている。ゆっくりと細胞を移行するために、より長い間隔が長期的画像化のために必要です。対照的に、迅速に細胞を移行するため、短い間隔は、細胞移動の連続的な詳細を観察するために必要とされます。 チャンバーの位置が変更されないように慎重に4ウェルチャンバーの蓋を取ります。すぐに取得を開始し、ガイドとしてのレーザ光のスポットを用いて、細胞上に直接200μlのピペッターを位置決めしながら非刺激細胞の3-5画像を取得します。 タイムラプス買収の完全なセットを流れて終了しても、迅速かつで撮像されているセル上のfMLP /アレクサ594混合物をピペット。さらに、データ分析に供されるデータに名前を付けて保存します。 </オール> 可視および制御可能な化学誘引物質刺激6.イメージングChemotaxing細胞 10μlのマイクロピペッターと注入のヒントを使用して、たてのfMLPとAlexa594の混合物を調製した30μlのマイクロピペットを埋め戻します。 顕微鏡ステージの上に取り付けられたマイクロピペットホルダーにマイクロピペットを取り付け、圧力供給装置、着実な勾配を生成するために、マイクロピペットからのfMLP / Alexa594ソリューションを解放するために一定の圧力を提供する装置にチューブを接続します。 圧力供給をオンにして、70ヘクトパスカルに補償圧力（PC）を設定します。 共焦点顕微鏡またはそれと同等の蛍光顕微鏡上の40X油レンズの上にPKD1-GFPを発現するHL60細胞を播種1ウェルのチャンバーカバースリップをマウントします。 次の設定でチャネルモードでの設定取得：GFPタグPKD1のための緑のチャンネル（500から530ナノメートル）。化学誘引物質fMLPで（Alexa594）のための赤チャネル（580から620ナノメートル）。そして、トランス付着したHL60細胞を同定するための光チャネルをmitted。 「ライブ」の取得を開始し、3つのチャンネルの取得条件を最適化：イメージングデータの定量分析のために、各チャネルの強度を調整します。すべての3つのチャネルについての強度とレーザパワーとの間の微調整は、最高品質の画像を取得し、光漂白剤を最小限にします。必要であれば、より良い画質ごと2~4フレーム平均します。我々は通常1秒間隔を使用します。 「ライブ」の取得を開始し、GFPと透過光チャネルの観点から強いPKD1-GFPを発現する細胞を接着させるために検索します。 fMLPの勾配を可視化するために、明視野光学系、センタービュー（ 図4A）の中心分野でマイクロピペットを使用し、PKD1-GFPを発現する接着HL60細胞。 タイムラプス取得を選択して、2秒間隔と100に取得するフレーム数に間隔を設定します。 注：各トンを収集した後IME-経過シリーズ、名、さらにデータ分析に供されるデータを保存します。