Visual-Chemotaxis-Assays sind für ein besseres Verständnis, wie eukaryotische Zellen steuern chemoattractant vermittelten Richtungszellmigration. Hier beschreiben wir detaillierte Methoden für: 1) in Echtzeit, hochauflösende Überwachung mehrerer Chemotaxis-Assays und 2) gleichzeitig die chemische Lockstoffe Gradienten zu visualisieren und die räumlich-zeitliche Dynamik der Ereignisse in Neutrophilen wie HL60-Zellen signalisiert.
Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.
Eukaryotischen Zellen erfassen und innerhalb eines chemische Lockstoffe Gradienten in Richtung der höheren Konzentration zu bewegen, ein zellulärer Prozess bezeichnet als Chemotaxis. Chemotaxis spielt eine entscheidende Rolle bei vielen physiologischen Prozessen, wie der Embryonalentwicklung 1, Neuron Musterung 2, Metastasierung von Krebszellen 3, die Rekrutierung von Neutrophilen an Entzündungsstellen 4 und die Entwicklung des Modellorganismus Dictyostelium discoideum 5. Im allgemeinen Sinn eukaryotischen Zellen unter Verwendung Chemoattraktoren G – Protein-gekoppelten Rezeptoren 5. Der Eingriff der Chemoattraktoren mit diesen Rezeptoren fördert die Dissoziation der heterotrimeren G – Proteine G & agr; und Gβγ, die stromabwärts Signaltransduktionswege aktivieren wiederum die letztendlich die räumlich – zeitliche Organisation der Aktin – Zytoskelett regulieren 5-9 Zellmigration zu treiben.
Zellbiologen haben die Entwicklung und die Verbesserung der chemotaxAssays ist zu prüfen, wie G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) Signalisierungs mediates Zellmigration gerichtet. Die Boyden – Kammer oder Transwell – Migrationstest wurde 1960 von Boyden 10 entwickelt. Der Test arbeitet mit einem Gradienten von chemoattractant Verbindungen zwischen zwei Vertiefungen zu schaffen, die durch eine mikroporöse Membran getrennt sind. Seine Einfachheit und Benutzerfreundlichkeit machen es die am häufigsten verwendete Chemotaxis-Assay auf dem Laufenden. Allerdings ist der Test nicht die Migration Prozess der Zellen ermöglichen, visualisiert werden. Die Zigmond Kammer ist das erste visuelle Mikrofluidik – Vorrichtung , die auf einem Deckglas über eine Engstelle in Richtung einer Quelle chemische Lockstoffe 11 freie Darstellung der Zellmigration ermöglicht. Dunn 12 und Insall 13 modifiziert und verbessert , um die hochauflösenden und Langzeitabbildungsfähigkeit der Kammer – Chemotaxis – Assay Zigmond. Wegen der in hohem Maße vorhersehbar, diffusions dominanten Eigenschaften der Fluidströmung, Mikrofluidik hat Lösungen für die nächste Generati Bereitstellungauf Chemotaxis-Assays wie EZ-TAXIScan (eine Zellmobilität Analysegerät).
Mit der Stabilität des Gradienten gewährleistet ist , ermöglicht die Vorrichtung sechs Chemotaxis – Assays gleichzeitig durchgeführt werden (1A). Im Gegensatz zu den oben in den verschiedenen Kammer Assays erzeugten Gradienten richtungs fixiert, entwickelt sich die Nadel oder Mikropipette Assay von Guenther Gerisch einen Gradienten mit einer beweglichen Quelle 14. In dem Assay chemoattractant wird von einem beweglichen Mikropipette freigesetzt einen stabilen Gradienten zu erzeugen. Mit dieser Nadel-Test, fanden die Forscher heraus, dass verschiedene Zellen Pseudopoden fundamental unterschiedlichen Eigenschaften erzeugen. Die Anwendung der Fluoreszenzmikroskopie konnten wir den Gradienten zu visualisieren ihre quantitative Messung im gesamten 15 zu erleichtern. In dieser Studie beschreiben wir detailliert Verfahren zur Herstellung von chemotaktischen HL60 (Mensch Promyelozytenleukämie-Zellen), gleichzeitig mehrere Chemotaxis ASSA Überwachungsys mit der Zellmobilitätsanalysegerät, und Visualisieren der GPCR-vermittelten räumlich-zeitliche Dynamik der Signalmoleküle wie Protein-Kinase-D1 in einzelnen lebenden Zellen in Reaktion auf sichtbares, räumlich-zeitlich steuerbare chemoattractant Reize. Unsere fortschrittliche Bildgebungsverfahren können auf allgemeine Studien Chemotaxis angewendet werden und eignen sich besonders für Säugetierzellsysteme.
In der vorliegenden Studie zeigen wir zwei Beispiele von Chemotaxis-Assays: erstens gleichzeitige Überwachung mehrerer Chemotaxis Assays von der Mobilitätsanalysevorrichtung Zelle; und zweitens, die Visualisierung des chemoattractant Gradienten und die räumlich-zeitliche Dynamik der Ereignisse in den gleichen Zellen in Echtzeit zu signalisieren.
Zellmobilität Analysegerät für mehrere gleichzeitige Assays Chemotaxis
In der vorliegenden Studie haben wir ein detailliertes Protokoll mehrere gleichzeitige Assays Chemotaxis unter Verwendung einer Zellmobilität Analysegerät durchzuführen. Dieses Gerät ermöglicht dem Benutzer, zelluläre Chemotaxis Verhalten mit einem 10fach Objektiv in herkömmlichen Hellfeld-Beobachtung zu beobachten. Aufgrund der diffusions dominanten Eigenschaften der Fluidströmung, die Zellmobilitätsanalysevorrichtung erzeugt in hohem Maße vorhersehbar, stabile Gradienten und ermöglicht bis sechs Chemotaxis-Assays gleichzeitig miteinander durchgeführt werden. Die kritischen Schritte des Protokolls sindzuverlässige Gradienten zu erhalten und die Zellen auf der Terrasse Linie auszurichten. Der Benutzer sollte streng den Anweisungen des Herstellers für die Halterungsanordnung und die Injektion von Chemoattraktoren und Zellen folgen. Detaillierte Anleitungen sind auch online verfügbar. Im Vergleich zu alternativen Methoden Chemotaxis 11-13,15, verbessert diese Vorrichtung erheblich die Zuverlässigkeit und Effizienz der Chemotaxis – Assays. Vier Größen von Zellmobilität Analysegerät Chip in den Größen von 4, 5, 6 und 8 & mgr; m zur Verfügung stehen verschiedene Typen und Größen von Zellen aufzunehmen. Wir fanden heraus , dass eine 4 oder 5 & mgr; m Zellmobilität Analysegerät Chip für den HL60 und D. geeignet ist discoideum Zellen, die etwa 10-15 & mgr; m im Durchmesser sind. Eine Einschränkung ist jedoch, dass diese Vorrichtung für alle Arten von Zellen geeignet ist. Wir hatten wenig Erfolg die Zellmobilität Analysegerät Chemotaxis-Assay mit Raw267.4 Zellen. Der Grund dafür kann sein, dass Raw267.4 Zellen zu langsam wandern. Die Zeit für eine effiziente che erforderlichmotaxis von Raw267.4 Zellen möglicherweise viel länger als die Zeit ist ein Gradient von der Vorrichtung gehalten wird. Stattdessen arbeitete ein Transwell – Migrationstest gut für Raw267.4 Zellen 9. Eine weitere Einschränkung ist, dass Fluoreszenzbeobachtung nicht möglich, mit dem aktuellen Gerät ist. Eine zukünftige Richtung ist Fluoreszenz-Bildgebung mit höherer Vergrößerung zu überwachen. Dies ist möglich mit der verbesserten Zellmobilitätsanalysevorrichtung, die mit Fluoreszenzdetektion und einer 100X Objektivlinse ausgestattet ist. All diese Verbesserungen ermöglichen den verbesserten Durchsatz von Chemotaxis-Assays und die Beobachtung von subzellulären Dynamik in migrierenden Zellen Außerdem wird die Anzahl der gleichzeitigen Assays auch auf 12 erhöht.
Hohe Transfektionseffizienz von HL60-Zellen fluorescent protein-markiertes Protein zu exprimieren
HL60-Zellen sind eine aktive Leukämiezelllinie zu teilen und in Suspension wachsen. Wie bereits 18-20 berichtet, sind HL60 – Zellen resistent gegen gEn-Transfer. Sowohl Lipid und Elektroporation Gentransfer wurden getestet und höhere Transfektionseffizienz wurde mit Elektroporation erhalten, wie dies im Detail in Abschnitt 4 beschrieben, eine hohe Lebensfähigkeit nach der Elektroporation zu erhalten ist entscheidend für den Erhalt der hohen Transfektionseffizienz aufgrund der schweren Schäden, die durch Elektroporation führt. Anschließend gründliche und schonende Handhabung von Zellen erforderlich sind, vor allem nach der Elektroporation. Alle Medien müssen die Zellen in beliebigen Schritten nach der Elektroporation vorgewärmten und vorsichtig hinzugefügt werden. Es ist auch kritisch, um die Belichtungszeit der Zellen an die Elektroporation Reagenz zu minimieren. Um den Zelltod, nach der Elektroporation, RPMI 1640 Elektroporation Recovery-Medium muss sofort zu den Zellen gegeben werden, zu vermeiden. Wir fanden heraus, dass 20% FBS in der Wiederherstellungsmedium, das eine viel höhere Zellgewinnungsrate als 10% FBS gibt. Nach der Elektroporation, die Inkubation in RPMI 1640 Elektroporation Recovery-Medium für 30 min ist für eine größere Lebensfähigkeit kritisch und TransfektionEffizienz. Um weiter die Transfektionseffizienz zu erhöhen, verwendeten wir auch 4 & mgr; g Plasmid-DNA pro Transfektion, die fast das Doppelte Menge von Plasmid ist vom Hersteller empfohlen.
Es gibt zwei Haupteinschränkungen auf Elektroporation Transfektion: Die transiency der Proteinexpression und die Zellzahl Grenze (2 x 10 6 Zellen pro Transfektion). In undifferenzierten Zellen ist die Expression während der ersten paar Zellteilungen nur detektierbar, da der Vektor Plasmid um die Hälfte nach jeder Zellteilung verdünnt wird. Für die differenzierten HL60-Zellen überleben nicht mehr als 48 Stunden. Infolgedessen erfordert jeder Versuch frisch Transfektionen 6 Stunden vor dem Experiment. Die Zellzahl für eine Elektroporation erfüllt lediglich die Mindestanforderung für alle biochemischen Assays. Für die Zwecke der wiederholten Verwendung oder große Menge, wird dringend empfohlen, dass eine undifferenzierte HL60-Zelllinie hergestellt werden, die stabil das Protein von Interesse WHI drücktch wurde mit einem fluoreszierenden Protein, das von einem viralen Vektor markiert, wenn ein viraler Vektor verfügbar ist, oder kann aufgebaut sein.
The authors have nothing to disclose.
This work is supported by the intramural fund of NIAID, NIH.
RPMI 1640 Medium GlutaMAX | Life technologies | 61870-036 | |
Sodium pyruvate | Thermo Fisher Scietific | 11360-070 | |
Fetal bovine serum | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
1M HEPES sterile solution, pH7.3 | Quality Biological Inc. | A611-J848-06 | |
Penicillin streptomycin solution | Fisher Scientific | 15140122 | |
NucleofectorTM 2b | Lonza | AAB-1001 | |
AmaxaTM Cell Line NucleofectorTM Kit V including NucleofectorTM Solution, Singe use pipettes, AmaxaTM certified 100 ml aluminum electrode cuvettes | Lonza | VCA-1003 | |
Lab-Tek chambered #1.0 Borosilicate Coverglass | Nalge Nunc International Inc | 155383 | |
2 % Gelatin solution | Sigma-Aldrich | G1393 | |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
HBSS (Hanks’ Balanced Salt Solution) | Life technologies | 14025-076 | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3803 | |
Single well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International Inc | 155361 | |
Four-well Lab-Tek II coverglass chambers | Nalge Nunc International Inc | 155383 | |
Alexa 594 | Thermo Fisher Scientific | A-10438 | |
fMLP | Sigma -Aldrich | F3506-5MG | |
Cover glass thickness 2 22 x 22 mm | Corning | 2855-22 | |
EZ-TAXIScan | Effector Cell Institute, Inc. | MIC-1001 | |
EZ-TAXIScan chip (5 mm) | Effector Cell Institute, Inc. | EZT-F01-5 | |
1701RN 10ul syringe | Hamilton | 80030 | |
Femtotips II Injection tips | Eppendorf | 5242956003 | |
Femtotips II | Eppendorf | 930000043 | |
TransferMan NK2, including motor module, X head with angle adjuster, and Positioning aids. | Eppendorf | 5188900056 | |
DIAS software | Solltech Inc. | ||
LSM 780 META or equivalent confocal microscope with a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens | Carl Zeiss |