前立腺癌および他の年齢に関連した病状または代謝疾患における生物物理トリガーとして基底膜剛性を研究する方法

GLA処理によって誘導BM剛性の1誘導（非酵素的架橋） バイアルの内容物は、液体（8-16時間）になるまで4℃（低温室または冷蔵庫に氷の上に立って）でインキュベートすることによりBMマトリックスの凍結バイアル（10ml）に解凍します。 注意：低温室/冷蔵庫を使用しない場合は、氷で全体のボトルをカバーしています。これは、固化からBMの原液を防ぐことができます。 将来の実験のためにと繰り返し凍結融解を避けるために、BM行列の各新たな10ミリリットルバイアルから25×0.4ミリリットルのアリコートを準備します。メーカーによって示される有効期限まで-80℃で保存バイアル。必要なときに、2時間氷上に放置4℃でバイアルを解凍します。 氷の均一な表面を準備します。コー​​ティング手順中に4°Cの温度を維持するために氷の上に8ウェルチャンバースライドガラスを置きます。 4℃でBMマトリックスのバイアルを解凍します。 注：BM行列の1 0.4 mL瓶のはCOAに十分です全体の1×8ウェルチャンバースライドトン。固化からBMマトリックスを防止するために、処理中に氷に覆われたバイアルを保管してください。 はさみを使用して、200μlのピペットチップの分配端をカット。 4℃に平滑末端200μlのピペットチップを冷却し、200μlの容量ピペットエイドにそれを上に置きます。ピペットチップに冷たいBMマトリックス溶液40μlを取り、チルド8ウェルチャンバースライドガラス上のウェルにそれを転送します。 注：BM溶液40μlを0.8 cm 2の面積をカバーするのに十分です。 BM液の凝固を避けるために、コーティング手順中に冷やしたピペットのヒントを参考にしてください。 BMマトリックス溶液に気泡を導入し、ウェルは均等にエッジで見えるメニスカスを形成せずにコーティングされていることを確認しないでください。 必要なウェルおよびチャンバの数に応じて手順を繰り返し1.4。 塗布後、重合を促進するために30分間37℃で8ウェルチャンバースライドを配置BMの。液体RBMの不要な妨害を避けるために非常に慎重にインキュベーターのドアを閉じます。 RBMゲルの脱水を避けるために、30分間のインキュベーション時間を超えないようにしてください。 注：得られたゲルは、ネイティブの再構成BM（RBM）です。 37℃のインキュベーション工程を、5％のCO 2を必要としません 。しかし、便宜のために37℃、5％CO 2（加湿付き）に設定し、組織培養インキュベーター中でこの手順を実行します。 0.2 Mリン酸バッファー（pH 7.8）で希釈した50ミリモルのグリコールアルデヒド（GLA）を準備します。 50mLの注射器を使用して、0.22ミクロンのシリンジフィルターに通すことにより溶液を滅菌します。 50 mMのGLAの最終容量250μlで架橋反応のために、0.5 Mシアノ水素化ホウ素ナトリウムまたは100mMのGLA（2×ストック）の125μlの0.2 Mリン酸緩衝液100μl（pHは7.8から2.5 Mアミノグアニジンの25μlを添加します）。 50mLの注射器を使用して、0.22ミクロンのシリンジフィルターに通してストック溶液を滅菌します。 注意：ドラフト内で作業中に白衣、手袋、フェイスシールドおよび呼吸器を着用してシアノ水素化ホウ素ナトリウムを処理します。 重合RBMゲルをカバーし、硬いRBMゲルを製造するための半堅いRBMゲルまたは14時間を生成するために6時間、37℃でインキュベートしGLA溶液を250μlのを追加します。 注：GLAの量は、重合RBMゲルをカバーしなければならないし、それに応じて調整する必要があります追加しました。異なるGLAインキュベーション時間が使用される場合、RBMゲルは（ステップ2.4​​参照）RBM剛性における増加倍率を決定するために分析されるべきです。 37℃で14時間、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）250μlの中の天然RBMゲルをインキュベートすることによって負の制御を準備します。 50mMのシアノ水素化ホウ素ナトリウムまたは250mMのアミノグアニジンを添加することによって、架橋反応時のシッフ塩基またはアマドリ付加転位の形成が抑制されている2つの追加のコントロールを準備します。 1 Mグリシンeを準備しますPBSで希釈したthylエステル（GEE）。 50mLの注射器を使用して、0.22ミクロンのシリンジフィルターに通すことにより溶液を滅菌します。 指示されたインキュベーション時間の後、慎重にGLA液が制御ネイティブRBMゲルから制御RBMゲルおよびPBSから阻害剤を含有する、架橋R​​BMゲルからGLA溶液を除去。 RBMゲルのすべてにGEE液の250μLを加え、37℃で1時間インキュベートします。 注：このステップでは、架橋反応をクエンチ。 GLAとGEEのすべての痕跡を除去するために、500μlのPBS中のすべてのRBMゲルを10回洗浄します。彼らの脱水を防ぐために、PBS400μlの中で37℃で一晩RBMゲルをインキュベートします。 AGEの蓄積、非酵素的架橋および粘弾性特性（ステップ2.1から2.4）のためのRBMゲルを分析します。その粘弾性特性の流動度測定分析のためにクローニングリング（ステップ2.4​​）にRBMゲルを準備します。 細胞培養のために、RBMゲルを500μlの文化で2回すすぐ私細胞を播種する前に、DIAは（ステップ5および6）。ゲル表面に触れるピペットチップなしで静かに洗浄液を実行します。 非酵素的架橋及びRBMの剛性の2定量GLAで処理しました光分析 GLA処置におけるAGEの蓄積を​​測定し、メイラード反応の程度を決定するための測光分析を用いRBMゲルを制御します。 ステップ1.11の後、8ウェルチャンバースライドにRBMゲルからPBSを除去し、250μlの氷冷蒸留水を追加します。行列が完全に液化されることを確実にするために16から24時間、4℃でインキュベートします。 注意：この溶液中のRBMペプチドは、自動蛍光特性とのAGEsが含まれています。 1.5mlチューブに液化BM液を移し、分光光度計（励起波長= 370nmで、発光波長= 440 nm）を用いて溶液の蛍光発光を測定します。 臭化シアンペプチドのSDS-PAGE分析 GLA架橋及びマクロ繊維の形成を誘導したことを確認するために、ポリアクリルアミドゲル上でGLA処理および制御RBMゲルを解決します。 室温で5分間万×gでステップ2.1.1.2で収集液化BM液を遠心。 アセトニトリルで希釈した臭化シアンの2グラム/ mlを含むストック溶液を準備します。 注意：白衣、手袋、フェイスシールドや人工呼吸器を装着したまま、必ずドラフト内で臭化シアンを処理します。 上清を除去し、20 mg / mlと臭化シアン+ 70％v / vギ酸500μlの中でBMゲルペレットを再懸濁し、室温で一晩インキュベートします。 3.5 kDaの分子量カットオフ透析カセットに再懸濁BMゲルペレットを転送するために1ミリリットル使い捨て注射器を使用してください。 500二重蒸留水mlおよび磁気撹拌棒を含む500mlガラスビーカー中にカセットを水没。マグネチックスターラー上にこれを置き、臭化シアンとギ酸のすべての痕跡を除去するために4℃（低温室で）で一晩（16時間）透析。 1.5mlチューブにカセットから透析BMソリューションを転送するために1ミリリットル使い捨て注射器を使用してください。 12％（v / v）のポリアクリルアミドゲル10,11上の各BMサンプルの25μlのを分析。 SDS-PAGEに続いて、臭化シアンマトリクスペプチド13の電気泳動パターンを可視化するために、ポリアクリルアミドゲル12の銀染色を行います。 免疫蛍光顕微鏡分析処理されたGLAの免疫蛍光染色を行い、抗AGE /ペントシジンでRBMゲルを制御し、架橋RBMに蓄積されたAGEとコラーゲンIV /ラミニン繊維構造的再編成を可視化するために、共焦点顕微鏡に続く抗コラーゲンIVおよび抗ラミニン抗体は、13をゲル化します。 注：常にentiをカバーするのに十分なボリュームを使用ピペットチップでRBM表面に触れることなくインキュベーションおよび洗浄の間にRBMゲルを再度。免疫蛍光法によって3D腺房文化を分析の詳細については文献6を参照してくださいと3D腺房の共焦点顕微鏡観察のための基準14を参照してください。 洗浄GLAはPBS +300μlの室温で5分間（PBS、0.1ミリモルのCaCl 2および0.5mMのMgCl 2を含む）で8ウェルチャンバースライド中で2回処理し、制御RBMゲル。 PBS +は、各RBMゲルをカバーするために、PBS +で希釈したVパラホルムアルデヒド（PFA）/ wの4％の300μLを追加、削除。 RBMのコンポーネントを修正するために室温で30分間インキュベートします。 PFA液w / vの4％を削除します。 75mMのNH 4 Clで+ 0.5のMgCl 2溶液を300μlを追加するには、[追加と固定をクエンチする（5回繰り返す）、室温で5分間インキュベートします。 滅菌水に以下の解決策を行うことで、免疫蛍光バッファ（バッファIF）を準備：130のNaCl、7mMののNa 2 HPO 4、3.5 mMののNaH2 PO 4、7.7ミリモルのNaN 3、0.1％w / vのウシ血清アルブミン、0.5％v / vのポリエチレングリコールtert-ブチルオクチルフェニルエーテルおよび0.05％（v / v）のポリエチレングリコールソルビタンモノラウレート。 20％（v / v）のヤギ血清でバッファIF補完することにより、ブロッキング緩衝液IF準備します。 急冷溶液を除去し、非特異的な反応を防止するためにRBMゲルにブロッキング緩衝液IFの300μlを添加します。振盪台上で、室温で2時間インキュベートします。 IFブロッキングバッファーを削除し、ブロッキング緩衝液IFに希釈した一次抗体の300μlで4℃で16時間、RBMゲルをインキュベート（1：500マウス抗ペントシジンモノクローナル抗体; 1/250ウサギ抗コラーゲンIV pAbを、1 / 250ウサギ抗ラミニンA / C PAB）。 注：より長い20時間のインキュベーションを4℃でRBMを液状化することができます。 一次抗体を除去し、振盪台上で室温でIFバッファの300μlで3回（各10分）を洗浄します。 IFバッファを削除し、ブロッキング緩衝液IFに500：1に希釈した蛍光色素と結合した二次抗体を300μl（ヤギ抗ウサギまたは抗マウスIgG [H + L]）を追加します。振盪台上で、室温で2時間インキュベートします。 二次抗体を除去し、室温で10分間、IFバッファの300μl中インキュベートします。 IFバッファを削除し、室温でPBS +300μlの中で3×10分を洗います。 （ステップ2.3.1.2と2.3.1.3）上述したように、第二の時間を修正してクエンチしました。 マウントはマウントメディアにRBMゲルを染色し、落​​射蛍光または共焦点顕微鏡を用いて、主要なコンポーネントの密な束の形成を分析します。 注：免疫蛍光法によって3D腺房文化を分析の詳細は文献6を参照してくださいと3D腺房の落射蛍光と共焦点顕微鏡のためのリファレンス14を参照してください。 レオロジー解析処理されたGLAの流動度測定分析を行い、それらのVを測定するために、RBMゲルを制御iscoelasticity（剛性）。 直径8mmの円形の金型で、厚さ1ミリメートルであるRBMゲルを設定します。これを行うには、24ウェル培養プレートのウェル内部にクローニングリング（直径8mm）を配置し、工程1.3-1.6に記載されるように調製BMマトリックス溶液を追加します。 注：実験に使用しRBMゲルの正確な要約については、流動度測定分析のために調製RBMゲルは、8ウェルチャンバーで設定RBMゲルと同じ面積と厚さを持っている必要があります。 図3で分析RBMゲルは、厚さ1ミリメートル、直径8ミリメートルでした。 （ステップ1.11から1.8）上記のように14時間、6時間、PBS、GLAおよびGLAとクローニングリングで設定RBMゲルを扱います。 固定周波数は1Hzの振動および21℃の温度で1〜3％のひずみの範囲にわたって、8ミリメートル平行板鋸歯状の形状を有するレオメーター上で直径8mm RBMゲルの弾性率（E）を測定します。詳細情報についてはECMゲルの流動度測定分析は、参考文献は、参照13,15,16を参照してくださいを参照してください。 注：Eが得られた剪断貯蔵弾性率（G '）から決定され、以下の式E = 2 * Gの使用を介して「*参照13,15に記載のように（1 + V）は、0.5のポアソン比であります、16。 3.文化とノーマルPECラインの取り扱い、RWPE-1 成長RWPE-1は5ng / mlの上皮成長因子（EGF）を補充したケラチノサイト無血清培地中の細胞（KSFM）、50μg/ mlのウシ下垂体抽出物（BPE）および50μg/ mlストレプトマイシンと50 U / mlのペニシリン（ KSFM）を完成。 注：上皮 – 間葉の誘導を避けるために（EMT）様の移行は、血清にRWPE-1細胞が公開されていません。完全KSFMを4℃で貯蔵から除去した後、30分間室温に到達することを可能にし、これはEGFおよびBPEを不活性化するように37℃の水浴中で暖かくありません。 完全を吸引RWPE-1細胞のコンフルエント10cm 2のプレートからのKSFMは、予め加温したPBS 5mlで洗浄し、全ての細胞が溶液で覆われていることを確実に0.05％（v / v）のトリプシンの5ミリリットルを追加します。 5〜10分間、37℃、5％CO 2（加湿有する）の標準条件に設定し、組織培養インキュベーター中に細胞を置きます。 5分後にトリプシン処理の程度を確認し、静かに細胞を剥離するために培養プレートをタップします。 注：同時に二つ以上のプレートを処理しないことをお勧めされているので、RWPE-1細胞はトリプシン処理の長い期間を許容しません。クローン選択を避けるために、プレートから全ての細胞を分離することも重要です。 すべてRWPE-1細胞が解離したときに、トリプシンをクエンチし、2％v / vのウシ胎児血清（FCS）を含む暖かいPBSを5mlを加えます。ゆっくり遠心管に細胞を転送する前に、細胞凝集物を破壊するために上下にピペットと。 x 125から150で解離した細胞を遠心25℃で5分間gを、上清を廃棄し、単一細胞の懸濁液が得られるまで完全KSFM 5ml中の細胞ペレットを再懸濁します。 転送1新しいチューブに再懸濁した細胞のミリリットルと1で細胞を増殖させるために、完全KSFMの9ミリリットルを追加します。その後の実験的な使用のための5通路希釈。腺房を設定するための血球計数器を用いて細胞の残りの部分をカウント（5.1節を参照してください）​​。 注意：文化の後に長期間以来、10以上の継代のためにしないでください文化RWPE-1細胞は、彼らが正しいアーキテクチャとの房を形成しません。 培養培地にEGFおよびBPEはアクティブなまま確保するために48時間ごとに変更します。 注：48時間を超えて延びる任意の治療のために、この培地交換を含めます。 4.文化とBPH細胞株の取り扱い、BPH-1 RPMI中で培養BPH-1細胞は1640培地は、50 U / mlのペニシリンおよび50μg/ mlストレプトマイシン、5％v / vのFCSで補完します。ウォーム培養培地、PBSおよび使用前に37°Cまでのw / vのトリプシン0.53 M EDTA溶液0.25％。 注：細胞はまた、2.5％v / vのFCS 8を培地で培養することができます。 BPH-1細胞のコンフルエントな10cm 2のプレートから培地を吸引し、トリプシン反応を停止することができる血清を含む培養培地の全ての痕跡を除去するためにPBS 3mlで細胞を2回洗浄します。 PBSを吸引し、細胞をカバーするために、トリプシン-EDTA溶液3mlを加えます。 5分間37℃、5％CO 2（加湿付き）に設定したインキュベーターでプレートを置きます。細胞は丸いですが、皿に付着したままときに、トリプシン-EDTA溶液を除去します。 5mlのPBSで細胞を洗浄。 PBSを除去した後、培地を5 mlを加え、穏やかにピペッティングアップ及びダウン単一細胞の懸濁液を生成します。 15ミリリットルチューブに細胞を移します。 完全培地を8 mlの新たな遠心管に細胞懸濁液を2mlを取り、BPH-1細胞をプレートONTその後の実験的使用のための5の通路希釈：1でのOA 10cm 2の培養プレート。腺房を設定するための血球計数器を用いて細胞の残りの部分をカウント（5.2節を参照してください）​​。 注意：古いBPH-1細胞は、適切なアーキテクチャを備えた腺房を形成しないように、通路数の記録を保管してください。継代数10以上が望まれていません。 培地ごとに72時間を変更します。 ネイティブとスティッフRBMに前立腺腺腺房5. 3D文化 RWPE-1細胞は、腺房を形成するために使用されている場合、完全KSFM300μlのステップ3.5で調製した希釈5,000細胞はBM溶液の2％v / vで補充しました。 BPH-1細胞は、腺房を形成するために使用されている場合、BM溶液の2％v / vで補充したRPMI1640培地300μlのステップ4.5で調製した2,500の細胞を希釈します。 注：BPH-1細胞は、CULの6日後に腺房の同様の分布を得るために使用されるBPH-1細胞のように少ない数RWPE-1細胞よりも大きいですチャー。 ゆっくり37℃、5％CO 2で設定したインキュベーター中で培養液を置き、慎重にネイティブとAGE-補剛RBM上に細胞を播種すると（加湿で）ウェル中の各細胞が分裂その成長腺房の均一な分布を確実にするために1 acinaを生成します。 2日毎に、細胞は、増殖因子が正常acinaのために必要とされていることを確実にするために、2％（v / v）のBM溶液を含有する新鮮な培地で培地を交換し 恒常性。 明視野顕微鏡13を使用して増殖する培養物中の腺房形態を監視します。 注：培養3日後、個々の細胞が> 3細胞のクラスターを形成し、〜50μmの直径を持つ1週間の前立腺腺房が観察された後になります。 細胞-マトリックス接着、細胞-細胞接着、apico -基底極性および侵襲性13のマーカーに特異的な抗体を用いて免疫蛍光を行うために2.3に記載のプロトコルに従ってください。 <li> 5分間DAPIでインキュベートすることにより細胞核を染色し、PBS +で2×5分間洗浄するために4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）で取り付けメディアを使用するか（2.3.12後に）余分なステップを含みます。 ネイティブとスティッフRBM 6. 3D文化前立腺の腫瘍細胞集合体 50μg/ mlのストレプトマイシン、10％v / vのFCS及び50U / mlペニシリンを含有するRPMI 1640培地中で培養PC3細胞。使用前に37℃に、培養培地、PBS及び0.25％W / Vトリプシン0.53 M EDTA溶液を温めます。 PC3細胞のコンフルエントな10cm 2の培養皿から培地を吸引し、細胞をトリプシン化反応を停止することができるFCSのすべての痕跡を除去するためにPBSを3mlで2回洗浄します。 PBSを吸引し、細胞をカバーし、1分間インキュベートし、トリプシン-EDTA溶液3mlを加えます。 細胞は丸くなるが、慎重にトリプシン-EDTA溶液を吸引し、PBSの3ミリリットルを洗浄、皿に付着したままときトリプシンの痕跡をすべて削除します。 PBSを除去した後、培地を5 mlを加え、穏やかにピペッティングアップ及びダウン単一細胞の懸濁液を生成します。 15ミリリットルチューブに細胞を移します。 新しい遠心管にPC3細胞懸濁液の1ミリリットルを取り、培養培地の9ミリリットルを追加します。その後の実験的な使用のために10cm 2の培養皿（1:10希釈）上に細胞をプレー。血球計数器を使用して、残りの細胞を数えます。 培養の勾配ゲルの形成を可能にするために、BM溶液の2％v / vで補充したRPMI1640培地300μlのステップ6.6で調製した2,500 PC3細胞を希釈します。 静かにネイティブとAGE-補剛RBM上に細胞を播種すると、慎重に十分に成長しているスフェロイドの均一な分布を確実にするために37°Cと（加湿付き）、5％CO 2に設定したインキュベーターに文化を置きます。 培地ごとに72時間を変更します。 堅い（AGE-リッチ）RBMの効果を研究するために、温度/ CO 2制御と加湿チャンバー17を用いて明視野ビデオタイムラプス顕微鏡を用いて前立腺腫瘍細胞の遊走、画像PC3細胞上。 注：PC3細胞は、ネイティブRBM上のストランドに成長し、内腔と腺房を形成しないが、ネイティブRBMに超える72時間を増殖させた場合、彼らは3Dスフェロイドを形成することになります。 データ収集に続いて、手動でPC3細胞を追跡し、その移動速度、形状（伸び率）と移行17-19の永続性を計算します。 注：細胞軌道の持続性=比D / T、D =開始からの細胞軌道の端までの距離、T =全長。