ensayos de quimiotaxis visuales son esenciales para una mejor comprensión de cómo las células eucariotas controlar la migración de células direccional quimioatrayente mediada. A continuación, se describen los métodos detallados para: 1) en tiempo real, monitoreo de alta resolución de múltiples ensayos de quimiotaxis, y 2) visualizar simultáneamente el gradiente quimioatrayente y la dinámica espacio-temporal de los acontecimientos en las células HL60 neutrófilos como señalización.
Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.
Las células eucariotas detectan y se mueven hacia la concentración más alta dentro de un gradiente quimioatrayente, un proceso celular que se refiere como la quimiotaxis. Quimiotaxis juega un papel crítico en muchos procesos fisiológicos, tales como la embriogénesis 1, neurona patrón 2, la metástasis de las células cancerosas 3, el reclutamiento de neutrófilos a sitios de inflamación 4, y el desarrollo del modelo de organismo Dictyostelium discoideum 5. En general, las células eucariotas detectan quimioatrayentes utilizando receptores 5 acoplados a la proteína G. El compromiso de los cebos químicos con estos receptores promueve la disociación de las proteínas G heterotrimeric Gα y Gβγ, que a su vez activan las vías de transducción de señales que regulan en última instancia, la organización espacio-temporal del citoesqueleto de actina para impulsar la migración celular 5-9.
Los biólogos celulares han estado desarrollando y mejorando chemotaxes ensayos para examinar cómo G receptor acoplado a proteína (GPCR) de señalización que medie dirigen la migración celular. La cámara o la migración transwell ensayo Boyden fue desarrollado en 1960 por Boyden 10. El ensayo funciona creando un gradiente de compuestos quimioatrayentes entre dos pozos que están separados por una membrana microporosa. Su simplicidad y facilidad de uso lo convierten en el ensayo de quimiotaxis más utilizado hasta la fecha. Sin embargo, el ensayo no permite que el proceso de migración de las células a ser visualizada. La cámara Zigmond es el primer dispositivo de microfluidos visual que permite una clara imagen de la migración celular en un cubreobjetos a través de una constricción estrecha hacia un quimioatrayente fuente 11. Dunn 12 y 13 Insall modificar y mejorar la alta resolución y la capacidad de imagen a largo plazo del ensayo de quimiotaxis de cámara Zigmond. Debido a las características altamente predecibles, difusión dominante del flujo de fluidos, microfluídica ha sido el suministro de soluciones para la próxima Generatien ensayos de quimiotaxis, como EZ-TAXIScan (un dispositivo de análisis de la movilidad celular).
Con la estabilidad del gradiente asegurado, el dispositivo permite seis quimiotaxis ensayos que se lleven a cabo simultáneamente (Figura 1A). En contraste con los gradientes direccionalmente fijos generados en los diversos ensayos de cámara por encima de, el ensayo de aguja o micropipeta desarrollado por Guenther Gerisch genera un gradiente con una fuente móvil 14. En el ensayo, quimioatrayente se libera de una micropipeta móvil para generar un gradiente estable. Con este ensayo de aguja, los investigadores encontraron que las células generan diferentes seudópodos con características fundamentalmente diferentes. La aplicación de la microscopía de fluorescencia, hemos sido capaces de visualizar el gradiente para facilitar su medición cuantitativa largo de 15. En este estudio, se describen los métodos detallados para la preparación de células HL60 quimiotáctico (leucemia promielocítica humana), monitoreo de forma simultánea múltiples ASSA quimiotaxisys con el dispositivo de análisis de la movilidad celular, y la visualización de la dinámica espacio-temporales de GPCR mediada de moléculas de señalización, tales como la proteína quinasa D1 en células vivas individuales en respuesta a los estímulos quimiotácticos visibles, espaciotemporalmente controlable. Nuestros métodos avanzados de imágenes pueden ser aplicados a los estudios generales de quimiotaxis, y son especialmente adecuados para sistemas de células de mamíferos.
En el presente estudio, se muestran dos ejemplos de ensayos de quimiotaxis: primero, el control simultáneo de múltiples ensayos de quimiotaxis por el dispositivo de análisis de la movilidad celular; y en segundo lugar, la visualización del gradiente quimioatrayente y la dinámica espacio-temporal de los acontecimientos en las mismas células en tiempo real de señalización.
dispositivo de análisis de la movilidad de la célula para múltiples ensayos de quimiotaxis simultáneas
En el presente estudio, hemos introducido un protocolo detallado para realizar múltiples ensayos de quimiotaxis simultánea utilizando un dispositivo de análisis de la movilidad celular. Este dispositivo permite al usuario observar el comportamiento de la quimiotaxis celular con una lente objetivo de 10X en la observación de campo claro convencional. Debido a las características de difusión-dominante del flujo de fluido, el dispositivo de análisis de la movilidad celular genera, gradientes estables altamente predecibles y permite que hasta seis ensayos de quimiotaxis para ser llevado a cabo de forma simultánea. Los pasos críticos del protocolo sonpara obtener gradientes fiables y alinear las células en la línea de terraza. El usuario debe seguir estrictamente las instrucciones del fabricante para el conjunto del portador y la inyección de quimioatrayentes y células. Las instrucciones detalladas están disponibles en línea. Comparado con los métodos de quimiotaxis alternativas 11-13,15, este dispositivo mejora significativamente la fiabilidad y la eficiencia de ensayos de quimiotaxis. Cuatro tamaños de chip de dispositivo de análisis de la movilidad de células en tamaños de 4, 5, 6, y 8 micras están disponibles para adaptarse a diferentes tipos y tamaños de células. Se encontró que un chip de la movilidad celular dispositivo de análisis de 4 o 5 micras es adecuado para el HL60 y D. discoideum células, que son alrededor de 10-15 micras de diámetro. Sin embargo, una limitación es que este dispositivo no es adecuado para todos los tipos de células. Hemos tenido poco éxito utilizando el ensayo de quimiotaxis dispositivo de análisis de la movilidad celular con células Raw267.4. La razón puede ser que las células Raw267.4 migran demasiado lentamente. El tiempo requerido para che eficientemotaxis de células Raw267.4 podría ser mucho más largo que el tiempo de un gradiente se mantiene por el dispositivo. En cambio, un ensayo de migración transwell funcionó bien para las células Raw267.4 9. Otra limitación es que la observación fluorescente no es posible con el dispositivo actual. Una dirección futura es monitorear imágenes fluorescentes con mayor aumento. Esto es posible con el dispositivo de análisis de la movilidad celular mejorada, que está equipado con detección fluorescente y una lente objetivo 100X. Además, el número de ensayos simultáneos también se incrementa a 12. Todas estas mejoras facilitan el rendimiento mejorado de ensayos de quimiotaxis y de la observación de la dinámica de subcelulares en la migración de células.
Alta eficiencia de transfección de las células HL60 para expresar la proteína proteína marcada con fluorescente
Las células HL60 son una línea celular de leucemia se dividen activamente y crecen en suspensión. Como se informó anteriormente 18-20, células HL60 son resistentes a la gtransferencia eno. Tanto los lípidos y la transferencia de genes electroporación se han probado, y se obtuvo una mayor eficiencia de la transfección con la electroporación, tal como se describe en detalle en la sección 4. La obtención de una alta viabilidad después de la electroporación es fundamental para obtener una alta eficiencia de transfección debido a los graves daños que resulta de la electroporación. Posteriormente, se requiere un manejo cuidadoso y gentil celular, sobre todo después de la electroporación. Todos los medios de comunicación tienen que ser pre-calentado y añadió suavemente a las células en alguna medida después de la electroporación. También es fundamental para reducir al mínimo el tiempo de exposición de las células al reactivo de electroporación. Para evitar la muerte celular, después de la electroporación, RPMI 1640 medio de recuperación de la electroporación se debe añadir a las células inmediatamente. Se encontró que el 20% de FBS en el medio de recuperación da una tasa de recuperación de células mucho más alto que 10% de FBS. Después de la electroporación, la incubación en medio RPMI 1640 de recuperación de electroporación para 30 min es crítica para una mayor viabilidad y transfeccióneficiencia. Para aumentar aún más la eficiencia de la transfección, que también se utiliza 4 ADN plasmídico g por transfección, que es casi dos veces la cantidad de plásmido recomendado por el fabricante.
Hay dos grandes limitaciones en la transfección electroporación: la transitoriedad de la expresión de la proteína y el límite de número de células (2 x 10 6 células por transfección). En las células no diferenciadas, la expresión es detectable sólo durante el primer par de divisiones celulares, ya que el plásmido vector se diluye a la mitad después de cada división celular. Por El HL60 diferenciadas células sobreviven no más de 48 horas. Como resultado, cualquier experimento requiere transfecciones frescas 6 hr antes del experimento. El número de células para una electroporación simplemente cumple el requisito mínimo para cualquier ensayos bioquímicos. A los efectos del uso repetitivo o gran cantidad, se recomienda encarecidamente que se estableció una línea de células HL60 no diferenciada que forma estable expresa la proteína de interés WHIch ha sido etiquetado con una proteína fluorescente por un vector viral, si un vector viral está disponible o se puede construir.
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the intramural fund of NIAID, NIH.
RPMI 1640 Medium GlutaMAX | Life technologies | 61870-036 | |
Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scietific | 11360-070 | |
Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
1M HEPES sterile solution, pH7.3 | Quality Biological Inc. | A611-J848-06 | |
Penicillin streptomycin solution | Fisher Scientific | 15140122 | |
NucleofectorTM 2b | Lonza | AAB-1001 | |
AmaxaTM Cell Line NucleofectorTM Kit V including NucleofectorTM Solution, Singe use pipettes, AmaxaTM certified 100 ml aluminum electrode cuvettes | Lonza | VCA-1003 | |
Lab-Tek chambered #1.0 Borosilicate Coverglass | Nalge Nunc International Inc | 155383 | |
2 % Gelatin solution | Sigma-Aldrich | G1393 | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
HBSS (Hanks’ Balanced Salt Solution) | Life technologies | 14025-076 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3803 | |
Single well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International Inc | 155361 | |
Four-well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International Inc | 155383 | |
Alexa 594 | Thermo Fisher Scientific | A-10438 | |
fMLP | Sigma -Aldrich | F3506-5MG | |
Cover glass thickness 2 22 x 22 mm | Corning | 2855-22 | |
EZ-TAXIScan | Effector Cell Institute, Inc. | MIC-1001 | |
EZ-TAXIScan chip (5 mm) | Effector Cell Institute, Inc. | EZT-F01-5 | |
1701RN 10ul syringe | Hamilton | 80030 | |
Femtotips II Injection tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | |
TransferMan NK2, including motor module, X head with angle adjuster, and Positioning aids. | Eppendorf | 5188900056 | |
DIAS software | Solltech Inc. | ||
LSM 780 META or equivalent confocal microscope with a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens | Carl Zeiss |