Imaging G-eiwit-gekoppelde receptor-gemedieerde Chemotaxis en de signalering evenementen in neutrofielen-achtige HL60 Cells

1. Cultuur en differentiatie van humane neutrofielen-achtige HL60 Cells Bereid RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640 kweekmedium RPMI 1640 medium, 10% (v / v) foetaal runderserum (FBS), 0,1 mM natriumpyruvaat bevat en 25 mM HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1 -piperazineethanesulfonic zuur). Verwarm het RPMI 1640 kweekmedium 37 ° C. Met behulp van een hemocytometer bepalen van de celdichtheid van HL60 cellen om ervoor te zorgen dat de cellen in de log-fase groeifase. LET OP: Cellen zijn meestal in log-fase op de derde dag na de passage. De dichtheid van log-fase cellen gewoonlijk 6-8 x 10 5 cellen / ml. De celdichtheid moet een nieuw cultuur beginnen ongeveer 1,5 x 10 5 cellen / ml. OPMERKING: Bijvoorbeeld, een 10 ml nieuwe cultuur in een T-75 vlakke kolf, wanneer de celdichtheid van log-fase cellen 6 x 10 5 cellen / ml, vervolgens 2,5 ml log-fase cellen (6 x 10 5 ) wordt verdund tot 1,5 x 10 5 cellen / ml in 10 ml nieuwe cultuur. Tot een eindvolume van 10 ml kweek, 7,5 ml RPMI 1640 kweekmedium toegevoegd maken. Plaats het berekende volume van warme RPMI 1640 kweekmedium in een vlakke kolf. Een T-75 kolf platte cultuur, het totale volume van de celkweek is 10 ml. Voeg de berekende hoeveelheid log-fase kweken HL60 cellen in horizontale kolf tot een celdichtheid van 1,5 x 10 5 cellen / ml bereiken. Incubeer de cellen bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2. LET OP: De verdubbeling van de tijd van HL60 is bijna 24 uur. Passage van de cellen met RPMI 1640 kweekmedium om de 2-3 dagen. Het is belangrijk dat de celdichtheid van de HL60 cellen niet boven 1,5 x 10 6 cellen / ml en de cellen passage duurt niet langer dan 2 maanden. Onderscheid de HL60 cellen 5 dagen voor de experimenten. OPMERKING: RPMI 1640 differentiatiemedium bevat RPMI 1640 medium, 10% (v / v) foetaal runderserum (FBS), 0,1 mM natriumpyruvaat, 25 mM HEPES en 1,3% dimethylsulfoxide (DMSO). Met andere woorden, is 1,3% DMSO in RPMI 1640 kweekmedium. HL60 cellen te differentiëren, pre-warm de RPMI 1640 kweekmedium tot 37 ° C. Voeg de warme RPMI 1640 kweekmedium in een vlakke kolf. Voor een laatste 10 ml HL60 differentiatie cultuur, rechtstreeks toe te voegen 130 ul DMSO aan de RPMI 1640 kweekmedium in het vlakke kolf, terwijl wervelende de kolf, zodat de DMSO snel wordt verdund door de RPMI 1640 kweekmedium. Add log-fase HL60 cellen tot een uiteindelijke celdichtheid van 1,5 x 10 5 cellen / ml in een uiteindelijk 10 ml RPMI 1640 differentiatiemedium. Cultuur van de HL60-cellen in RPMI 1640 medium differentiatie bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5% CO2 gedurende 5 dagen. 2. Coating de Cover glazen oppervlak van de 4well Kamer Neem de fles van 2% gelatine voorraad oplossing uit de koelkast schoon met 70% ethanol, en plaats het in de kap. Take 1 ml 2% gelatine voorraad-oplossing en de terugkeer van de resterende voorraad gelatine oplossing voor de koelkast onmiddellijk. Laat de gelatineoplossing volledig vloeibaar bij 37 ° C en pipetteren grondig. Verdun de 2% gelatine voorraadoplossing met 9 ml voorverwarmd 1x Hanks 'gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) buffer tot een eindconcentratie van 0,2% gelatine. Voeg 0,5 ml of 2 ml 0,2% gelatine in HBSS om de twee middelste putjes van een 4-well kamer of een kamer 1 putjes met een dekglas op de bodem, resp. Kantelen van de platen in verschillende richtingen, zodat de vloeistof bedekt het gehele oppervlak. Plaats de platen in een 37 ° C incubator. De platen klaar voor gebruik in 1 uur zijn. Ze kunnen worden gebruikt voor maximaal 5 dagen. Net voor het zaaien cellen, verwijder de gelatine oplossing uit de 4-en of 1-well kamers. 3. Chemotaxis Assay gebruiken Cell Mobility Analysis Device Bereid en verwarm RPMI 1640 honger medium, dat RPMImedium dat 0,1 mM natriumpyruvaat (optioneel) en 25 mM HEPES. Bereid 100 pi van 100 nM fMLP (N-formylmethionyl-leucyl-fenylalanine) in RPMI 1640 medium uitgehongerd. Bereid 3 ml 1% runderserumalbumine (BSA) / RPMI 1640 medium dat 1% BSA in RPMI 1640 medium uitgehongerd en 10 ml 0,1% BSA / RPMI 1640 medium bevat. Coat een 22 mm vierkante dekglaasje en een 5 urn mobiliteit celanalysesysteem chiphulpmiddel met vers bereide 1% BSA / RPMI 1640 medium gedurende 1 uur bij KT. Monteer de houder met de volgende procedure: Plaats de houder basis met de hendels in de verticale stand zodat de hefbomen kan kantelen naar de gebruiker. Toepassen 70% ethanoloplossing voor het glasoppervlak 41 mm. Veeg voorzichtig de oppervlakken met een veeg, zorg niet te krabben. Plaats de 41 mm glas in de houder basis. Zet de BSA-beklede 22 mm vierkante dekglaasje bovenop de 41 mm glas in de houderbasis. LET OP: De beklede vierkante coverslip tussen de 41 mm glas en de chip maakt chemotaxis voorgekomen op het substraat van de coating oppervlak. Plaats de O-ring (small) in de onderkant van de waferhouder, en zet de waferhouder in de houder basis met de elliptische opening aan de achterzijde. Trek de inwendige hoogte van de houderbasis uit naar de horizontale positie naar de waferhouder in positie te vergrendelen. Blaas stof uit het inwendige van de wafer behuizing met een lucht stofdoek. Voeg 4 ml 0,1% BSA / RPMI 1640 medium in de waferhouder. Monteer de BSA-beklede celbeweging analyseapparaat chip in het midden van de waferhouder de structurele zijn verticaal in contact met het glas. OPMERKING: Dat de chip moet de positionering merkteken (het gat in de bovenkant van de chip) aan de achterzijde in te voegen. Bevestig de rubber op de bodem van de wafel klem door het aanbrengen van de twee uitsteeksels op de rubber afdichting in de gaten. Monteer de O-ring (groot) opde top van de waferhouder. Monteer de wafer klem met de sensor gat aan de achterzijde. Trek de buitenste hendel van de behuizing basis uit naar de horizontale positie van de wafer klem vast te zetten. Na montage van de houder, plaats de bodem van de houder op de lichtbak te bevestigen dat er geen luchtbellen in de putjes. Als er luchtbellen worden gedetecteerd, verwijder ze met behulp van de bijgeleverde plastic injectiespuit voorzien van een monster laden tip. Verwijder het deksel en zet het geheel op de plaat op de top van de mobiliteit cel analyse apparaat unit. Bevestig de sensor blok aan de houder. Bereid HL60 Cellen voor Chemotaxis Assay: Bereken de celdichtheid van de gedifferentieerde HL60 cellen met een hemocytometer. Na 5 dagen van differentiatie, de celdichtheid ongeveer 1,0 x 10 6 cellen / ml. Bereken het eindvolume van HL60 cellen bij een uiteindelijke celdichtheid van 2 x 10 6 cellen / ml. Bijvoorbeeld, wanneer de celdichtheid van degedifferentieerde HL60-cellen is 1,0 x 10 6 cellen / ml, dan 10 ml gedifferentieerde HL60 cellen worden geresuspendeerd met 5 ml 0,1% BSA / RPMI 1640 medium met 2 x 10 6 cellen / ml bereiken. Centrifugeer gedifferentieerde HL60 cellen bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen met het berekende volume van 0,1% BSA / RPMI 1640 medium in stap 3.6.2) tot een uiteindelijke celdichtheid van 2 x 10 6 cellen / ml. Start de mobiliteit cel analyse gegeven apparaat en de pc voor het verkrijgen. Sluit het apparaat aan op de pc. Zet de mobiliteit cel analyse apparaat. Schakel de PC. Start Up the Cell Mobility Analysis Device Software. Observeer 5 bedieningspanelen: camera, verwarming, schieten, memo, en camerabeelden. Op het beeld camera bedieningspaneel gebruiken "horizontale lijn" of "Vertical line" aan de houder / uitzicht positie in real-time aan te passen aan de camera te centreren in het beeld camera panel. Op de camera bedieningspaneel, selecteer CH1 tot CH6 om de camera te verplaatsen naar de gedefinieerde kanaal. Om de velden van een kanaal view te centreren, klikt u op "Move L" of "Verplaatsen R" aan te passen van de X-coördinaat van de camera en de centrale positie van de camera horizontaal. Stel de Y-coördinaat van de camera door het draaien van de positie knop op het voorpaneel van de mobiliteit cel analyse gegeven apparaat verticaal te passen op de afbeelding om het scherm te centreren. Op de verwarming bedieningspaneel, zet de "houder temp" tot 37,0 ° C en de "plaat temp" tot 39 ° C. Klik op "Heat" de verwarming te starten. Klik ook "houder" naar de temperatuur met de thermische sensor met de houder controleren. Op de schietpartij panel, voert u "15 sec" bij "Interval" en "30 min" op "Time" voor de tijdstippen en de duur van de chemotaxis assay. Check "verwarming uit op het einde van de opname" om veiligheidsredenen. Wijs een destination voor de opgeslagen beelden. Op het memo panel, het invoeren van de specifieke kenmerken van de experimenten, zoals de cellijn gebruikt, ongeacht of geen behandeling werd toegepast, en de concentratie van chemo-lokstoffen toegepast. Controleer de middenpositie van alle kanalen die worden gebruikt in de experimenten, en herhaal de instelling van alle kanalen indien nodig. Injecteren en cellen uitlijnen als volgt: Verwijder de buffer uit de houder, en neem 8 ul van buffer uit de derde put uit de top voor elk kanaal. Met een spuit 2 pl cellen te injecteren in de tweede put in hetzelfde kanaal observatie van het scherm in real time het aantal cellen en de stroom tijdens het inspuiten. Nadat de cellen goed zijn uitgelijnd, geeft de 8 pi buffer weer toevoegen. Herhaal dezelfde procedure voor de andere kanalen (Figuur 1B). Voeg 2 ml terug naar de houder buffer, en voeg 1 pl 100 nM fMLP de derde en van boven. Start beeldacquisitie en de gegevens op te slaan. Analyseer de verkregen met behulp van beeld tracing software 9 (figuur 2) data. 4. Transfectie met Elektroporatie Onderscheid HL60 cellen 5 dagen voor het experiment, zoals beschreven in hoofdstuk 1. Coat 4-en of 1-en kamers zoals beschreven in hoofdstuk 2. Bereiden en warme RPMI 1640 elektroporatie herstel medium, dat RPMI 1640 medium, 20% (v / v) FBS, 0,1 mM natriumpyruvaat, en 25 mM HEPES bevat, tot 37 ° C. Bepalen voordat de transfectie experiment, voeg ofwel 300 ul of 3 ml RPMI 1640 kweekmedium aan de putjes van de pre-beklede putjes 4 of 1-well kamers, respectievelijk. Incubeer de kamers in een bevochtigde 37 ° C incubator met 5% CO2. Gebruik deze kamers onmiddellijk of bewaar in de incubator voor toekomstig gebruik (twee weken). Tel de celdichtheid van de gedifferentieerde HL60 cellen met een hemocytometer. OPMERKING: De celdichtheid bereikt vaak ongeveer 1,0 x 10 6 cellen / ml. Cel dichtheid groter dan 3,0 x 10 6 cellen / ml geeft meestal ongewenste transfectie-efficiëntie. Aangezien HL60 cellen suspensie cellen, is geen resuspensie vereist. Centrifugeer de cellen bij 200 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en resuspendeer 2 x 10 6 HL60 cellen in 100 pl transfectiereagens. Voeg 4 ug GFP-plasmide PKD1 9 in de 100 pi mengsel van cellen en transfectie reagentia en meng voorzichtig en grondig. Voeg het mengsel in de kuvet. Selecteer vooraf ingestelde van de fabrikant van het programma voor het menselijk leukocyten cellijn en voer de elektroporatie. OPMERKING: Meer informatie is beschikbaar op de website van de fabrikant. Na elektroporatie, onmiddellijk en voorzichtig voeg voorverwarmde 500 pl RPMI 6140 elektroporatie recovery medium aan de cellen, enzachtjes de cellen te brengen van de cuvette naar een 1,6 ml buis met de plastic pipetten. Incubeer de cellen gedurende 30 min in een bevochtigde 37 ° C incubator met 5% CO2. Zaad 100 ul of 500 ul van cellen in een putje van een 4-put of een 1-well kamer, respectievelijk. Voeg RPMI 1640 kweekmedium tot een eindvolume van 1 ml of 4 ml diezelfde putje van een 4-wells of 1 putjes kamer respectievelijk. Incubeer de cellen in een bevochtigde 37 ° C incubator met 5% CO2 gedurende 3 uur. Pre-warm RPMI 1640 honger medium tot 37 ° C. Met behulp van een 1 ml pipet, verwijder voorzichtig 0,8 ml of 3 ml RPMI 1640 kweekmedium uit de bron van een 4-well kamer of een 1-well kamer, respectievelijk. Wees voorzichtig en vermijd weg te zuigen hechtende HL60 cellen. LET OP: HL60 cellen groeien en worden gedifferentieerd in suspensie media. Na gedifferentieerde of bewerkt, HL60 cellen hechten aan de ondergrond bekleed met polylysine, collageen, gelatine of fibronectin. Voeg 0,8 ml of 3 ml RPMI 1640 medium honger in de put van een 4-put of 1-well kamer, respectievelijk. Wacht 1 uur. LET OP: Op dit punt de cellen zijn klaar voor de beeldvorming experimenten 9. 5. Toezicht GPCR-gemedieerde Membraan Translocatie van PKD1 door Multi-channel fluorescentiemicroscopie Bereid vers mengsel van 100 nM fMLP en 1 ug / ml Alexa 594 in RPMI 1640 medium uitgehongerd als stimuli. Opmerking: Het mengsel van fMLP en Alexa 594 nodig vers worden aangebracht om maximale efficiëntie te garanderen. Mount een 4-kamer en ingezaaid met cellen over een 40X olie lens. Stel de fluorescentiemicroscoop in de Multichannel Configuration als volgt: Stel de groene emissie kanaal (500-530 nm) voor GFP-tag PKD1, rood emissie kanaal (580-620 nm) voor de chemoattractant fMLP (Alexa 594), en uitgezonden licht kanaal voor het identificeren van het naleven HL60 cellen. Start "live" verwerving enoptimaliseren van de overname voorwaarden van de drie kanalen: Fine-tunen tussen intensiteit en laservermogen voor alle drie kanalen om photobleach te minimaliseren voor een langere periode van de beeldvorming. Eventueel gemiddeld elke 2-4 frames om de ruis verhouding verlagen voor betere beeldkwaliteit. Gebruik een 1 seconde interval. Zoek voor het hechten van cellen die sterk PKD1-GFP te uiten in de mening van de GFP en DIC (differentieel interferentie contrast) kanaal. Hechtende cellen zijn morfologisch vlak en niet snel bewegen. Na het identificeren hechten HL60 cellen die sterk express GFP-PKD1, optimaliseren van de overname toestand door verlaging van de laservermogen tegelijk de detector versterking voor elk kanaal de photobleach langdurige imaging (figuur 3A) te verlagen. Neem 100 ul van fMLP / Alexa 594-oplossing met een 200 ul pipet en zet apart. Selecteer de "time-lapse overname" en stel de intervallen2 sec en het aantal frames te verwerven tot 100. OPMERKING: de frequentie en aantal frames te verwerven afhangen van het doel van de experimenten. 1-2 sec intervallen en 100 frames worden vaak gebruikt voor beeldvorming experimenten, zoals in figuur 3. Voor langzaam migrerende cellen, langere tussenpozen nodig voor langdurige beeldvorming. Daarentegen voor snelle migrerende cellen, kortere tussenpozen nodig voor het waarnemen van de continue gegevens van celmigratie. Verwijder voorzichtig het deksel van een 4-wells aangebracht dat de positie van de kamer niet wordt gewijzigd. Start acquisitie onmiddellijk verwerven 3-5 beelden van de gestimuleerde cellen bij het positioneren van de 200 ui pipet rechtstreeks via cellen met de vlek van laserlicht als richtlijn. Pipetteer de fMLP / Alexa 594 mengsel over de cellen in beeld wordt gebracht met een snelle en gelijkmatige stroom en de afwerking van de complete set van time-lapse acquisitie. Naam en opslaan van de gegevens die zullen worden onderworpen aan verdere data-analyse. </ol> 6. Imaging Chemotaxing Cellen in zichtbaar en controleerbaar Chemo-lokstof Stimuli Met behulp van een 10 pl micropipet en injectie tips, opvulling van een micropipet met 30 pi vers bereid mengsel van fMLP en alexa594. Bevestig de micropipet een micropipet houder gemonteerd op een microscoop podium en sluit de slang aan de druk toevoereenheid, een inrichting die een constante druk op fMLP / alexa594 oplossing vrijgeven van de micropipet een constante gradiënt genereren biedt. Schakel de druk levering en stel de compensatie druk (Pc) tot 70 hPa. Monteer een 1-well chambered dekglaasje ingezaaid met HL60 cellen die PKD1-GFP over een 40X olie lens op een confocale microscoop of een equivalent fluorescentiemicroscoop. Stel acquisitie in channel modus in de volgende configuratie: groene kanaal (500-530 nm) voor GFP-tag PKD1; rode kanaal (580-620 nm) voor de chemoattractant fMLP (alexa594); en transmitted licht kanaal voor het identificeren van het naleven HL60 cellen. Start "live" verwerving en het optimaliseren van de overname voorwaarden voor de drie kanalen: stel de intensiteiten van elk kanaal voor de kwantitatieve analyse van beeldgegevens; fine-tunen tussen intensiteit en laservermogen voor alle drie kanalen om beelden met de beste kwaliteit te verkrijgen en de foto-bleekmiddel te minimaliseren. Indien nodig, gemiddeld om de 2-4 frames voor een betere beeldkwaliteit. We gebruiken meestal een 1 seconde interval. Start "live" acquisitie en zoek voor het hechten van cellen die sterk PKD1-GFP te uiten in de mening van de GFP en doorgelaten licht kanalen. Gebruik helderveld optiek, midden de micropipet in het middenveld gezien (figuur 4A) teneinde de fMLP verloop visualiseren en de kleefstof HL60 cellen die PKD1-GFP. Selecteer time-lapse acquisitie en stel de intervallen tot en met 2 sec intervallen en het aantal frames te verwerven tot 100. LET OP: Na het verzamelen van elke tIME-lapse-serie, naam en sla de gegevens die zullen worden onderworpen aan verdere data-analyse.