Wie man Basalmembran Stiffness als biophysikalische Auslöser in Prostatakrebs und andere altersbedingte Pathologien oder Stoffwechselkrankheiten Studie

1. Induktion von BM Stiffness induziert durch GLA Behandlung (Nichtenzymatische Crosslinking) Tauen Sie eine gefrorene Fläschchen mit BM-Matrix (10 ml) durch bei 4 ° C inkubiert (stehend auf Eis in einem kalten Raum oder Kühlschrank), bis der Inhalt des Fläschchens geworden Flüssigkeit (8-16 h). Achtung: Wenn ein kalter Raum / Kühlschrank nicht verwendet wird, decken die gesamte Flasche mit Eis. Dies wird die Stammlösung von BM verfestigt verhindern. Für zukünftige Experimente und wiederholten Gefrier-Auftau-Zyklen vermeiden, sind die 25 x 0,4 ml Aliquots aus jeder neuen 10 ml Fläschchen mit BM-Matrix. Shop Fläschchen bei -80 ° C bis zum Ablauf der vom Hersteller angegebene Datum. Bei Bedarf, Vials auftauen bei 4 ° C, die auf Eis für 2 Stunden. Bereiten Sie eine ebene Oberfläche des Eises. Platzieren eines 8-Well-Kammerobjektträger auf der Oberseite der Eis eine Temperatur von 4 ° C während des Beschichtungsverfahrens aufrechterhalten. Auftauen ein Fläschchen mit BM-Matrix bei 4 ° C. Hinweis: Ein 0,4-ml-Ampulle von BM Matrix coa ausreichend ist,t eine ganze 1 x 8-Well-Kammer-Folie. Halten Sie das Fläschchen mit Eis bedeckt, während die Handhabung der BM Matrix verfestigt zu verhindern. Schneiden Sie das Abgabeende einer 200 ul Pipettenspitze mit einer Schere ab. Kühlen Sie die glatten Enden 200 ul Pipettenspitze auf 4 ° C und legen Sie es auf eine 200 & mgr; l Kapazität Pipettierhilfe. Nehmen Sie bis 40 ul der kalten BM Matrix-Lösung in die Pipettenspitze und gibt sie in eine auf dem besten gekühlt 8-Well-Kammerobjektträger aus Glas. Hinweis: 40 ul BM – Lösung genügt , um eine Fläche von 0,8 cm 2 zu bedecken. Halten von Pipettenspitzen während des Beschichtungsverfahrens gekühlt Erstarren der BM-Lösung zu vermeiden. Keine Luftblasen in die BM Matrixlösung einzuführen und sorgen für die gut gleichmäßig ohne die Bildung eines sichtbaren Meniskus an den Kanten beschichtet wird. Wiederholen Sie Schritt 1.4 nach der Anzahl von Vertiefungen und Kammern erforderlich. Nach der Beschichtung, legen Sie die 8-Well-Kammerobjektträger bei 37 ° C für 30 min Polymerisation zu förderndes BM. Schließen Sie den Inkubator Tür sehr sorgfältig unerwünschte Störung der Flüssigkeit rBM zu vermeiden. Überschreiten Sie nicht die 30 Minuten Inkubationszeit Dehydrierung des rBM Gel zu vermeiden. Hinweis: Das erhaltene Gel ist das native Rekonstitution BM (RBM). Die 37 ° C Inkubationsschritt erfordert keine 5% CO 2. Doch für die Bequemlichkeit , diesen Schritt in einer bei 37 ° C und 5% CO 2 (mit Befeuchtung) eingestellt Gewebekultur – Inkubator durchführen. Vorbereitung 50 mM Glykolaldehyd (GLA), verdünnt in 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,8). Sterilisieren der Lösung, indem sie durch einen 0,22 Mikron-Spritzenfilter unter Verwendung einer 50 ml Spritze übergeben. Für eine Vernetzungsreaktion in einem Endvolumen von 250 ul 50 mM GLA, werden 25 & mgr; l von 0,5 M Natriumcyanoborhydrid oder 2,5 M Aminoguanidin bis 125 & mgr; l 100 mM GLA (2x stock) und 100 ul 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,8 ). Sterilisieren der Stammlösungen, indem sie durch einen 0,22-Mikron-Spritzenfilter mit einer 50-ml-Spritze vorbei. Vorsicht: Behandeln Sie Natriumcyanoborhydrid einen Laborkittel, Handschuhe, Gesichtsmaske und Atemschutzmaske tragen, während in einem Abzug arbeiten. In 250 ul GLA Lösung des polymerisierten rBM Gel zu bedecken und für 6 Stunden bei 37 ° C inkubieren einen halbsteifen rBM Gel oder 14 Stunden, um eine steife rBM Gel herzustellen. Hinweis: Die Lautstärke von GLA decken hinzugefügt muss das polymerisierte rBM Gel und sollte entsprechend angepasst werden. Wenn verschiedene GLA Inkubationszeiten verwendet werden, sollten die rBM Gele die Falte-Erhöhung der rBM Steifigkeit zu bestimmen, werden analysiert (siehe Schritt 2.4). Bereiten einer negativen Kontrolle durch ein natives rBM Gel in 250 & mgr; l steriler Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) für 14 Stunden bei 37 ° C inkubiert. Bereiten zwei weitere Kontrollen, wo die Bildung der Schiff'schen Base oder Amadori-Umlagerung Addukts während der Vernetzungsreaktion gehemmt werden, durch die Zugabe von 50 mM Natriumcyanborhydrid oder 250 mM Aminoguanidin. Bereiten Sie 1 M Glycin ethyl ester (GEE) in PBS verdünnt. Sterilisieren der Lösung, indem sie durch einen 0,22 Mikron-Spritzenfilter unter Verwendung einer 50 ml Spritze übergeben. Nach der angegebenen Inkubationszeit, entfernen Sie vorsichtig die GLA-Lösung aus den vernetzten rBM Gele, GLA Lösung Inhibitoren von den Steuer rBM Gele und PBS aus den Steuer nativen rBM Gele enthalten. In 250 ul GEE Lösung für alle RBM Gele und Inkubation bei 37 ° C für 1 Stunde. Anmerkung: Dieser Schritt löscht die Vernetzungsreaktion. Waschen Sie alle rBM Gele 10-mal in 500 & mgr; l PBS alle Spuren von GLA und GEE zu entfernen. Inkubieren der rBM Gele über Nacht bei 37 ° C in 400 & mgr; l PBS, ihre Dehydratisierung zu verhindern. Analysieren Sie die rBM Gele für AGE Akkumulation, nicht-enzymatische Vernetzung und viskoelastischen Eigenschaften (Schritte 2,1-2,4). Für rheometric Analyse ihrer viskoelastischen Eigenschaften bereiten die rBM Gele in Klonierungsringe (Schritt 2.4). Für die Zellkultur gründlich rBM Gele 2 mal mit 500 & mgr; l Kultur michdia bevor die Zellen Säen (Schritte 5 und 6). Führen Sie wäscht sanft ohne die Pipettenspitze berühren die Geloberfläche. 2. Quantifizierung der nichtenzymatischen Crosslinking und Stiffness von RBM mit GLA behandelten Photometrische Analyse Messung der AGE-Akkumulation in GLA-behandelten und Kontroll rBM Gelen mittels photometrischer Analyse des Ausmaßes der Maillard-Reaktion zu bestimmen. Nach dem Schritt 1.11, die PBS aus rBM Gele in den 8-Brunnen Kammer Dias entfernen und 250 ul eiskaltem doppelt destilliertes Wasser. Inkubieren bei 4 ° C für 16-24 Stunden, um sicherzustellen, daß die Matrix vollständig verflüssigt wird. Hinweis: rBM Peptide in dieser Lösung enthalten AGEs mit Auto-Fluoreszenz-Eigenschaften. Übertragen des verflüssigten BM-Lösung in ein 1,5-ml-Röhrchen und Messen der Fluoreszenzemission der Lösung unter Verwendung eines Spektrophotometers (Anregungswellenlänge = 370 nm; Emissionswellenlänge = 440 nm). SDS-PAGE-Analyse von Cyanogenbromid Peptides Lösung der GLA-behandelten und Kontroll rBM Gelen auf einem Polyacrylamidgel, um zu bestätigen, dass GLA Vernetzung und die Bildung von Makrofasern induziert wurde. Zentrifugieren Sie das verflüssigte BM-Lösung in Schritt 2.1.1.2 bei 10.000 × g für 5 Minuten bei Raumtemperatur gesammelt. Bereiten Sie eine Stammlösung, die 2 g / ml Bromcyan in Acetonitril verdünnt. Achtung: Immer Bromcyan in einem Abzug handhaben, während ein Laborkittel, Handschuhe, Gesichtsmaske und Atemschutz tragen. Entfernen Sie den Überstand resuspendieren das BM-Gel-Pellet in 500 ul 20 mg / ml Bromcyan + 70% v / v Ameisensäure und Inkubation über Nacht bei RT. Verwenden Sie eine 1 ml Einwegspritze, die erneut suspendiert BM Gel-Pellet in eine Dialysekassette mit einem Molekulargewicht zu übertragen 3,5 kDa abgeschnitten. Tauchen Sie die Kassette in einen 500-ml-Becherglas, das 500 ml doppelt destilliertem Wasser und einem magnetischen Rührstab.Platzieren dieses auf einem Magnetrührer und dialysiert über Nacht (16 h) bei 4 ° C (in einem kalten Raum), um alle Spuren von Bromcyan und Ameisensäure zu entfernen. Verwenden Sie eine 1 ml Einwegspritze, die dialysiert BM-Lösung aus der Kassette in ein 1,5-ml-Röhrchen zu übertragen. Analyse 25 ul jeder Probe BM auf einem 12% v / v Polyacrylamidgel 10,11. Nach SDS-PAGE, durchführen Silberfärbung des Polyacrylamidgels 12 die elektrophoretische Muster von Bromcyan-Matrix – Peptide 13 sichtbar zu machen. Immunfluoreszenz-Mikroskopie-Analyse Führen Sie Immunfluoreszenzanfärbung von GLA behandelt und Kontrolle rBM Gele mit anti-AGE / Pentosidin, Anti-Kollagen IV und anti-Laminin durch konfokale Mikroskopie , gefolgt von Antikörpern gegen akkumulierte AGEs und Kollagen IV / Laminin Faserstrukturänderungen in der vernetzten rBM geliert 13 visualisieren. Hinweis: Immer ein ausreichendes Volumen verwenden, um die enti abzudeckenre rBM Gel während Inkubationen und Waschungen, ohne die rBM Oberfläche mit der Pipettenspitze berühren. Einzelheiten von 3D acini Kulturen durch Immun Analyse siehe Referenz 6 und für die konfokale Mikroskopie von 3D acini siehe Referenz 14. Wasch GLA behandelten und Kontroll rBM Gelen in 8-wells chamber slides 2 mal mit 300 & mgr; l PBS + (PBS , enthaltend 0,1 mM CaCl 2 und 0,5 mM MgCl 2) für 5 min bei RT. Entfernen Sie die PBS + dann 300 ul von 4% w / v Paraformaldehyd (PFA), verdünnt in PBS + jedes rBM Gel zu bedecken. Inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf der RBM-Komponenten zu beheben. Entfernen Sie die 4% w / v PFA-Lösung. Add 300 ul 75 mM NH 4 Cl + 0,5 mM MgCl & sub2 ; -Lösung und Inkubation für 5 min bei RT (repeat 5x) die Fixierung zu quenchen. Bereiten Sie Immunofluoreszenz – Puffer (IF – Puffer) durch die folgende Lösung in sterilem Wasser Herstellung: 130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3,5 mM NaH2 PO 4, 7,7 mM NaN 3, 0,1% w / v Rinderserumalbumin, 0,5% v / v Polyethylenglykol tert- octylphenyl ether und 0,05% v / v Polyethylenglykol Sorbitanmonolaurat. Bereiten Sie IF-Puffer blockiert durch Ergänzung IF-Puffer mit 20% v / v Ziegenserum. Entfernen Sie die Lösch Lösung und 300 & mgr; l von IF Blocking-Puffer in den rBM Gele unspezifische Reaktionen zu verhindern. Inkubiere 2 h bei RT auf einem Schütteltisch. Entfernen Sie die IF-Blockpuffer und Inkubation die rBM Gele für 16 Stunden bei 4 ° C mit 300 & mgr; l primärer Antikörper verdünnt in IF-Puffer blockiert (1: 500 Maus-Anti-Pentosidin mAb; 1/250 Kaninchen-Anti-Kollagen IV pAb; 1 / 250 Kaninchen-anti-Laminin-A / C pAb). Anmerkung: Die Inkubationen für länger als 20 Stunden bei 4 ° C kann das rBM verflüssigen. Entfernen des primären Antikörpers und wasche 3mal (jeweils 10 Minuten) mit 300 ul IF-Puffer bei Raumtemperatur auf einer Schüttelplattform. Entfernen Sie den IF-Puffer undhinzufügen von 300 & mgr; l des sekundären Antikörpers (Ziege-anti-Kaninchen- oder anti-Maus-IgG [H + L]) mit einem Fluorochrom konjugiert, verdünnt 1: 500 in Blocking-Puffer IF. Inkubieren für 2 Stunden bei RT auf einem Schütteltisch. Entfernen der sekundäre Antikörper und Inkubation in 300 ul IF-Puffer für 10 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die ZF-Puffer und wasche 3 x 10 min in 300 & mgr; l PBS + bei Raumtemperatur. Fix und ein zweites Mal zu löschen, wie oben beschrieben (Schritte 2.3.1.2 und 2.3.1.3). Montieren Sie gefärbten rBM Gele in Eindeckmedien und zu analysieren, um die Bildung von dichten Bündeln von Hauptkomponenten unter Verwendung von Epifluoreszenz oder konfokalen Mikroskopie. Hinweis: Weitere Informationen zur Analyse von 3D – acini Kulturen durch Immunofluoreszenz siehe Referenz 6 und für epifluoreszenten und konfokale Mikroskopie von 3D acini siehe Referenz 14. rheologische Analyse Führen Sie rheometric Analyse von GLA behandelt und steuern rBM Gele ihre v zu messeniscoelasticity (Steifigkeit). Richten Sie rBM Gele, die 1 mm dick in eine runde Form mit einem Durchmesser von 8 mm sind. Um dies zu tun, legen Sie einen Klonens Ring (8 mm Durchmesser) in einer Vertiefung einer 24-Well-Kulturplatte und fügen Sie BM Matrix-Lösung hergestellt, wie 1,3-1,6 in den Schritten beschrieben. Hinweis: Für eine genaue Wiederholung der rBM Gele für die Experimente verwendet, die rBM Gele für rheometric Analyse vorbereitet müssen die gleiche Fläche und Dicke wie die rBM Gele in den 8-Well-Kammern eingerichtet zu haben. Die rBM Gele in Abbildung 3 analysiert waren 1 mm dick und 8 mm im Durchmesser. Behandeln Sie die rBM Gele in den Klonierungsringe mit PBS, GLA für 6 Stunden und GLA für 14 Stunden eingestellt, wie oben (Schritte 1,8-1,11) beschrieben. Messung des Elastizitätsmoduls (E) der 8 mm Durchmesser rBM Gele auf einem Rheometer mit einer 8 mm-Parallelplattengeometrie gezähnt, über einen Bereich von 1-3% Dehnung, bei einer festen Frequenz Schwingung von 1 Hz und einer Temperatur von 21 ° C. Weitere Einzelheiten über dierheometric Analyse von ECM Gele siehe Referenzen Referenz 13,15,16 sehen. Hinweis: E wird aus dem resultierenden Scherspeichermodul (G ') durch die Verwendung der folgenden Gleichung E = 2 * G * bestimmt (1 + v) , wobei v das Verhältnis von 0,5 , der Poisson ist, wie 13,15 in Referenz , 16. 3. Kultur und den Umgang mit der Linie Normale PEC, RWPE-1 Wachsen RWPE-1-Zellen in Keratinozyten serumfreien Medien (KSFM) supplementiert mit 5 ng / ml epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), 50 ug / ml Rinder-Hypophysenextrakt (BPE) und 50 U / ml Penicillin mit 50 ug / ml Streptomycin ( Ergänzen KSFM). Hinweis: Um die Induktion von epithelialen zu mesenchymalen vermeiden (EMT) -ähnlichen Übergang nicht RWPE-1-Zellen zu Serum aus. Lassen Sie komplette KSFM RT kommen für 30 Minuten nach der von der Lagerung bei 4 ° C zu entfernen und nicht warm in einem 37 ° C Wasserbad, da dies die EGF und BPE inaktivieren. Saugen Sie das kompletteKSFM von einer konfluenten 10 cm 2 – Platte von RWPE-1 – Zellen, Spülen mit 5 ml vorgewärmtes PBS und 5 ml 0,05% v / v Trypsin sicherzustellen , dass alle Zellen , die mit der Lösung bedeckt sind. Platzieren der Zellen in einem Gewebekultur – Inkubator eingestellt bei Standardbedingungen von 37 ° C und 5% CO 2 (mit Befeuchtung) für 5 bis 10 min. Überprüfen Sie das Ausmaß der Trypsinisierung nach 5 min und vorsichtig auf die Kulturplatte tippen, um die Zellen zu lösen. Anmerkung: RWPE-1-Zellen tolerieren keine lange Zeiträume Trypsinisierung so ist es ratsam, nicht mehr als zwei Platten zur gleichen Zeit zu handhaben. Es ist auch wichtig, dass alle Zellen von der Platte zu dissoziieren klonalen Selektion zu vermeiden. Wenn alle RWPE-1-Zellen dissoziiert wurden, mit 5 ml warmem PBS mit 2% v / v fötales Kälberserum (FCS), um das Trypsin zu quenchen. Pipette vorsichtig nach oben und unten die Zellaggregate zu brechen, bevor die Zellen in ein Zentrifugenröhrchen übertragen. Zentrifugieren Sie die distanzierte Zellen bei 125-150 xg für 5 min bei 25 ° C, der Überstand verworfen und erneut zu suspendieren, das Pellet der Zellen in 5 ml komplettem KSFM bis eine Suspension von Einzelzellen erhalten. 1 ml der resuspendierten Zellen in ein neues Röhrchen und fügen 9 ml komplettem KSFM die Zellen bei einer 1 zu propagieren: für nachfolgende experimentelle Verwendung 5 Passage Verdünnung. Zählen Sie die restlichen Zellen mit einer Zählkammer zum Einrichten acini (siehe Abschnitt 5.1). Hinweis: Nicht Kultur RWPE-1 – Zellen für mehr als 10 Passagen seit nach längerer Perioden der Kultur , die sie bilden keine acini mit der richtigen Architektur. Ändern Sie den Kulturmedien alle 48 Stunden die EGF und BPE aktiv bleiben, um sicherzustellen. Hinweis: Dieses Medium-Änderung für alle Behandlungen, die über 48 Stunden verlängern. 4. Kultur und den Umgang mit der BPH-Zelllinie, BPH-1 Kultur BPH-1-Zellen in RPMI 1640-Medium mit 5% v / v FCS ergänzt, 50 U / ml Penicillin und 50 ug / ml Streptomycin. Warm dasKulturmedien, PBS und 0,25% w / v Trypsin-0,53 M EDTA-Lösung auf 37 ° C vor dem Gebrauch. Anmerkung: Die Zellen können auch mit 2,5% v / v FCS 8 in Medien kultiviert werden. Saugen Sie das Kulturmedien von einer konfluenten 10 cm 2 – Platte von BPH-1 – Zellen und die Zellen werden 2 x mit 3 ml PBS mit Serum alle Spuren von Kulturmedien zu entfernen, um das Trypsin Reaktion auslöschen kann. Saugen Sie das PBS und 3 ml Trypsin-EDTA-Lösung, die Zellen zu decken. Die Platte wird in einem Inkubator eingestellt bei 37 ° C und 5% CO 2 (mit Befeuchtung) für 5 min. Entfernen Sie die Trypsin-EDTA-Lösung, wenn die Zellen rund, sondern bleiben an der Schale befestigt ist. Wasche die Zellen mit 5 ml PBS. Nach dem Entfernen des PBS, 5 ml Kulturmedien hinzufügen und Pipette nach oben sanft und unten eine Suspension von einzelnen Zellen zu erzeugen. Übertragen Sie die Zellen in ein 15-ml-Tube. Nehmen Sie 2 ml der Zellsuspension in ein neues Zentrifugenröhrchen mit 8 ml komplettem Medium und die Platte die BPH-1-Zellen ONTo 10 cm 2 Kulturplatte bei einer 1: 5 Verdünnung Durchgang für die nachfolgende experimentelle Verwendung. Zählen Sie die restlichen Zellen mit einer Zählkammer zum Einrichten acini (siehe Abschnitt 5.2). Hinweis: Halten Sie eine Aufzeichnung der Passage-Nummer, wie ältere BPH-1-Zellen nicht acini mit einer richtigen Architektur bilden. Eine Durchgangszahl mehr als 10 ist nicht erwünscht. Ändern Sie den Kulturmedien alle 72 Stunden. 5. 3D-Kultur von Prostata Acini auf Einheimische und Stiff rBM Wenn RWPE-1-Zellen verwendet werden Acini zu bilden, verdünnte 5,000 in Schritt 3.5 in 300 ul vollständiges KSFM hergestellt Zellen ergänzt mit 2% v / v von BM-Lösung. Wenn BPH-1-Zellen verwendet werden Acini zu bilden, verdünnte 2,500 Zellen hergestellt in Schritt 4.5 in 300 ul RPMI 1640-Kulturmedium mit 2% v / v von BM-Lösung ergänzt. Anmerkung: BPH-1-Zellen sind größer als RWPE-1-Zellen so geringer Anzahlen von BPH-1-Zellen verwendet werden, eine ähnliche Verteilung der Acini nach 6 Tagen cul zu erhaltentur. Die Zellen vorsichtig auf die nativen und AGE-versteifte Samen rBM und sorgfältig die Kulturen in einem Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 (mit Befeuchtung) gesetzt legen eine gleichmäßige Verteilung der wachsenden acini in den Brunnen und dass jede Zelle sich teilt , um sicherzustellen , ein acina zu erzeugen. Alle 2 Tage ersetzt das Kulturmedium mit frischem Kulturmedium, enthaltend 2% v / v BM-Lösung, um sicherzustellen, dass Zellen die Wachstumsfaktoren für normale acina erforderlich Homöostase. Überwachen Sie acinar Morphologie in wachsenden Kulturen mit Hellfeldmikroskopie 13. Anmerkung: Nach 3 Tagen in Kultur einzelner Zellen einen Cluster von> 3 Zellen bilden und nach 1 Woche Prostata Acini mit einem Durchmesser von ~ 50 & mgr; m wird beobachtet werden. Protokoll folgen in 2.3 beschriebenen Immunofluoreszenz auszuführen Antikörper , die für Marker der Zell-Matrix – Adhäsion, Zell-Zell – Adhäsionen, apikal-basal Polarität und Invasivität 13 verwendet wird . <li> Eine Montage Medien mit 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), oder einen zusätzlichen Schritt (nach 2.3.12) Verwenden Sie Zellkerne von 5 min mit DAPI Inkubation und Waschen 2 x 5 min mit PBS + zu färben. 6. 3D-Kultur von Prostata-Tumor-Zellaggregate auf Einheimische und Stiff rBM Kultur PC3-Zellen in RPMI 1640-Medium, enthaltend 10% v / v FCS und 50 U / ml Penicillin mit 50 ug / ml Streptomycin. Erwärmen Sie den Kulturmedien, PBS und 0,25% w / v Trypsin-0,53 M EDTA-Lösung auf 37 ° C vor dem Gebrauch. Saugen Sie das Kulturmedien von einer konfluenten 10 cm 2 Kulturschale von PC3 – Zellen und waschen Sie die Zellen mit 3 ml PBS 2x alle Spuren von FCS zu entfernen, um das Trypsin Reaktion löschen kann. Saugen Sie das PBS und 3 ml Trypsin-EDTA-Lösung, die Zellen zu bedecken und für 1 min inkubiert. Wenn sich die Zellen abgerundet, sondern bleiben an der Schale befestigt ist, vorsichtig die Trypsin-EDTA-Lösung ansaugen und wäscht mit 3 ml PBSEntfernen Sie alle Spuren von Trypsin. Nach dem Entfernen des PBS, 5 ml Kulturmedien hinzufügen und Pipette nach oben sanft und unten eine Suspension von einzelnen Zellen zu erzeugen. Übertragen Sie die Zellen in ein 15-ml-Tube. Nimm 1 ml der Zellsuspension PC3 in ein neues Zentrifugenröhrchen eingewogen und 9 ml Kulturmedium. Platte , die Zellen auf einer 10 cm 2 Kulturschale (1:10 Verdünnung) für nachfolgende experimentelle Verwendung. Zählen Sie die restlichen Zellen mit einer Zählkammer. Verdünnte 2,500 PC3-Zellen hergestellt in Schritt 6.6 in 300 ul RPMI 1640-Kulturmedium mit 2% v / v von BM-Lösung ergänzt für die Bildung eines Gradienten-Gel in der Kultur zu erlauben. Samen die Zellen vorsichtig auf die nativen und AGE-versteifte rBM und legen Sie sorgfältig die Kultur in den Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2 (mit Befeuchtung) eingestellt gleichmäßige Verteilung des wachsenden Sphäroiden in den Brunnen zu gewährleisten. Ändern Sie den Kulturmedien alle 72 Stunden. Zur Untersuchung der Wirkung von steifen (AGE-reichen) rBMauf Prostata – Tumorzellmigration, Bild PC3 Zellen Hell- Video Zeitraffer-Mikroskopie Temperatur / CO 2 -Regelung und eine befeuchtete Kammer 17 verwendet wird . Hinweis: PC3-Zellen in Stränge auf nativen rBM wachsen und nicht mit einem Lumen Acini bilden, aber wenn links mehr als 72 Stunden auf nativen rBM wachsen wird sie 3D-Sphäroiden bilden. Im Anschluss an die Datenerfassung, PC3 Zellen manuell verfolgen und ihre Wanderungsgeschwindigkeit zu berechnen, Form (Dehnungsverhältnis) und die Persistenz der Migration 17-19. Hinweis: Persistenz = Verhältnis D / T, D = Abstand vom Anfang bis zum Ende der Zelle Bahn, T = Gesamtlänge der Zelle Bahn.