JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

G הדמית חלבון בשילוב קולטן בתיווך Chemotaxis ואירועי האיתות שלה בתאי HL60 נויטרופילים דמויים

Published: September 14, 2016
doi:
10.3791/54511
, ,
1Chemotaxis Signal Section, Laboratory of Immunogenetics,National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health

Summary

מבחני chemotaxis חזותיים חיוניים להבנה טובה יותר של איך איקריוטיים תאים לשלוט נדידת תאים כיוונית בתיווך chemoattractant. כאן אנו מתארים שיטות מפורטות: 1) בזמן אמת, ניטור ברזולוציה גבוהה של מבחני chemotaxis מרובים, ו -2) בו זמנית לדמיין את שיפוע chemoattractant ואת דינמיקת spatiotemporal של איתות אירועים בתאי HL60 דמוי נויטרופילים.

Abstract

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Introduction

תאים איקריוטיים לחוש ולנוע לעבר הריכוז הגבוה בתוך שיפוע chemoattractant, בתהליכים תאיים כמו המכונים chemotaxis. Chemotaxis משחק תפקידים קריטיים בתהליכים פיזיולוגיים רבים, כגון העובר 1, נוירון דפוסים 2, גרורות של תאים סרטניים 3, גיוס של נויטרופילים לאתרים של דלקת 4, ואת הפיתוח של אורגניזם מודל Dictyostelium discoideum 5. באופן כללי, תאים איקריוטיים לחוש chemoattractants באמצעות קולטנים G- חלבון בשילוב 5. ההתקשרות של chemoattractants עם קולטנים אלה מקדמת דיסוציאציה של חלבוני G heterotrimeric Gα ו Gβγ, אשר בתורו להפעיל מסלולי העברת אותות במורד זרם כי בסופו של דבר לווסת את ארגון spatiotemporal של שלד התא יקטין לנהוג להגירה של תאי 5-9.

ביולוגי Cell כבר בפיתוח ושיפור chemotaxמבחנים הוא לבחון כיצד קולטן המצומד לחלבון G (GPCR) איתות מתווכת מכוונים נדידת תאים. את assay ההגירה הקאמרית או transwell בוידן פותחה בשנת 1960 על ידי בוידן 10. את assay פועלת על ידי יצירת שיפוע של תרכובות chemoattractant בין שתי בארות, כי הם מופרדים על ידי קרום microporous. פשטות וקלות השימוש בו הופכות אותו assay chemotaxis הנפוצה ביותר עד כה. עם זאת, assay אינו מאפשר התהליך הנודד של התאים להיות מדמיינת. תא זיגמונד הוא המכשיר microfluidic החזותי הראשון המאפשר הדמיה ברורה של נדידת תאים על coverslip פני התכווצות צרה לעבר מקור chemoattractant 11. 12 דאן Insall 13 שונה ושפרו את ברזולוציה הגבוהה ויכולת הדמיה לטווח ארוכה של assay chemotaxis הקאמרית Zigmond. בשל המאפיינים צפויים, דיפוזיה דומיננטית מאוד של זרימת נוזל, מיקרופלואידיקה כבר במתן פתרונות-generati הבאעל מבחני chemotaxis כגון EZ-TAXIScan (התקן ניתוח ניידות התא).

עם היציבות של השיפוע המובטח, המכשיר מאפשר שישה מבחני chemotaxis להתבצע בו זמנית (איור 1 א). בניגוד הדרגתיים הקבועים directionally שנוצרו המבחנים הקאמריים לעיל, assay המחט או micropipette שפותח על ידי גינתר Gerisch יוצר שיפוע עם מקור מטלטלי 14. ב assay, chemoattractant הוא שוחרר מבית micropipette מטלטלין כדי ליצור שיפוע יציב. עם assay מחט זה, חוקרים מצאו כי תאים שונים ליצור pseudopods עם מאפיינים שונים באופן מהותי. החלה מיקרוסקופ פלואורסצנטי, הצלחנו לחזות את השיפוע כדי להקל מדידת כמותית שלה ברחבי 15. במחקר זה, אנו מתארים שיטות מפורטות להכנת HL60 chemotactic (לוקמיה פרומיילוציטית אדם) תאים, ניטור אסא chemotaxis המרובה בו זמניתys עם המכשיר ניתוח ניידות התא, באופן חזותי את הדינמיקה spatiotemporal בתיווך GPCR של מולקולות איתות כגון חלבון קינאז D1 בתאים חיים יחיד בתגובה גלוי, גירויים chemoattractant לשליטה spatiotemporally. שיטות ההדמיה המתקדמות שלנו יכולות להיות מיושמות על מחקרי chemotaxis כלליים, ומתאים במיוחד עבור מערכות תא יונקות.

Protocol

1. תרבות בידול של האדם נויטרופילים דמויי תאים HL60 הכן RPMI (מכון ממוריאל פארק Roswell) בינוני תרבות 1640 המכיל בינוני RPMI 1640, 10% (V / V) בסרום שור עוברית (FBS), פירובט 0.1 מ"מ נתרן, ו 25 מ"מ HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1 חומצת -piperazineethanesulfonic). מומלץ לחמם את מדיום תרבות RPMI 1640 עד 37 מעלות צלזיוס. באמצעות hemocytometer לקבוע את צפיפות התאים של תאי HL60 לוודא התאים נמצאים בשלב הצמיחה פאזיים יומן. הערה: תאים הם בדרך כלל בשלב יומן ביום השלישי לאחר passaging. צפיפות התאים יומן פאזיים הוא בדרך כלל 6-8 x 10 5 תאים / מ"ל. צפיפות התאים הדרושים כדי להפעיל תרבות חדשה הוא כ -1.5 x 10 5 תאים / מ"ל. הערה: לדוגמה, עבור תרבות חדשה 10 מ"ל בבקבוק T-75 שטוח, אם צפיפות התאים של תאי יומן פאזיים הוא 6 x 10 5 תאים / מ"ל, אז 2.5 מ"ל של תאים יומן פאזיים (6 x 10 5 ) הוא מדולל ל 1.5 x 10 5 תאים / מ"ל ב 10 מ 'l תרבות חדשה. כדי להפוך נפח סופי של תרבות 10 מ"ל, 7.5 מ"ל של מדיום תרבות RPMI 1640 מתווסף. מניח את הנפח המחושב של מדיום תרבות החם RPMI 1640 לתוך בקבוק שטוח. עבור תרבות בבקבוק שטוחה T-75, את הנפח הכולל של תרבות התא הוא 10 מיליליטר. מוסיף את הנפח המחושב של תאי יומן פאזיים גדלו HL60 לתוך הבקבוק השטוח להגיע צפיפות תאים של 1.5 x 10 5 תאים / מיליליטר. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס חממה humidified עם 5% CO 2. הערה: זמן ההכפלה של HL60 הוא כמעט 24 שעות. מעבר התאים עם מדיום תרבות RPMI 1640 כל 2-3 ימים. חשוב כי צפיפות התאים של תאי HL60 לא עולה על 1.5 x 10 מ"ל 6 תאים / ואת המעבר תא נמשך לא יותר מ 2 חודשים. להבדיל בין תאי HL60 5 ימים לפני הניסויים. הערה: RPMI 1640 בינוני בידול מכיל RPMI 1640 בינוני, 10% (V / V) בסרום שור עוברית (FBS), פירובט נתרן 0.1 מ"מ, 25 מ"מ HEPES, ו sulfoxide דימתיל 1.3% (DMSO). במילים אחרות, זה DMSO 1.3% בטווח הבינוני תרבות RPMI 1640. כדי לבדל את תאי HL60, מראש לחמם את מדיום תרבות RPMI 1640 עד 37 מעלות צלזיוס. הוסף בינוני התרבות החם RPMI 1640 לתוך בקבוק שטוח. עבור תרבות בידול HL60 10 מ"ל הסופי, להוסיף 130 ul DMSO ישירות עד בינוני התרבות RPMI 1640 בבקבוק שטוח בעוד מתערבל את הבקבוק כך DMSO הוא מדולל במהירות על ידי המדיום תרבות RPMI 1640. הוספת תאים HL60 פאזיים להיכנס לצפיפות התא הסופי של 1.5 x 10 5 תאים / מ"ל במדיום בידול הסופי 10 מ"ל RPMI 1640. התרבות התאים HL60 במדיום בידול RPMI 1640 על 37 מעלות צלזיוס חממה humidified עם 5% CO 2 למשך 5 ימים. 2. ציפוי פני שטח כיסוי הזכוכית של לשכת 4well קח את בקבוק פתרון המניות ג'לטין 2% מהמקרר, לנקות אותו עם 70% אתנול, ולמקם אותו למכסה המנוע. Tאקה 1 מ"ל 2% פתרון ג'לטין המניות ולהחזיר את מניות פתרון ג'לטין הנותרים למקרר מיד. אפשר פתרון ג'לטין להנזלת לחלוטין ב 37 מעלות צלזיוס ו פיפטה אותו ביסודיות. לדלל את הפתרון ג'לטין המניה 2% עם 9 מ"ל מחומם מראש תמיסת מלח מאוזנת "1x הנקס (HBSS) חיץ לריכוז סופי של ג'לטין 0.2%. הוסף 0.5 מ"ל או 2 מ"ל 0.2% ג'לטין ב HBSS לשתי בארות באמצע תא 4-היטב או תא 1-היטב עם מכסה זכוכית בתחתית, בהתאמה. הטה את הצלחות בכמה כיוונים כך שהנוזל מכסה את כל פני השטח. מניחים את הצלחות באינקובטור 37 מעלות צלזיוס. הלוחות יהיו מוכנים לשימוש 1 hr. הם יכולים לשמש עבור עד 5 ימים. רגע לפני תאי הזריעה, להסיר את פתרון ג'לטין מן 4-היטב או 1-גם תאי. 3. Assay Chemotaxis נייד באמצעות התקן ניתוח ניידות הכן ולחמם RPMI 1640 רעב בינוני, שהוא RPMIמדיום המכיל פירובט נתרן 0.1 מ"מ (אופציונלי) ו -25 מ"מ HEPES. הכן 100 μl של 100 ננומטר fMLP (N-formylmethionyl-leucyl-פנילאלנין) ב RPMI 1640 רעב בינוני. הכן 3 מ"ל של אלבומין 1% שור (BSA) / 1640 RPMI בינוני המכיל 1% BSA ב RPMI 1640 רעב בינוני ו -10 מ"ל של 0.1% BSA / 1640 RPMI בינוני. מעיל 22 מ"מ coverslip מרובע שבב התקן ניתוח ניידות תא 5 מיקרומטר עם מוכן טרי 1% BSA / 1640 RPMI בינוני במשך שעה 1 ב RT. להרכיב המחזיק באמצעות ההליך הבא: מקם את הבסיס בעל עם המנופים במצב האנכי כך המנופים יכולים להטות כלפי המשתמש. החל פתרון אתנול 70% על פני השטח של זכוכית 41 מ"מ. נגב בזהירות את המשטחים עם לנגב, נזהר שלא לשרוט אותם. הכנס את זכוכית 41 מ"מ לתוך הבסיס המחזיק. שים את coverslip מרובע BSA מצופה 22 מ"מ על גבי זכוכית 41 מ"מ בבסיס המחזיק. הערה: ג מרובע מצופהoverslip בין זכוכית 41 מ"מ ו השבב מאפשר chemotaxis להתרחש על התשתית של ציפוי פני השטח. הכנס את טבעת O (קטן) לתוך החלק התחתון של דיור רקיק, ו הר הדיור רקיק לתוך הבסיס בעל עם חור אליפטי בחלק האחורי. משוך ברמה הפנימית של בסיס בעל קדימה למצב אופקי כדי לנעול את הדיור רקיק בעמדה. לפוצץ את כל האבק הפנים של דיור רקיק עם מטלית אוויר. הוסף 4 מ"ל של 0.1% BSA / 1640 RPMI בינוני לתוך דיור רקיק. הר שבב התקן ניתוח ניידות תא BSA מצופה במרכז הדיור רקיק עם הפנים כלפי מטה מבניים במגע עם זכוכית. הערה: זה השבב צריך להיות מוכנס עם סימן המיצוב (החור בחלק העליון של השבב) בחלק האחורי. הצמד את אטם גומי לתחתית מהדק רקיק על ידי התאמת שני הגידולים על אטם גומי לתוך החורים. הר-טבעת O (גדול) עלהחלק העליון של דיור רקיק. תלה את וו רקיק עם החור חיישן בחלק האחורי. משוך את הידית החיצונית של בסיס הדיור קדימה למצב האופקי כדי לנעול את מהדק רקיק במקום. לאחר הרכבת בעל, להציב בתחתית המחזיק על תיבת האור כדי לאשר שאין בועות אוויר בתוך הבארות. אם בועות אוויר מזוהים, להסיר אותם באמצעות מזרק פלסטיק הניתנים מצויד טיפ טעינת המדגם. הסר את המכסה ולשים את המכלול לצלחת על גבי יחידת התקן ניתוח ניידות תא. צרף בלוק החיישן לבעל. כן תאי HL60 עבור Assay Chemotaxis: חשב את צפיפות התאים של תאי HL60 בדיל עם hemocytometer. לאחר 5 ימים של בידול, צפיפות התאים הוא סביב 1.0 x 10 6 תאים / מ"ל. חשבתי את הנפח הסופי של HL60 תאים בצפיפות תא סופי של 2 x 10 6 תאים / מיליליטר. לדוגמה, אם צפיפות התאים שלתאים HL60 הבדיל הוא 1.0 x 10 מ"ל 6 תאים /, ולאחר מכן 10 מ"ל של תאים HL60 הבדיל יהיה resuspended עם 5 מ"ל של 0.1% BSA / בינוני RPMI 1640 להגיע ל -2 x 10 6 תאים / מ"ל. צנטריפוגה בדיל HL60 תאים ב 200 XG במשך 5 דקות ב RT. הסר את supernatant ו resuspend תאים עם הנפח המחושב של 0.1% BSA / 1640 RPMI בינוני בשלב 3.6.2) צפיפות תא סופית של 2 x 10 6 תאים / מיליליטר. התחל את יחידת התקן ניתוח ניידות תא PC לרכישת תמונה. חבר את היחידה למחשב. הפעל את התקן ניתוח ניידות תא. הפעל את המחשב. להפעיל את תוכנת התקן הניתוח הניידת ניידות. שים 5 לוחות בקרה: מצלמה, דוד, ירי, תזכורות, ותמונות מצלמה. בלוח הבקרה תמונת המצלמה, השתמש "קו אופקי" או "קו אנכי" כדי להתאים את המיקום בעל / הנוף בזמן אמת כדי למרכז את המצלמה בחלונית תמונת המצלמה. בלוח הבקרה המצלמה, בחר CH1 כדי CH6 להזיז את המצלמה לערוץ מוגדר. כדי למרכז את שדות נוף של ערוץ, לחץ על "L העברה" או "העבר R" כדי להתאים את X לתאם של המצלמה ומרכז את מצב המצלמה אופקית. התאם את Y לתאם של המצלמה על ידי סיבוב מיקום הידית בלוח הקדמי של מכשיר מכשיר ניתוח ניידות תא אנכי לכוון את התמונה למרכז את המסך. בלוח הבקרה דוד, להגדיר את "זמני בעל" 37.0 ° C ואת "temp צלחת" ל -39 מעלות צלזיוס. לחץ "מחממים" כדי להתחיל חימום. גם ללחוץ על "בעל" לשלוט על הטמפרטורה באמצעות החיישן התרמי מחובר למחזיק. בלוח הירי, הזן "15 שניות" בבית "מרווח" ו "30 דקות" ב- "Time" עבור במרווחים ואת משך assay chemotaxis. בדוק "מחמם את בסוף הירי" מטעמי בטיחות. לייעד דהstination עבור תמונות המאוחסנות. בלוח התזכיר, קלט את הפרטים של הניסויים, כגון שורת תאים המשמשים, אם לא יושם טיפול, ואת הריכוז של-משיכת הכימותרפיה מיושם. אשר את המיקום במרכז כל הערוצים אשר ישמשו בניסויים, וחזור על התאמה עבור כל הערוצים במידת הצורך. להזריק וליישר תאים כדלקמן: הסר את חוצץ מבעל, ולהוציא 8 μl של חיץ מן השלישי גם מלמעלה לכל ערוץ. השתמש מזרק להזריק 2 μl של תאים לתוך הבאר השנייה באותו הערוץ תוך מעקב המסך בזמן אמת כדי לשלוט מספר תא לזרום במהלך הזרקה. אחרי התאים מיושרים יפה, מיד להוסיף את 8 μl של חיץ בחזרה. חזור על אותו התהליך עבור הערוצים האחרים (איור 1B). הוסף 2 מ"ל חיץ בחזרה לבעל, ולהוסיף 1 μl 100 ננומטר FMLP אל הבאר השלישית מלמעלה. התחל רכישת תמונה ולשמור את הנתונים. לנתח את הנתונים המתקבלים באמצעות תמונה התחקות תוכנה 9 (איור 2). 4. Transfection עם Electroporation להבדיל תאים HL60 5 ימים לפני הניסוי כמתואר בסעיף 1. תאי מעיל 4-היטב או 1-גם בהתאם להוראות סעיף 2. הכן ובינוניים התאוששות electroporation חם RPMI 1640, המכיל RPMI 1640 בינוני, 20% (v / v) FBS, פירובט נתרן 0.1 מ"מ, 25 מ"מ HEPES, עד 37 מעלות צלזיוס. ממש לפני תחילת הניסוי transfection, להוסיף או 300 μl או 3 מ"ל בינוני תרבות RPMI 1640 לתוך הבארות של תאי 4-היטב או 1-היטב מראש מצופה, בהתאמה. דגירה לתאי C חממה humidified 37 מעלות עם 5% CO 2. משתמשים בתאים אלה באופן מיידי או בחנות בחממה לשימוש עתידי (שבועות). לספור את צפיפות התאים של HL6 הבדיל0 תאים עם hemocytometer. הערה: צפיפות התאים לעתים קרובות מגיע לכ 1.0 x 10 6 תאים / מ"ל. צפיפות התאים העולה על 3.0 x 10 6 תאים / מ"ל בדרך כלל נותן יעילות transfection רצויה. ככל שתאי HL60 הם תאי השעיה לא resuspension נדרש. צנטריפוגה התאים ב 200 XG במשך 5 דקות ב RT. הסר את supernatant ו resuspend 2 x 10 6 HL60 תאים 100 μl של מגיב transfection. הוסף 4 מיקרוגרם של פלסמיד GFP-PKD1 9 לתוך התערובת 100 μl של תאים ריאגנטים transfection ומערבבים בעדינות וביסודיות. מוסיפים את התערובת לתוך קובט מסופק. בחר את התוכנית שנקבעה מראש של היצרן עבור הקו הסלולרי לויקוציטים אנושיים ולבצע את electroporation. הערה: מידע נוסף זמין מאתר האינטרנט של היצרן. לאחר electroporation, מיד בעדינות להוסיף מראש חימם 500 בינוני התאוששות electroporation μl RPMI 6140 אל התאים,בעדינות להעביר את התאים מן קובט לצינור 1.6ml עם טפטפות פלסטיק הניתנים. דגירה התאים למשך 30 דקות ב C חממה humidified 37 מעלות עם 5% CO 2. זרע 100 μl או 500 μl של תאים לתוך אחד טוב של באר 4-או תא 1-היטב, בהתאמה. הוסף בינוני תרבות RPMI 1640 עד נפח סופי של 1 מ"ל או 4 מ"ל לאותו היטב של 4-היטב או תא 1-היטב, בהתאמה. דגירת תאי C חממת humidified 37 מעלות עם 5% CO 2 למשך 3 שעות. טרום חם RPMI 1640 רעב בינוני עד 37 ° C. בעזרת פיפטה 1ml, בעדינות להסיר 0.8 מ"ל או 3 מ"ל של מדיום תרבות RPMI 1640 מהבאר של תא 4-היטב או תא 1-היטב, בהתאמה. בעדינות ולהימנע מוצצים משם תאי HL60 דבקים. הערה: תאי HL60 לגדול הם מובחנים במדיה השעיה. לאחר בדיל או עם טיפולים מסוימים, תאי HL60 לדבוק התשתית מצופית polylysine, קולגן, ג'לטין, או fibronectin. להוסיף 0.8 מ"ל או 3 מ"ל של RPMI 1640 רעב בינוני לתוך הבאר של תא 4-היטב או 1-היטב, בהתאמה. חכו 1 שעה. הערה: בשלב זה התאים מוכנים לניסויי הדמיה 9. 5. ניטור בתיווך GPCR טרנסלוקציה ממברנה של PKD1 ידי רב ערוצית מיקרוסקופ פלואורסצנטי הכינו תערובת טרייה של 100 ננומטר fMLP ו 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​Alexa 594 ב 1640 RPMI רעב בינוני כמו גירויים. הערה: תערובת של fMLP אלקסה 594 צריך להתבצע טרי על מנת להבטיח יעילות מקסימלית. הר קאמרי אחד 4-גם זורע עם תאים על פני עדשת שמן 40X. הגדר את מיקרוסקופ פלואורסצנטי בתצורת Multichannel כדלקמן: הגדר את ערוץ פליטה הירוק (500-530 ננומטר) עבור PKD1-tagged GFP, ערוץ פליטת אדום (580-620 ננומטר) עבור chemoattractant fMLP (Alexa 594), וערוץ אור המועבר לזיהוי תאי HL60 דבק. התחל רכישה "חייה" ולייעל את התנאים לרכישת שלושת הערוצים: בצע כוונון עדין בין עוצמת כוח הליזר עבור כל שלושת הערוצים למזער photobleach לתקופה ארוכה יותר של הדמיה. במידת צורך, בממוצע כל 2 עד 4 מסגרות כדי להקטין את יחס רעש רקע איכות תמונות טובה יותר. השתמש מרווח שניות 1. חיפוש עבור דבקות תאי המבטאים PKD1-GFP החזק בתצוגה של ערוץ ה- GFP ו DIC (התערבות הפרש לעומת זאת). תאים דבקים הם שטוח מורפולוגית ואל תזוזו במהירות. לאחר זיהוי תאים HL60 דבקות המבטאים מאוד GFP-PKD1, לייעל את תנאי הרכישה על ידי הפחתת כוח לייזר תוך הגדלת רווח גלאי לכל ערוץ כדי להקטין את photobleach עבור (איור 3 א) הדמיה לטווח ארוך. קח את 100 μl של פתרון fMLP / Alexa 594 עם pipetter 200 μl ומניחים בצד. בחר את "רכישת זמן לשגות" ולהגדיר את המרווחים כדישניות 2 ומספר מסגרות לרכוש 100. הערה: המרווחים ומספר מסגרות לרכוש תלויים לצורך ניסויים. 1-2 במרווחים שניות ו -100 מסגרות לעתים קרובות משמשים לניסויים הדמיה, כמו באיור 3. עבור תאים נודדים לאט, מרווחי זמן נחוצים הדמיה לטווח ארוך. לעומת זאת, עבור תאים נודדים במהירות, במרווחים זמן קצרים יותר נדרשים להתבוננות בפרטים הרציפים של נדידת התאים. בזהירות מסירים את המכסה של תא 4-גם כך שמיקום של החדר לא השתנה. התחל הרכישה מיד ולרכוש 3-5 תמונות של תאים unstimulated תוך מיצוב pipetter 200 μl ישירות על התאים באמצעות נקודה של אור לייזר כמדריך. פיפטה את התערובת fMLP / Alexa 594 מעל התאים להיות צילמו עם מהירה ואפילו לזרום ולסיים את סט שלם של רכישת זמן לשגות. שם ולשמור את הנתונים שיהיו כפופים ניתוח נתונים נוסף. </ol> 6. תאי chemotaxing הדמית גירויים גלויים לשליטת חמו-attractant באמצעות טיפים 10 micropipetter הזרקת μl, למילוי micropipette עם 30 μl מוכן טרי תערובת של fMLP ו Alexa594. צרף את micropipette לבעל micropipette רכוב על גבי הבמה מיקרוסקופ ולחבר את צינורות אל יחידת ספק בלחץ, מנגנון המספק לחץ מתמיד לשחרר פתרון fMLP / Alexa594 מן micropipette כדי ליצור שיפוע יציב. הפעל את אספקת הלחץ ולהגדיר את הלחץ פיצוי (PC) עד 70 hPa. הר coverslip 1-גם מחולק לתאים זרע עם תאי HL60 להביע PKD1-GFP על עדשת שמן 40X על מיקרוסקופ confocal או מיקרוסקופ פלואורסצנטי המקביל שלה. רכישה נקבעה במצב ערוץ בתצורה הבאה: מסלול ירוק (500-530 ננומטר) עבור PKD1 מתויג GFP; במסלול האדום (580-620 ננומטר) עבור chemoattractant fMLP (Alexa594); טרנסmitted ערוץ אור לזיהוי תאי HL60 דבק. התחל רכישה "חייה" ו לייעל את התנאים לרכישה עבור השלושה הערוצים: להתאים את העוצמות של כל ערוץ על ניתוח כמותי של נתוני הדמיה; לכוונן בין עוצמת כוח הליזר עבור כל שלושת הערוצים להשיג תמונות באיכות הטובה ביותר ולמזער את אקונומיקת התמונה. במידת הצורך, בממוצע כל 2 עד 4 מסגרות עבור איכות תמונה טובה יותר. אנחנו בדרך כלל להשתמש מרווח שניות 1. התחל רכישה "חייה" ולחפש דבקות תאי מבטאים-GFP PKD1 החזק בתצוגה של GFP וערוצי אור מועבר. באמצעות אופטיקה שדה בהיר, רכז את micropipette בתחום למרכז התצוגה (איור 4 א) כדי להמחיש את שיפוע fMLP ותאי HL60 הדבקים להביע PKD1-GFP. בחר רכישת זמן לשגות ולהגדיר את המרווחים כדי 2 מרווחי שניות ומספר מסגרות לרכוש 100. הערה: לאחר איסוף כל tסדרת IME לשגות, שם ולשמור את הנתונים שיהיו כפופים ניתוח נתונים נוסף.

Representative Results

הדמיה סימולטני של chemotaxis של תאי HL60 מרובים באמצעות מכשיר ניתוח ניידות תא בהתבסס על העיקרון של מיקרופלואידיקה 16, היצרנית ספקה פרופילים מדומים של מילויים: שיפוע נוצר בתוך דקות 1, התייצבה תוך 5 דקות, ומתוחזק על 2 hr. הפרופילים והצפויים למדי של הדרגתיים היציבים שנוצרו על ידי מיקרופלואידיקה לאפשר מבחני chemotaxis המרובה להתבצע בו זמנית. במחקר הנוכחי, צפינו בשלושה מבחני chemotaxis סימולטני (איור 2 א ו סרט 1). מצאנו כי HL60 תאים נכתבו chemotaxing מייד לאחר chemoattractant שהוזרק לתוך הבאר של chemoattractant, והמשכתי chemotaxing בנתיב ישר עבור 60 הדקות הבאות, עולות בקנה אחד עם תוצאות הסימולציה ליציבות שיפוע. איתור את הנתיב ואת מורפולוגיה נסיעותשל התאים מאפשרת מדידות כמותיות והשוואה הבאות של התנהגויות chemotaxis באמצעות מדד chemotaxis הכוללת אורך הדרך כולל, מהירות, כיווניות, עגלגלות של תאים (תרשים 2B). אורך מסלול הכולל הוא סכום האורכים של מקטעי הקו המחבר בין centroids של השביל. מהירות מתקבלת על ידי חלוקת אורך הדרך כולל על ידי הזמן. כיווניות נמדדו כלפי מעלה, והוא מוגדר כ: (Y של לסוף הנתיב מינוס Y של התחילה) חלקיות אורך דרך כלל. זה נותן 1.0 עבור אובייקט נע ישירות כלפי מעלה. את העגלגלות של התא היא מדד (באחוזים) של מידת יעילות כמות נתונה של מערכת סוגרת באזור. מעגל יש את השטח הגדול ביותר עבור כל מערכת נתונה יש פרמטר עגלגלות של 100%. קו ישר סוגר שום תחום ויש לו פרמטר עגלגלות של 0%. אנו מציגים את התנהגות chemotaxis נמדד כמותית כפי שתואר על ידי הפרמטרים chemotaxis שנבחרו(איור 2 ג). ניטור לוקליזציה subcellular PKD בתאים HL60 תחת גירוי fMLP גלוי לשליטה spatiotemporally זהו מראש טכניים גדולים ליישם שכותרתו fluorescently וגירוי chemoattractant לשליטה על מערכת ניסיונית. מבחינה היסטורית, יש לנו בקשה אחת הומוגנית (המכונה גם אחיד) גירוי או גירוי שיפוע לצפות תגובת התא והתנהגויות. עם זאת, "עיוור" גירוי לא רק מספק שום מידע spatiotemporal כיצד הגירוי מגיע התאים, אלא גם מטיל ספק על כל תצפיות "נורמליות" של תגובת תא לגירוי, פשוט כי אנחנו לא רואים את הגירוי. הראינו בעבר כי צבע פלואורסצנטי (Alexa594) יכול להיות מיושם עם chemoattractant ליצור מערכת יחסים ליניארי בין ריכוז chemoattractant ו- mצבע פלואורסצנטי onitored עוצמת 15. עם תצורת רכישת החלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), פליטת אדום של צבע פלואורסצנטי (Alexa594), ואת האור מועבר, אנו מסוגלים לפקח על התאים הדבקים, היישום של הגירוי, ואת תגובת התא לגירוי (איור 3A). D קינאז חלבון היא משפחה של קינאזות סרין / תראונין כי לשחק תפקידים חיוניים נדידת תאים מכוונת 9,17. בתגובה אחידה שימושי fMLP (אדום) גירוי, תאי HL60 לתווך טרנסלוקציה קרום חזקה של ה- GFP-tagged חלבון קינאז D1 (ירוק) (2 האיור 3B ו Movie). בשנת שיפוע fMLP (אדום) (איור 4 א), תאי HL60 פעילים לגייס PKD1 אל הקצה המוביל (איור 4 ב ו סרט 3). השוואה מדוקדקת של לוקליזציה subcellular של GFP ב בליטה של ​​הקצה הקדמי עולה כי PKD1 localizes בחלק האחורי של הקצה הקדמי (4C איור). איור 1. התקן ניתוח ניידות נייד מאפשר עד 6 מבחני chemotaxis סימולטני. (א) Scheme מציגה את העיצוב של שבב התקן ניתוח ניידות תא עבור ניטור סימולטני של 6 מבחני chemotaxis עצמאיים. מופעים אדומים chemoattractant מתווספים הבארות. (ב) מבוא של HL60 תאים כדי הבארות של תאים בעוד chemoattractant מפזרת כדי ליצור שיפוע fMLP יציב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. איור 2. ניטור סימולטני של מבחני chemotaxis מרובים עם תאים HL60. (א </stro ng>) Montage מראה תמונות של assay chemotaxis התקן ניתוח ניידות תא לבחון את השפעתו המעכבת של מעכבי PKD ספציפי על chemotaxis בזמנים של 0 ו -12 דקות לאחר יישום הדרגתי. תאי Chemotactic HL60 היו טרום שטופלו CID755673 מעכב PKD 1 מיקרומטר למשך 30 דקות. תאי HL60 עם או בלי טיפול מעכב PKD הורשו chemotax בשני בינוני רעב RPMI1640 או 100 הדרגתי ננומטר fMLP במשך 12 דקות. (ב) תכנית מציגה את אורך מסלול הנסיעה ומורפולוגיה של תאי HL60 לייחס. (C) כימות chemotaxis כמו אורך הדרך כולל, מהירות, כיווניות, עגלגלות. ממוצע ± סטיית תקן מוצג; n = 10, 12, או 11 ללא שיפוע, שיפוע fMLP ללא טיפול CID755673, וטיפול fMLP עם טיפול CID755673, בהתאמה. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <p class="jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> איור 3. בתיווך GPCR טרנסלוקציה קרום חזקים של PKD1 בתגובה לגירויים fMLP אחיד. (א) ניטור רב-ערוצי של PKD1-GFP (ירוק), chemoattractant (1 מיקרומטר fMLP מעורבב עם 0.1 מיקרוגרם / מ"ל צבע פלואורסצנטי אלקסה 594, אדום) , ודסק"ש (התערבות הפרש לעומת זאת) כדי לזהות את תאי HL60 הדבקים בבאר תא 4well צופה ג'לטין 0.2% בטווח בינוני RPMI 1640. בר סולם = 10 מיקרומטר. (ב) Montage מראה כי באופן אחיד השימושי fMLP (אדום) גורמת טרנסלוקציה קרום החזק של PKD1-GFP (ירוק). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. Figurלוקליזציה קצה מובילים דואר 4. PKD1 ב chemotaxing תאים HL60. (א) מצב ערוצים רכישת תצורה מקל על ויזואליזציה של שיפוע fMLP ואת הדינמיקה spatiotemporal של PKD1. In A – C, תאי HL60 הביעו זמנים PKD1 GFP-tagged; כדי להמחיש את שיפוע fMLP המופק micropipette (DIC), 100 ננומטר fMLP (אדום) עורבב עם 0.1 מיקרוגרם / מ"ל צבע פלואורסצנטי אלקסה 594. (ב) מועשר לוקליזציה של PKD1 בחוד החנית של התא chemotaxing. בר סולם = 10 מיקרומטר. (ג) תמונות ממוזגות מראות כי PKD1 localizes בחלק האחורי של הקצה הקדמי בתאי HL60. הירוק מצביע על לוקליזציה הסלולר PKD1, ותמונת דסק"ש מציגה את האזור הבולט של הקצה הקדמי. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

במחקר הנוכחי, אנו מציגים שתי דוגמאות של מבחני chemotaxis: ראשון, ניטור סימולטני של מבחני chemotaxis מרובים על ידי מכשיר ניתוח ניידות תא; ושנית, ויזואליזציה של שיפוע chemoattractant ואת הדינמיקה spatiotemporal של איתות אירועים באותו תאים בזמן אמת.

התקן ניתוח ניידות נייד עבור מבחני chemotaxis בו זמנית מספר רב

במחקר הנוכחי, הצגנו פרוטוקול מפורט לביצוע מבחני chemotaxis בו זמנית מספר רב באמצעות מכשיר ניתוח ניידות התא. מכשיר זה מאפשר למשתמש לצפות התנהגות chemotaxis סלולרית עם עדשה 10X אובייקטיבית תצפית שדה הבהיר קונבנציונלית. בשל המאפיינים דומיננטי דיפוזיה של זרימת הנוזל, המכשיר ניתוח ניידות התא מייצר מאוד הדרגתי צפוי, יציב ומאפשר עד שישה מבחני chemotaxis להתבצע בו זמנית. השלבים הקריטיים של הפרוטוקול הםלהשיג הדרגתיים אמינים כדי ליישר את התאים על קו המרפסת. המשתמש צריך לעקוב בקפדנות אחר הוראות היצרן להרכבה בעל הזרקת של chemoattractants ותאים. הוראות מפורטות הם גם זמין באינטרנט. בהשוואה לשיטות chemotaxis אלטרנטיבה 11-13,15, המכשיר הזה משפר באופן משמעותי את האמינות והיעילות של מבחני chemotaxis. ארבעה גדלים של שבב התקן ניתוח ניידות תא בגדלים של 4, 5, 6, ו -8 מיקרומטר זמינים כדי להתאים סוגים וגדלים שונים של תאים. מצאנו כי שבב התקן ניתוח ניידות תא 4 או 5 מיקרומטר מתאים HL60 וד תאי discoideum, שהם כ 10-15 מיקרומטר קוטר. עם זאת, מגבלה אחת היא כי התקן זה אינו מתאים לכל סוגי תאים. היו לנו מעט הצלחה באמצעות assay chemotaxis התקן ניתוח ניידות תא עם תאים Raw267.4. הסיבה לכך עשויה להיות כי תאי Raw267.4 להעביר לאט מדי. כמה זמן נדרש עבור che ביותרmotaxis של תאי Raw267.4 עלול להיות הרבה יותר מזמן שיפוע מתוחזק על ידי המכשיר. במקום זאת, assay הגירה transwell עבד היטב תאים Raw267.4 9. מגבלה נוספת היא כי תצפית פלורסנט אינה אפשרית עם המכשיר הנוכחי. בכיוון העתיד הוא לפקח הדמיה ניאון עם הגדלה גבוהה. זה אפשרי עם מכשיר ניתוח ניידות תא המשופר, אשר מצויד עם זיהוי פלורסנט עדשה אובייקטיבית 100X. בנוסף, מספר מבחני סימולטני גם הוא עלה ל 12. כל השיפורים הללו להקל על התפוקה המשופרת של מבחני chemotaxis ואת התצפית של דינמיקת subcellular ב תאים נודדים.

יעילות transfection גבוהה של HL60 תאים לבטא חלבונים-tagged ניאון

תאי HL60 מהווים שורת תאים לוקמיה שעדיין מתחלקת ולגדול השעיה. כפי שדווח בעבר 18-20, תאי HL60 עמידים gהעברת פנטן. שניהם שומני העברת גני electroporation נבדקו, ויעילות transfection גבוהה הושגה עם electroporation, כמתואר בפירוט בסעיף 4. קבלת כדאיויות גבוהות לאחר electroporation הוא קריטי להשגת יעילות transfection גבוהה בגלל הפגיעה הקשה נובעת electroporation. בהמשך לכך, טיפול בתא יסודי ועדין נדרשים, במיוחד לאחר electroporation. כל כלי התקשורת צריכה להיות מחומם מראש והוספתי בעדינות אל התאים בכל שלבים לאחר electroporation. זה גם קריטי כדי למזער את זמן החשיפה של תאים מגיב electroporation. כדי למנוע מוות של תאים, לאחר electroporation, בינוני התאוששות electroporation RPMI 1640 יש להוסיף את התאים מיד. מצאנו כי FBS 20% בטווח הבינוני ההתאוששות נותן שיעור התאוששות תא הרבה יותר גבוה מ -10% FBS. לאחר electroporation, דגירה במדיום התאוששות electroporation RPMI 1640 למשך 30 דקות היא קריטית עבור כדאיות יותר transfectionיְעִילוּת. כדי להגביר עוד יותר את יעילות transfection, אנו גם בשימוש 4 פלסמיד דנ"א מיקרוגרם לכל transfection, המהווה כמעט את הסכום פעמיים של פלסמיד המומלץ על ידי היצרן.

ישנם שתי מגבלות עיקריות על transfection electroporation: את הארעיות של ביטוי החלבון ואת מגבלת המספר הסלולרי (2 x 10 6 תאים לכל transfection). בשנת תאים שלא עברו התמיינות, ביטוי ניתן לזהות רק במהלך הזוג הראשון של חלוקות תא, מאז פלסמיד הווקטור הוא מדולל בחצי אחרי כל חלוקת תא. For The HL60 הבדיל תאים לשרוד לא יותר מ -48 שעות. כתוצאה מכך, כל ניסוי מחייב transfections הטרי 6 שעות לפני הניסוי. מספר תאים עבור electroporation אחד רק עונה על הדרישה המינימלית עבור כל מבחני ביוכימיים. לצורך שימוש חוזר על עצמו או כמות גדולה, מומלץ מאוד כי שורת תאים שלא עברו התמיינות HL60 שתוקם ביציבות מבטא את החלבון של WHI ענייןch תויג עם חלבון פלואורסצנטי ידי וקטור ויראלי, אם וקטור ויראלי זמין או ניתן לבנות.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work is supported by the intramural fund of NIAID, NIH.

Materials

RPMI 1640 Medium GlutaMAX Life technologies 61870-036
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scietific 11360-070
Fetal bovine serum Gemini Bio-Products 100-106
1M HEPES sterile solution, pH7.3 Quality Biological Inc. A611-J848-06
Penicillin streptomycin solution Fisher Scientific 15140122
NucleofectorTM 2b Lonza AAB-1001
AmaxaTM Cell Line NucleofectorTM Kit V including NucleofectorTM Solution, Singe use pipettes, AmaxaTM certified 100 ml aluminum electrode cuvettes Lonza VCA-1003
Lab-Tek chambered #1.0 Borosilicate Coverglass Nalge Nunc International Inc 155383
2 % Gelatin solution Sigma-Aldrich G1393
Fibronectin Sigma-Aldrich F1141
HBSS (Hanks’ Balanced Salt Solution) Life technologies 14025-076
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A3803
Single well Lab-Tek II coverglass chambers Nalge Nunc International Inc 155361
Four-well Lab-Tek II coverglass chambers Nalge Nunc International Inc 155383
Alexa 594 Thermo Fisher Scientific A-10438
fMLP Sigma -Aldrich F3506-5MG
Cover glass thickness 2 22 x 22 mm Corning 2855-22
EZ-TAXIScan Effector Cell Institute, Inc. MIC-1001
EZ-TAXIScan chip (5 mm) Effector Cell Institute, Inc. EZT-F01-5
1701RN 10ul syringe Hamilton 80030
Femtotips II Injection tips Eppendorf 5242956003
Femtotips II Eppendorf 930000043
TransferMan NK2, including motor module, X head with angle adjuster, and Positioning aids.  Eppendorf 5188900056
DIAS software Solltech Inc.
LSM 780 META or equivalent confocal microscope with a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens Carl Zeiss
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pocha, S. M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations. Annual review of genetics. 48, 295-318 (2014).
  2. Wen, Z., Zheng, J. Q. Directional guidance of nerve growth cones. Current opinion in neurobiology. 16, 52-58 (2006).
  3. Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. Directed cell invasion and migration during metastasis. Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).
  4. Zigmond, S. H. Chemotaxis by polymorphonuclear leukocytes. The Journal of cell biology. 77, 269-287 (1978).
  5. Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-8 (2008).
  6. Dong, X., et al. P-Rex1 is a primary Rac2 guanine nucleotide exchange factor in mouse neutrophils. Current biology : CB. 15, 1874-1879 (2005).
  7. Li, Z., et al. Directional sensing requires G beta gamma-mediated PAK1 and PIX alpha-dependent activation of Cdc42. Cell. 114, 215-227 (2003).
  8. Van Haastert, P. J., Devreotes, P. N. Chemotaxis: signalling the way forward. Nature reviews: Molecular cell biology. 5, 626-634 (2004).
  9. Xu, X., et al. GPCR-Mediated PLCbetagamma/PKCbeta/PKD Signaling Pathway Regulates the Cofilin Phosphatase Slingshot 2 in Neutrophil Chemotaxis. Mol Biol Cell. , (2015).
  10. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of experimental medicine. 115, 453-466 (1962).
  11. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. The Journal of cell biology. 75, 606-616 (1977).
  12. Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. Journal of cell science. 99 (Pt4), 769-775 (1991).
  13. Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PloS one. 5, e15309 (2010).
  14. Bozzaro, S., Fisher, P. R., Loomis, W., Satir, P., Segall, J. E. Guenther Gerisch and Dictyostelium, the microbial model for ameboid motility and multicellular morphogenesis. Trends in cell biology. 14, 585-588 (2004).
  15. Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein coupled receptor (GPCR)-mediated signaling events that control chemotaxis of Dictyostelium discoideum. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  16. Lin, F., et al. Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices. Lab Chip. 4, 164-167 (2004).
  17. Eiseler, T., et al. Protein kinase D1 regulates cofilin-mediated F-actin reorganization and cell motility through slingshot. Nature cell biology. 11, 545-556 (2009).
  18. Roddie, P. H., Paterson, T., Turner, M. L. Gene transfer to primary acute myeloid leukaemia blasts and myeloid leukaemia cell lines. Cytokines Cell Mol Ther. 6, 127-134 (2000).
  19. Schakowski, F., et al. Novel non-viral method for transfection of primary leukemia cells and cell lines. Genet Vaccines Ther. 2, 1 (2004).
  20. Uchida, E., Mizuguchi, H., Ishii-Watabe, A., Hayakawa, T. Comparison of the efficiency and safety of non-viral vector-mediated gene transfer into a wide range of human cells. Biol Pharm Bull. 25, 891-897 (2002).

Tags

G Protein-coupled ReceptorChemotaxisSignaling EventsNeutrophil-like HL60 CellsMicrofluidicsCell Mobility Analysis DeviceRPMI 1640 MediumBSACell BiologistsSimultaneous MonitoringReal-time Visualization

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wen, X., Jin, T., Xu, X. Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells. J. Vis. Exp. (115), e54511, doi:10.3791/54511 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image