Görüntüleme G Nötrofil gibi HL60 Hücreleri Kemotaksis ve Sinyal Olaylar Reseptör aracılı Protein-çiftli

1. Kültür ve İnsan Farklılaşma Nötrofil gibi HL60 Hücreleri Hazırlama RPMI (Roswell Park Memorial Institute) RPMI 1640 ortamı,% 10 (h / h) cenin sığır serumu (FBS), 0.1 mM sodyum piruvat içeren 1640 kültür ortamı ve 25 mM HEPES (4- (2-hidroksietil) -1 -piperazineethanesulfonic asit). 37 ° C'ye kadar bir RPMI 1640 kültür ortamı ısıtın. Bir hemasitometre kullanarak hücrelerin log-faz büyüme aşamasında olduğundan emin olmak için HL60 hücrelerinin hücre yoğunluğu belirlemek. NOT: Hücreler Pasajlanması sonra üçüncü gününde log fazı genellikle. Log-faz hücrelerinin yoğunluğu genellikle 6-8 x 10 5 hücre / ml 'dir. Yeni bir kültürünü başlatmak için hücre yoğunluğu yaklaşık 1.5 x 10 5 hücre / ml 'dir. Not: Örneğin, T-75, düz bir şişe içinde 10 mi, yeni kültür, log-faz hücrelerinin daha sonra hücre yoğunluğu 6 x 10 5 hücre / mi, log-faz hücrelerinin (2.5 mL 6 X 10 5 ise, ) 10 m 1.5 x 10 5 hücre / ml olacak şekilde seyreltilirl yeni kültür. 10 ml kültüre nihai bir hacim ilave edilir RPMI 1640 kültür ortamı içinde 7.5 ml yapmak için. Düz bir şişeye ılık RPMI 1640 kültür ortamı hesaplanan hacim yerleştirin. T-75 düz bir şişe kültürü, hücre kültürü, toplam hacmi 10 ml'dir. 1.5 x 10 5 hücre / ml hücre yoğunluğuna ulaşmak için, düz bir şişeye log-faz artan HL60 hücrelerinin hesaplanan hacim. % 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de inkübe hücreleri. NOT: HL60 iki katına zaman neredeyse 24 saattir. RPMI 1640 kültür ortam maddesi ile Geçiş hücreler her 2-3 günde. HL60 hücrelerinin hücre yoğunluğu asla 1.5 x 10 6 hücre / ml aşıyor ve hücre geçit artık 2 aydan sürer önemlidir. Deneylerde önce HL60 hücreleri 5 gün ayırt eder. Not: RPMI 1640 farklılaştırma ortamı RPMI 1640 ortamı,% 10 (h / h) cenin sığır serumu (FBS), 0.1 mM sodyum piruvat, 25 mM lH içerirEPES ve% 1.3 dimetil sülfoksit (DMSO). Diğer bir deyişle, bu RPMI 1640 kültür ortamı içinde% 1.3 DMSO. HL60 hücreleri ayırt etmek için, 37 ° C bir RPMI 1640 kültür ortamı önceden ısıtın. Düz balona sıcak RPMI 1640 kültür ortamı ekleyin. DMSO hızlı bir RPMI 1640 kültür ortamı ile seyreltildi, böylece balon dönen ise bir son 10 ml HL60 farklılaşma kültürü için, düz bir şişede RPMI 1640 kültür ortamı, doğrudan 130 ul DMSO ilave edin. Bir son 10 ml RPMI 1640 farklılaşma ortamı içinde 1.5 x 10 5 hücre / ml'lik bir nihai hücre yoğunluğu log-faz HL60 hücreleri ekleyin. Kültür, 5 gün boyunca% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de RPMI 1640 ortamı içinde farklılaşma HL60 hücreleri. 2. 4well Odası Kapak Cam Yüzey Kaplama , Buzdolabından% 2 jelatin stok solüsyonu şişe almak% 70 etanol ile temizleyin ve kaputu yerleştirin. TAKE 1 ml% 2 jelatin stok solüsyonu ve hemen buzdolabına kalan jelatin stok solüsyonu döner. jelatin çözeltisi tam 37 ° C'de sıvılaştırılması ve iyice pipet izin verin. 9 mi önceden ısıtılmış 1x Hanks dengeli tuz çözeltisi ile% 2'lik bir jelatin stok solüsyonu seyreltik (HBSS)% 0.2 jelatin son konsantrasyonu tampon. sırasıyla altındaki bir kapak camı ile 4 oyuklu odasının iki orta kuyu veya 1 oyuklu bölmeye HBSS içinde 0.5 ml ya da 2 ml% 0.2 jelatin ekleyin. Sıvı tüm yüzey alanını kaplayacak şekilde çeşitli yönlere plakaları eğin. 37 ° C inkübatör tabak yerleştirin. Plakalar 1 saat içinde kullanıma hazır olur. Bunlar en fazla 5 gün için de kullanılabilir. Sadece hücrelerin ekim önce, 4-iyi ya da 1-kuyu odalarından jelatin çözüm kaldırmak. 3. Kemotaksis Deneyi kullanılarak hücre hareketliliği Analiz Cihazı RPMI olduğunu hazırlayın ve sıcak RPMI 1640 açlıktan ortamı,0.1 mM sodyum piruvat (isteğe bağlı) ve 25 mM HEPES içeren ortam. orta açlıktan RPMI 1640 içinde, 100 nM fMLP (N-formilmetionil-lösil-fenilalanin), 100 ul hazırlayın. % 1 sığır serum albümini 3 ml (BSA) Hazırlama / RPMI ortamı ve% 0.1 BSA / RPMI 1640 ortamı 10 ml açlıktan RPMI 1640 içinde% 1 BSA içeren 1640 ortamı. Ceket 22 mm'lik kare lamel ve taze hazırlanmış% 1 BSA ile bir 5 mikron hücre hareketliliği analiz cihazı çip / RPMI 1640 ortamı oda sıcaklığında 1 saat karıştırıldı. Aşağıdaki prosedürü kullanarak Holder birleştirin: kolları kullanıcı doğru eğin, böylece dikey pozisyonda kolları ile tutucu tabanını yerleştirin. 41 mm'lik cam yüzeyine% 70 etanol çözeltisi uygulanır. Dikkatle çizmemeye özen bir silme ile yüzeyleri silin. tutucu üssü haline 41 mm cam yerleştirin. tutucu tabanında 41 mm cam üstünde BSA ile kaplanmış 22 mm kare lamel koyun. NOT: Kaplanmış kare c41 mm cam ve yonga arasındaki overslip kemotaksis kaplama yüzeyinin alt tabaka oluşmasına izin verir. gofret konut dibine O-halkayı (küçük) yerleştirin ve arkada eliptik delik olan tutucu üssü haline gofret konut monte edin. konumunda gofret konut kilitlemek için yatay pozisyonda ileri tutucu tabanının iç düzeyini çekin. bir hava silgi ile gofret yuvanın iç tozları üfleyin. Gofret yuva içine% 0.1 BSA / RPMI 1640 ortamı içinde 4 ml. aşağı cam ile temas yapısal yüzü ile gofret mahfazanın ortasında BSA ile kaplanmış hücre hareketliliği analiz cihazı çip monte edin. NOT: çip arka konumlandırma işareti (çip üstünde delik) ile takılması gerekir bu. deliklere lastik conta iki çıkıntılar takarak gofret kelepçe altına lastik conta yapıştırın. üzerine O-halkasını (büyük) monte edingofret konut üst. arka sensör delik ile gofret kelepçesini takın. yerine gofret kelepçe kilitlemek için yatay pozisyonda ileri konut tabanının dış kolunu çekin. tutucu montajından sonra, kuyularda hiçbir hava kabarcığı olduğunu doğrulamak için ışık kutusu üzerinde sahibinin alt yerleştirin. Hava kabarcıkları tespit edilirse, bir örnek yükleme ucu ile donatılmış verilen plastik şırınga kullanarak bunları kaldırın. Kapağı çıkarın ve hücre hareketliliği analiz cihazı ünitenin üstünde plaka üzerine montajını koydu. sahibine sensör bloğunu takın. Kemotaksis Deneyi için HL60 hücrelerinin hazırlanması: hemositometre ile Farklılaşmış HL60 hücreleri hücre yoğunluğu hesaplanır. Farklılaşma 5 gün sonra hücre yoğunluğu yaklaşık 1.0 x 10 6 hücre / ml 'dir. 2 x 10 6 hücre / ml nihai hücre yoğunluğu HL60 hücreleri son hacim hesaplanır. Örneğin, hücre yoğunluğuFarklılaşmış HL60 hücreleri, 1.0 x 10 6 hücre / o mi, Farklılaşmış HL60 hücreleri 10 mi, 2 x 10 6 hücre / ml ulaşmak için 5 mi% 0.1 BSA / RPMI 1640 ortamı ile yeniden süspansiyon haline getirilmiş olacaktır. Santrifüj 200'de HL60 hücreleri ayırt Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca xg. % 0.1 BSA, hesaplanan hacmi ile hücrelerin Süpernatantı ve tekrar süspansiyon / 2 x 10 6 hücre / ml'lik bir nihai hücre yoğunluğu RPMI aşama 3.6.2 de 1640 ortamı). görüntü elde etmek için hücre hareketliliği analiz cihazı ünitesi ve PC başlatın. Üniteyi bilgisayara bağlayın. Hücre hareketlilik analizi aygıtı açın. Bilgisayarı açın. Hücre Hareketlilik Analizi Device Software Up başlayın. Kamera, ısıtıcı, çekim, not ve kamera görüntüleri: 5 kontrol panelleri gözlemleyin. Kamera görüntü kontrol panelinde, kamera görüntü panelinde kamera ortalamak için gerçek zamanlı olarak tutucu / görünüm konumunu ayarlamak için "Yatay çizgi" veya "Dikey çizgi" kullanın. Kamera kontrol panelinde, belirlenen kanala kamera taşımak için CH6 CH1 seçin. Bir kanalın görünüm alanlarını ortalamak için, kameranın X-koordinatı ve yatay kameranın konumunu ortalamak ayarlamak için "R Taşı", "Taşı L" tıklayın ya. Ayarlayın dikey ekran ortalamak için Görüntüyü ayarlamak için hücre hareketliliği analiz cihazı ünitenin ön panelindeki pozisyon düğmesini çevirerek kameranın Y koordinatı. Isıtıcı kontrol panelinde, 37.0 ° C "tutucu temp" ve 39 ° C "plaka sıcaklığı" olarak ayarlayın. Isıtma başlatmak için "Heat" tıklayın. Ayrıca tutucuya bağlı termal sensör kullanarak sıcaklığı kontrol etmek için "tutucu" tıklayın. Çekim panelinde, "Aralık" at "15 sn" ve aralıkları için "Time" de "30 dakika" ve kemotaksis testinde süresini girin. Kontrol güvenlik nedeniyle "çekim sonunda kapalı ısıtıcı". Bir DE belirtinsaklanan görüntüler için stination. Not panelinde, hücre hattı gibi deneylerin giriş özelliklerini, tedavi uygulandı olsun ya da olmasın, kullanılabilir ve kemo-cezbedici konsantrasyonu uygulanır. Deneylerde kullanılacak tüm kanallar merkezi konumda olması garantilenir ve gerekirse, tüm kanallar için ayarlamasını tekrarlayın. Enjekte edilir ve takip Hücreleri hizalayın: tutucudan tamponu çıkarın ve her bir kanal için üstten üçüncü gelen tampon 8 ul çıkar. Hücre sayısını kontrol etmek ve enjeksiyon esnasında akması için gerçek zamanlı olarak ekranda izleme sırasında aynı kanalda ikinci kuyuya hücre 2 ul enjekte etmek için bir şırınga kullanın. Hücreler güzel hizalanmış sonra, derhal tampon 8 ul geri ekleyin. Diğer kanallar (Şekil 1B) için de aynı işlemi tekrarlayın. geri sahibine tampon ml 2 ekleyin ve 1 ul 100 nM FM ekleyinüstten üçüncü oyuk LP. görüntü elde etme başlatın ve verileri kaydetmek. Görüntüyü yazılımını 9 izleme (Şekil 2) kullanılarak elde edilen verileri analiz edin. Elektroporasyon 4. Transfeksiyon Bölüm 2'de belirtildiği gibi Bölüm 1. Kat 4-iyi ya da 1-kuyu odaları açıklandığı gibi deneyden önce HL60 hücreleri 5 gün ayırt eder. Hazırlama ve 37 ° C'de RPMI 1640 ortamı,% 20 (h / h) FBS, 0.1 mM sodyum piruvat, 25 mM HEPES içeren, sıcak RPMI 1640 elektroporasyon geri ortamı. Sağ transfeksiyon deney başlamadan önce, sırasıyla, önceden kaplanmış 4-iyi ya da 1-kuyu odaları kuyulara 300 ul veya 3 ml RPMI 1640 kültür ortamı ya ekleyin. % 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde odaları inkübe edin. ileride kullanmak (iki hafta) inkübatöre hemen veya deposu bu odadan kullanın. farklılaşmış HL6 hücre yoğunluğu sayısıBir hemasitometre 0 hücreleri. Not: Hücre yoğunluğu genellikle yaklaşık 1.0 x 10 6 hücre / ml'ye ulaştığı. Hücre yoğunluğu daha 3.0 x 10 6 hücre daha / ml genellikle istenmeyen transfeksiyon verimi sağlar. HL60 hücrelerinin süspansiyon hücreleri olduğu için, herhangi bir re-süspansiyon gereklidir. 200 hücreleri santrifüj Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca xg. Süpernatantı ve transfeksiyon reaktifi, 100 ul 2 x 10 6 HL60 hücreleri tekrar süspansiyon. Hücreleri ve transfeksiyon reaktifler 100 ul karışımı içine GFP-PKD1 plazmid 9 4 ug ekleyin ve hafifçe ve iyice karıştırın. sağlanan küvetin içine karışımı ekleyin. insan lökosit hücre hattı için üreticinin önceden ayarlanmış programı seçin ve elektroporasyon gerçekleştirin. NOT: Daha fazla bilgi üreticisinin web sitesinden edinilebilir. Elektroporasyondan sonra, hemen ve yavaşça ilave hücrelere 500 ul RPMI 6140 elektroporasyon kurtarma ortamı önceden ısıtılmış veyavaşça verilen plastik pipetler ile 1.6 ml tüp küvet hücreleri aktarın. % 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde, 30 dakika boyunca inkübe hücreleri. Tohum 100 ul veya sırasıyla bir 4-kuyu kuyu veya 1-kuyu odasına, içine hücreleri 500 ul. sırasıyla 1 ml veya bir 4-kuyusunun aynı oyuğuna 4 ml'lik bir son hacim ya da 1-çukurlu odasına RPMI 1640 kültür ortamı. 3 saat,% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde hücreleri inkübe edin. Pre-sıcak RPMI 1640 açlıktan ortamı 37 ° C. 1 ml pipet kullanarak, yavaşça sırasıyla 4 oyuklu bölmenin oyuk ya da 1-çukurlu haznesinden RPMI 1640 kültür ortamı, 0.8 ml veya 3 ml çıkarın. Nazik olun ve yapışan HL60 hücreleri uzakta emme kaçının. NOT: HL60 hücrelerin büyümesine ve süspansiyon medyada ayrılır. bazı tedaviler ile birlikte veya farklılaştırılmış sonra, HL60 hücrelerinin polilisin, kolajen, jelatin ya da fi ile kaplanmış alt tabaka bağlıbronectin. sırasıyla 4-iyi ya da 1-de bölmenin kuyuya orta açlıktan 0.8 ml ya da RPMI 1640 3 ml ekleyin. 1 saat bekleyin. NOT: Bu noktada hücreler görüntüleme deneyleri 9 için hazırdır. 5. İzleme GPCR aracılı Çok kanallı Floresan Mikroskobu PKD1 Membran Translokasyon uyaran olarak orta aç RPMI 1640 içinde 100 nM fMLP ve 1 ug / ml Alexa 594 taze bir karışım hazırlayın. NOT: fMLP ve Alexa 594 ihtiyaçlar karışımı taze maksimum etkinlik sağlamak için yapılacaktır. Dağı bir 4-iyi odasının 40X petrol lensin üzerinden hücreleri ile ekildi. Şöyledir olarak Çok Kanallı Yapılandırması Floresan Mikroskop ayarlayın: yapışan HL60 hücrelerinin tanımlanması için kemoatraktan fMLP için GFP etiketli PKD1, kırmızı emisyon kanalı (580-620 nm) (Alexa 594) yeşil emisyon kanalı (500-530 nm) ve iletilen ışık kanalı ayarlayın. Başlat "canlı" satın alma veÜç kanal toplama koşullarını optimize: Her üç kanal için yoğunluğu ve lazer gücü arasındaki ince ayar görüntüleme uzun bir süre için ışıkla ağartma en aza indirmek için. Gerekirse, görüntülerin daha iyi kalite için arka plan gürültü oranını azaltmak için her 2 ila 4 kare ortalama. 1 sn aralığı kullanın. GFP ve DIC (diferansiyel girişim kontrast) kanalın görünümünde güçlü PKD1-GFP ifade hücreleri yapıştırmak için arayın. Yapışan hücreler morfolojik düz ve hızlı hareket etmezler. Uzun vadeli görüntüleme (Şekil 3A) için ışıkla ağartma azaltmak için her bir kanal için dedektör kazancını artırırken yüksek ekspres GFP-PKD1, lazer gücünü düşürerek elde etme koşulunu optimize yapışan HL60 hücreleri belirlendikten sonra. 200 ul pipetter ile fMLP / Alexa 594 çözüm 100 ul alın ve bir kenara koyun. "Time-lapse edinimi" seçin ve aralıkları ayarlamak2 sn ve kare sayısı 100'e elde etmek. NOT: aralıkları ve elde etmek için kare sayısı deneylerin amacı bağlıdır. 1-2 saniye aralıklarla 100 kare genellikle Şekil 3'de olduğu gibi, görüntüleme deneyleri için kullanılır. Yavaşça hücrelere taşımak için, uzun aralıklar uzun süreli görüntüleme için gereklidir. Bunun aksine, hücreleri hızla geçiş için, daha kısa aralıklarla hücre göçü sürekli ayrıntıları gözlemlemek için gereklidir. Odanın konumu değişmez, böylece dikkatlice 4-iyi bir odasının kapağını çıkarmak. edinimi hemen başlayın ve bir rehber olarak lazer ışığının yerinde kullanarak hücreleri üzerinde doğrudan 200 ul pipetter konumlandırırken uyarılmamış hücrelerde 3-5 görüntüler elde. hücreleri üzerinde fMLP / Alexa 594 karışımı akış ve time-lapse edinimi komple set bitirmek bile hızlı ile görüntülenmiş ve varlık pipetle. Ad ve daha fazla veri analizine tabi olacak verileri kaydetmek. </ol> Görünür ve Kontrol Edilebilir Kemo-cezbedici Uyaranların 6. Görüntüleme chemotaxing Hücreleri 10 ul Mikropipet ve enjeksiyon ipuçlarını kullanarak, taze fMLP ve Alexa594 karışımı hazırlanmış 30 ul bir mikropipet dolgu. , Istikrarlı bir degrade oluşturmak için mikropipet fMLP / Alexa594 çözümü serbest bırakmak için bir sabit basınç sağlayan bir cihaz, bir mikroskop sahne üstüne monte edilmiş bir mikropipet sahibine mikropipet takın ve basınç besleme ünitesine boru bağlayın. Basınç kaynağı açın ve 70 hPa tazminat basıncı (Pc) ayarlayın. konfokal mikroskop ya da ona eşdeğer floresan mikroskop 40X petrol lensin üzerinden PKD1-GFP ifade HL60 hücreleri ile seribaşı 1-iyi odacıklı lamel monte edin. Aşağıdaki konfigürasyonda kanal modunda ayarlanabilir edinimi: GFP etiketli PKD1 için yeşil kanal (500-530 nm); kemoatraktan fMLP (Alexa594) kırmızı kanalı (580-620 nm); ve transyapışan HL60 hücrelerin belirlenmesi için hafif kanal sunulmamış. "Canlı" satın alma başlatın ve üç kanal için satın alma koşulları optimize: görüntüleme verileri kantitatif analiz için her kanalın yoğunluklarını ayarlamak; Her üç kanal için yoğunluğu ve lazer gücü arasındaki ince ayar en kaliteli görüntü elde etmek ve fotoğraf çamaşır suyu en aza indirmek için. Gerekirse, daha iyi görüntü kalitesi için her 2 ila 4 kare ortalama. Biz genellikle bir 1 sn aralığı kullanınız. "Canlı" satın alma başlatın ve GFP görünümü ve iletilen ışık kanallarda güçlü PKD1-GFP ifade hücreleri yapıştırmak için arayın. FMLP degrade görselleştirmek için aydınlık alan optik, merkezi görünümünde (Şekil 4A) merkez alanında mikropipet kullanılarak ve PKD1-GFP ifade yapışan HL60 hücreleri. time-lapse edinimi seçmek ve 100 elde etmek 2 sn aralıklarla ve kare sayısı aralıklarını ayarlayın. NOT: Her t topladıktan sonraime-lapse serisi, isim ve daha fazla veri analizine tabi olacak verileri kaydetmek.