يقترن تصوير البروتين G مستقبلات بوساطة الكيميائي والأحداث يشير في خلايا HL60 العدلات مثل
Summary
المقايسات الكيميائي البصرية ضرورية لفهم أفضل لكيفية الخلايا حقيقية النواة التحكم بوساطة جاذب كيميائي الاتجاه الهجرة الخلية. هنا، نحن تصف الأساليب التفصيلية ل: 1) في الوقت الحقيقي، وارتفاع القرار، رصد المقايسات الكيميائي متعددة، و2) تصور في وقت واحد التدرج جاذب كيميائي وديناميات الزمانية المكانية من الإشارات الأحداث في الخلايا HL60 مثل العدلات.
Abstract
Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.
Introduction
الخلايا حقيقية النواة بمعنى والتحرك نحو التركيز العالي في التدرج جاذب كيميائي، المشار عملية الخلوية كما الكيميائي. يلعب الكيميائي أدوارا حاسمة في العديد من العمليات الفسيولوجية، مثل التطور الجنيني 1، الخلايا العصبية الزخرفة 2، ورم خبيث من الخلايا السرطانية 3، تجنيد العدلات إلى مواضع الالتهابات 4، وتطوير نموذج حي Dictyostelium discoideum 5. بشكل عام، والخلايا حقيقية النواة بمعنى chemoattractants باستخدام G البروتين يقترن مستقبلات 5. إشراك chemoattractants مع هذه المستقبلات يعزز تفكك البروتينات G heterotrimeric Gα وGβγ، والتي بدورها تفعيل المصب مسارات نقل الإشارة التي تنظم في نهاية المطاف تنظيم الزمانية المكانية من الهيكل الخلوي الأكتين لقيادة خلية الهجرة 5-9.
تم البيولوجيا الخلوية تطوير وتحسين chemotaxغير المقايسات لدراسة كيف وجهت مجموعة مستقبلات البروتين يقترن (GPCR) يشير يتوسط الهجرة الخلية. تم تطوير بويدن غرفة أو الهجرة transwell فحص في عام 1960 من قبل بويدن 10. الفحص يعمل عن طريق إنشاء التدرج من المركبات جاذب كيميائي بين اثنين من الآبار التي يتم فصلها بواسطة غشاء الصغيرة التي يسهل اختراقها. بساطته وسهولة الاستخدام جعله الأكثر استخداما على نطاق واسع الكيميائي فحص حتى الآن. ومع ذلك، فإن الفحص لا تمكن عملية الهجرة من الخلايا أن تصور. غرفة زيجموند هو أول جهاز ميكروفلويديك البصرية التي تتيح التصوير واضح للهجرة الخلايا على ساترة عبر انقباض الضيق نحو جاذب كيميائي مصدر 11. دان 12 وInsall 13 معدلة ومحسنة عالية الدقة والقدرة على التصوير على المدى الطويل من زيجموند الكيميائي غرفة الفحص. بسبب خصائص يمكن التنبؤ بها للغاية،-نشر المهيمن تدفق السوائل، وكان على microfluidics توفير حلول للالمقبل من الجيلعلى المقايسات الكيميائي مثل EZ-TAXIScan (جهاز تحليل حركية الخلية).
مع استقرار التدرج ضمان، يسمح الجهاز ستة الكيميائي المقايسات التي يتعين القيام بها في وقت واحد (الشكل 1A). وعلى النقيض من التدرجات الثابتة إتجاهي ولدت في مختلف المقايسات غرفة أعلاه، الإبرة أو micropipette مقايسة التي وضعتها جونتر Gerisch يولد التدرج مع مصدر متحرك 14. في الفحص، يتم تحريرها جاذب كيميائي من micropipette المنقولة لتوليد التدرج مستقرة. مع هذا الاختبار إبرة، وجد الباحثون أن خلايا مختلفة تولد pseudopods مع خصائص مختلفة جذريا. تطبيق المجهر الفلورسنت، كنا قادرين على تصور التدرج لتسهيل قياس الكمي في جميع أنحاء 15. في هذه الدراسة، ونحن تصف الأساليب التفصيلية لإعداد HL60 الكيميائي (اللوكيميا البشري) خلايا، ورصد في وقت واحد عدة أسا الكيميائييس مع جهاز تحليل حركية الخلية، وتصور ديناميات الزمانية المكانية بوساطة هذه العملية من الجزيئات يشير مثل بروتين كيناز D1 في الخلايا الحية واحدة ردا على مرئية، منبهات جاذب كيميائي يمكن السيطرة عليها spatiotemporally. يمكن تطبيقها لدينا طرق التصوير المتقدمة للدراسات الكيميائي العامة، وهي مناسبة خاصة بالنسبة للأنظمة خلايا الثدييات.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة، وتبين لنا مثالين من المقايسات الكيميائي: لأول مرة، ورصد في وقت واحد من المقايسات الكيميائي متعددة من قبل الجهاز تحليل حركية الخلية؛ والثانية، والتصور التدرج جاذب كيميائي وديناميات الزمانية المكانية من الإشارات الأحداث في نفس الخلايا في الوقت الحقيقي.
جهاز تحليل التنقل خلية لعدة فحوصات الكيميائي في وقت واحد
في هذه الدراسة، قدمنا بروتوكول مفصلة لأداء عدة فحوصات الكيميائي في وقت واحد باستخدام جهاز تحليل الحركة الخلية. هذا الجهاز يسمح للمستخدم لمراقبة السلوك الكيميائي الخلوي مع 10X عدسة موضوعية في مراقبة مشرق الميدان التقليدية. بسبب الخصائص نشر المهيمن على تدفق السوائل، وجهاز تحليل التنقل خلية يولد يمكن التنبؤ بها للغاية، التدرجات مستقرة ويسمح ما يصل الى ستة الكيميائي المقايسات التي يتعين الاضطلاع بها في وقت واحد. الخطوات الحاسمة في البروتوكول هيللحصول على تدرجات موثوقة ولمحاذاة الخلايا على خط شرفة. يجب على المستخدم تتبع بدقة تعليمات الشركة الصانعة لتجميع حامل وحقن chemoattractants والخلايا. أيضا تعليمات مفصلة على شبكة الإنترنت. بالمقارنة مع الطرق البديلة الكيميائي 11-13،15، وهذا الجهاز بشكل كبير على تحسين موثوقية وكفاءة فحوصات الكيميائي. أربعة أحجام للحراك خلية التحليل رقاقة الجهاز في أحجام 4، 5، 6، و 8 ميكرون تتوفر لاستيعاب أنواع وأحجام مختلفة من الخلايا المختلفة. وجدنا أن 4 أو 5 ميكرون التنقل خلية رقاقة جهاز تحليل مناسب لHL60 ود. خلايا discoideum، والتي هي حوالي 10-15 ميكرون في القطر. ومع ذلك، الحد واحد هو أن هذا الجهاز غير مناسب لجميع أنواع من الخلايا. كان لدينا نجاح يذكر باستخدام التنقل خلية جهاز التحليل الكيميائي مقايسة مع الخلايا Raw267.4. قد يكون السبب أن الخلايا Raw267.4 تهاجر ببطء شديد. الوقت اللازم لتشي كفاءةmotaxis الخلايا Raw267.4 قد تكون أطول بكثير من الوقت الذي يتم الحفاظ على التدرج من قبل الجهاز. بدلا من ذلك، عملت فحص transwell الهجرة بشكل جيد لخلايا Raw267.4 9. الحد الآخر هو أن المراقبة الفلورسنت غير ممكن مع الجهاز الحالي. والاتجاه المستقبلي هو رصد التصوير الفلورسنت مع أعلى التكبير. وهذا ممكن مع تحسن جهاز تحليل حركية الخلية، وهو مجهز الكشف الفلوري وعدسة الهدف 100X. وبالإضافة إلى ذلك، يتم زيادة عدد فحوصات في وقت واحد أيضا إلى 12. كل هذه التحسينات تسهيل إنتاجية محسنة من المقايسات الكيميائي ومراقبة ديناميات التحت خلوية في الخلايا المهاجرة.
كفاءة ترنسفكأيشن عالية من HL60 الخلايا للتعبير عن الفلورسنت البروتين الموسومة البروتين
خلايا HL60 هي خط خلية سرطان الدم تقسيم بنشاط وتنمو في تعليق. كما ذكرت سابقا 18-20، وخلايا HL60 مقاومة لزنقل الشم. على حد سواء وقد تم اختبار الدهون ونقل Electroporation للجينات، وتم الحصول على أعلى كفاءة ترنسفكأيشن مع Electroporation لل، كما هو موضح بالتفصيل في القسم 4. الحصول على قابلية عالية بعد Electroporation للأمر بالغ الأهمية للحصول على كفاءة ترنسفكأيشن عالية بسبب الضرر الشديد الذي ينتج من Electroporation لل. بعد ذلك، يطلب من التعامل مع الخلية دقيق ولطيف، خصوصا بعد Electroporation لل. تحتوي كافة وسائل الإعلام أن تكون قبل حرارة وأضاف بلطف إلى الخلايا في أي خطوات بعد Electroporation لل. فمن الأهمية بمكان لتقليل الوقت تعرض الخلايا إلى كاشف Electroporation للأيضا. لتجنب موت الخلايا، بعد Electroporation لل، يجب إضافة RPMI 1640 الانتعاش Electroporation للمتوسطة إلى الخلايا على الفور. لقد وجدنا أن 20٪ FBS في المتوسط الانتعاش يعطي معدل استرداد خلية أعلى بكثير من 10٪ FBS. بعد Electroporation لل، الحضانة في RPMI 1640 Electroporation للمتوسطة الانتعاش لمدة 30 دقيقة أمر بالغ الأهمية لزيادة سلامة وترنسفكأيشنكفاءة. لزيادة كفاءة ترنسفكأيشن، وكنا أيضا 4 ميكروغرام DNA البلازميد في ترنسفكأيشن، الذي هو تقريبا مبلغ مرتين البلازميد الموصى بها من قبل الشركة المصنعة.
هناك نوعان من القيود الرئيسية على ترنسفكأيشن Electroporation لل: وtransiency للتعبير البروتين والحد عدد الخلايا (2 × 10 6 خلايا لكل ترنسفكأيشن). في خلايا غير متمايزة، والتعبير هو كشفها فقط خلال أول زوجين من انقسامات الخلية، حيث يتم المخفف البلازميد ناقلات بمقدار النصف بعد كل انقسام الخلايا. لوHL60 متباينة خلايا البقاء على قيد الحياة لا أكثر من 48 ساعة. ونتيجة لذلك، فإن أي تجربة تتطلب تعداء جديدة 6 ساعة قبل التجربة. عدد الخلايا ل electroporation واحد فقط يلبي الحد الأدنى من المتطلبات لأي فحوصات البيوكيميائية. لغرض الاستخدام المتكرر أو كمية كبيرة، فمن المستحسن أن يتم إنشاء خط الخلية HL60 غير متمايزة تعبر عن ثبات البروتين من مبادرة الخوذ البيضاء الفائدةوقد تم وسمها الفصل مع بروتين فلوري من قبل ناقلات فيروسية، إذا كان ناقلات فيروسية غير متوفرة أو يمكن بناؤها.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by the intramural fund of NIAID, NIH.
Materials
| RPMI 1640 Medium GlutaMAX | Life technologies | 61870-036 | |
| Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scietific | 11360-070 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| 1M HEPES sterile solution, pH7.3 | Quality Biological Inc. | A611-J848-06 | |
| Penicillin streptomycin solution | Fisher Scientific | 15140122 | |
| NucleofectorTM 2b | Lonza | AAB-1001 | |
| AmaxaTM Cell Line NucleofectorTM Kit V including NucleofectorTM Solution, Singe use pipettes, AmaxaTM certified 100 ml aluminum electrode cuvettes | Lonza | VCA-1003 | |
| Lab-Tek chambered #1.0 Borosilicate Coverglass | Nalge Nunc International Inc | 155383 | |
| 2 % Gelatin solution | Sigma-Aldrich | G1393 | |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| HBSS (Hanks’ Balanced Salt Solution) | Life technologies | 14025-076 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3803 | |
| Single well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International Inc | 155361 | |
| Four-well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International Inc | 155383 | |
| Alexa 594 | Thermo Fisher Scientific | A-10438 | |
| fMLP | Sigma -Aldrich | F3506-5MG | |
| Cover glass thickness 2 22 x 22 mm | Corning | 2855-22 | |
| EZ-TAXIScan | Effector Cell Institute, Inc. | MIC-1001 | |
| EZ-TAXIScan chip (5 mm) | Effector Cell Institute, Inc. | EZT-F01-5 | |
| 1701RN 10ul syringe | Hamilton | 80030 | |
| Femtotips II Injection tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | |
| TransferMan NK2, including motor module, X head with angle adjuster, and Positioning aids. | Eppendorf | 5188900056 | |
| DIAS software | Solltech Inc. | ||
| LSM 780 META or equivalent confocal microscope with a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens | Carl Zeiss |
References
- Pocha, S. M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations. Annual review of genetics. 48, 295-318 (2014).
- Wen, Z., Zheng, J. Q. Directional guidance of nerve growth cones. Current opinion in neurobiology. 16, 52-58 (2006).
- Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. Directed cell invasion and migration during metastasis. Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).
- Zigmond, S. H. Chemotaxis by polymorphonuclear leukocytes. The Journal of cell biology. 77, 269-287 (1978).
- Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-8 (2008).
- Dong, X., et al. P-Rex1 is a primary Rac2 guanine nucleotide exchange factor in mouse neutrophils. Current biology : CB. 15, 1874-1879 (2005).
- Li, Z., et al. Directional sensing requires G beta gamma-mediated PAK1 and PIX alpha-dependent activation of Cdc42. Cell. 114, 215-227 (2003).
- Van Haastert, P. J., Devreotes, P. N. Chemotaxis: signalling the way forward. Nature reviews: Molecular cell biology. 5, 626-634 (2004).
- Xu, X., et al. GPCR-Mediated PLCbetagamma/PKCbeta/PKD Signaling Pathway Regulates the Cofilin Phosphatase Slingshot 2 in Neutrophil Chemotaxis. Mol Biol Cell. , (2015).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of experimental medicine. 115, 453-466 (1962).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. The Journal of cell biology. 75, 606-616 (1977).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. Journal of cell science. 99 (Pt4), 769-775 (1991).
- Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PloS one. 5, e15309 (2010).
- Bozzaro, S., Fisher, P. R., Loomis, W., Satir, P., Segall, J. E. Guenther Gerisch and Dictyostelium, the microbial model for ameboid motility and multicellular morphogenesis. Trends in cell biology. 14, 585-588 (2004).
- Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein coupled receptor (GPCR)-mediated signaling events that control chemotaxis of Dictyostelium discoideum. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Lin, F., et al. Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices. Lab Chip. 4, 164-167 (2004).
- Eiseler, T., et al. Protein kinase D1 regulates cofilin-mediated F-actin reorganization and cell motility through slingshot. Nature cell biology. 11, 545-556 (2009).
- Roddie, P. H., Paterson, T., Turner, M. L. Gene transfer to primary acute myeloid leukaemia blasts and myeloid leukaemia cell lines. Cytokines Cell Mol Ther. 6, 127-134 (2000).
- Schakowski, F., et al. Novel non-viral method for transfection of primary leukemia cells and cell lines. Genet Vaccines Ther. 2, 1 (2004).
- Uchida, E., Mizuguchi, H., Ishii-Watabe, A., Hayakawa, T. Comparison of the efficiency and safety of non-viral vector-mediated gene transfer into a wide range of human cells. Biol Pharm Bull. 25, 891-897 (2002).
