How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Mercedes Rodriguez-Teja; Claudia Breit; Mitchell Clarke; Kamil Talar; Kai Wang; Mohammad A. Mohammad; Sage Pickwell; Guillermina Etchandy; Graeme J. Stasiuk; Justin Sturge

doi:10.3791/54230

JoVE Journal > Cancer Research

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Cancer Research

איך ללמוד מרתף ממברנה נוקשות כמפעיל Biophysical הערמונית סרטן ומחלות גיל הקשורות אחרים או מחלות מטבוליות

Published: September 20, 2016

doi:

10.3791/54230

Mercedes Rodriguez-Teja¹, Claudia Breit², Mitchell Clarke³, Kamil Talar³, Kai Wang³, Mohammad A. Mohammad³, Sage Pickwell³, Guillermina Etchandy¹, Graeme J. Stasiuk³, Justin Sturge³

¹Departamento de Genética, Facultad de Medicina,Universidad de la República (UDELAR), ²Department of Mechanistic Cell Biology,Max Planck Institute of Molecular Physiology, ³School of Biological, Biomedical & Environmental Sciences,University of Hull

Summary

נסביר פרוטוקול למידול במיקרו-סביבה של biophysical שבו crosslinking וקשיחות מוגברת של קרום במרתף (BM) הנגרמת על ידי endproducts גליקציה מתקדמים (גילאי) יש רלוונטיות פתולוגי.

Abstract

כאן אנו מתארים פרוטוקול שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד את המיקרו-סביבה biophysical הקשורים עובי מוגבר ונוקשות של קרום במרתף (BM) במהלך פתולוגיות הקשורות לגיל והפרעות מטבוליות (סרטן למשל, סוכרת, מחלות כלי הדם, רטינופתיה, נפרופתיה ונוירופתיה) . הנחת היסוד של המודל היא crosslinking אנזימטית של מחדש BM (RBM) מטריקס על ידי טיפול עם glycolaldehyde (GLA) לקדם endproduct גליקציה מתקדמים (AGE) דור דרך התגובה Maillard. דוגמאות של טכניקות מעבדה שניתן להשתמש בהם כדי לאשר דור גיל, crosslinking אנזימטית והגדילה נוקשות GLA מטופלים RBM מתוארים. אלה כוללים הכנת יליד RBM (שטופל פוספט שנאגר מלוח, PBS) RBM הנוקשה (שטופל GLA) לקביעה: תוכן AGE שלה על ידי ניתוח photometric מיקרוסקופיה immunofluorescent, crosslinking אנזימטית על ידי polyacrylamide סולפט dodecyl נתרןג'ל אלקטרופורזה (עמוד SDS) וכן במיקרוסקופ confocal, ו rheometry באמצעות קשיחות מוגברת שלה. ההליך המתואר כאן ניתן להשתמש כדי להגדיל את הקשיחות (moduli אלסטי, E) של RBM עד 3.2 פי, עולה בקנה אחד עם מדידות שנעשו בריא לעומת רקמת ערמונית אדם חולה. כדי לשחזר את המיקרו-סביבת biophysical הקשורים להזדקנות וערמונית חולה בלוטת שלושה סוגי תאי ערמונית הוכנסו על RBM יליד והנוקשה RBM: RWPE-1, תאי אפיתל ערמונית (פץ) נגזר בלוטת ערמונית נורמלית; BPH-1, פץ נגזר בלוטת הערמונית מושפעים היפרפלזיה שפירה של הערמונית (BPH); ו PC3, תאים גרורתי נגזרים סרטן עצמות משני שמקורם בסרטן הערמונית. פרמטרים מרובים ניתן למדוד, כולל הגודל, הצורה והמאפיינים פולשנית של acini 3D הבלוטות נוצר על ידי RWPE-1 ו BPH-1 בנוגע ליישום מקורי בניגוד RBM נוקשה, ואורך התא הממוצע, מהירות הנדידה והתמדה של תנועת התא של 3D spherOIDs נוצר על ידי תאי PC3 באותם תנאים. Cell מסלולי איתות ואת לוקליזציה subcellular של חלבונים ניתן להעריך גם.

Introduction

The basement membrane (BM) is a sheet of specialized extracellular matrix (ECM) that maintains stable tissue borders by separating layers of epithelial cells from the stroma¹. Covalent crosslinking between adjacent triple helices of collagen IV in the BM stabilizes their lateral association by establishing an irregular network of super-twisted helices². These collagen IV lattices act as a scaffold for its interaction with laminin and other BM components¹. The structural arrangement of the BM provides it with the mechanical strength and rigidity necessary for the normal development of glandular epithelia³.

During aging and disease the BM progressively thickens and stiffens^3,4. For example, a 3-fold increase in the elastic modulus (E) of the ocular BM occurs between the ages of 50 and 80 in the normal population, and this stiffening is further exacerbated in metabolic disorders like diabetes⁵. The structural and biomechanical changes in the BM that result in its increased stiffness occur when its ECM components, collagen IV and laminin, become non-enzymatically crosslinked following their exposure to advanced glycation endproducts (AGEs).

The purpose of the method described here was to establish a model for the investigation of how BM stiffness, due to AGE exposure, promotes prostate epithelial cell (PEC) and prostate tumour cell (PTC) invasiveness in the context of the switch to metastatic prostate cancer (PCa). To do this a previous method used for generating 3D glandular acini from mammary epithelial cells (MECs) in reconstituted rBM gels⁶ was adapted to include an additional step where the rBM gels are pre-treated with glycolaldehyde (GLA). Several techniques for assessing GLA induced crosslinking and stiffening of pre-treated rBM gels are described, including photometric analysis, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE), confocal microscopy and rheometric analysis. The prostate cell types selected for culture on the pre-stiffened rBM include: RWPE-1, PECs derived from a normal prostate gland⁷; BPH-1, PECs derived from a prostate gland affected by BPH⁸; and PC3, metastatic PTCs derived from a secondary tumor located in the vertebral bone of a prostate cancer (PCa) patient⁹.

In addition to advancing the study of prostate gland pathology, the protocol for stiffening of rBM gels by their treatment with GLA can be adapted to investigate how BM stiffness contributes to other age-related pathologies and metabolic disorders. For example, the model can be directly applied to investigate how metastatic cancer is induced by BM stiffness in organs such as the breast, colon, ovary and pancreas by the incorporation of appropriate cell types. Furthermore, the protocol can be adapted to investigate how stiff BM promotes biomechanical mechanisms of disease progression in diabetes-related microvascular disease, retinopathy, nephropathy and neuropathy.

Protocol

אינדוקציה 1. של BM נוקשות מושרה על ידי GLA טיפול (Non-האנזימטית Crosslinking) להפשיר בקבוקון קפוא של מטריקס בע"מ (10 מיליליטר) על ידי דוגר על 4 מעלות צלזיוס (עומד על קרח חדר או במקרר קר) עד שהנוזלים של הבקבוקון הפכו נוזל (8-16 שעות). זהירות: אם בחדר קר / מקרר אינו בשימוש, לכסות את הבקבוק השלם עם קרח. פעולה זו תמנע את פתרון המניות של BM לחיזוק. בניסויים עתידיים וכדי למנוע מחזורי ההפשרה להקפיא חזר, להכין 25 x 0.4 aliquots מ"ל מכל בקבוקון 10 מ"ל חדש של מטריקס בע"מ. חנות בקבוקונים ב -80 ° C עד לתאריך התפוגה המצוין על ידי היצרן. בעת הצורך, להפשיר בקבוקונים ב 4 ° C עומד על קרח במשך 2 שעות. כן גם משטח של קרח. הוסף שקופיות זכוכית קאמרית 8-גם על גבי הקרח כדי לשמור על טמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס במהלך הליך הציפוי. להפשיר בקבוקון של מטריקס בע"מ ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: One 0.4 מיליליטר בקבוקון של מטריקס בע"מ מספיק כדי COAt שקופית קאמרית 1 x 8-היטב כולו. שמור את הבקבוקון מכוסה בקרח בזמן הטיפול כדי למנוע את מטריקס בע"מ לחיזוק. לחתוך את הקצה מהחלק של קצה פיפטה 200 μl באמצעות מספריים. מצננים את טיפ 200 μl פיפטה בוטה הסתיים עד 4 מעלות צלזיוס ומניחים על אותו מכשיר pipetting קיבולת 200 μl. קח את 40 μl של הפתרון מטריקס בע"מ הקר אל הקצה פיפטה ולהעביר אותו לתוך באר בשקופית הזכוכית קאמרית 8-המקוררת היטב. הערה: 40 μl של פתרון BM הוא מספיק כדי לכסות שטח פנים של 0.8 ס"מ 2. טיפים ימשיכו פיפטה מקורר במהלך הליך הציפוי כדי למנוע התמצקות של הפתרון בע"מ. אין להכניס בועות אוויר לתוך התמיסה מטריקס בע"מ להבטיח הבאר מצופה באופן שווה ללא היווצרות של המניסקוס גלוי בקצוות. חזור על שלב 1.4 לפי מספר בארות ותא הנדרשות. לאחר ציפוי, במקום להחליק קאמרי 8-גם על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לקדם פילמורשל BM. סגור את דלת החממה בזהירות רבה כדי למנוע הפרעה רצויה של RBM הנוזלי. אין לעבור על זמן הדגירה 30 דקות כדי למנוע התייבשות של הג'ל RBM. הערה: ג'ל שמתקבל הוא BM מחדש הילידים (RBM). צעד דגירת 37 מעלות צלזיוס אינו מחייב 5% CO 2. עם זאת, מטעמי נוחות לבצע שלב זה חממה בתרבית רקמה נקבע על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 (עם humidification). הכן 50 מ"מ glycolaldehyde (GLA) מדולל 0.2 M חיץ פוספט (pH 7.8). לעקר את הפתרון על ידי סינונו דרך המסנן מזרק 0.22 מיקרון באמצעות מזרק 50 מ"ל. לקבלת תגובה crosslinking בנפח סופי של 250 μl של 50 מ"מ GLA, להוסיף 25 μl של 0.5 M cyanoborohydride נתרן או 2.5 M aminoguanidine 125 μl של 100 מ"מ GLA (2x המניות) ו -100 μl של 0.2 M חיץ פוספט (pH 7.8 ). לעקר את פתרונות המניות על ידי העברת אותם דרך פילטר מזרק 0.22 מיקרון באמצעות מזרק 50 מ"ל. זהירות: טפל cyanoborohydride נתרן ללבוש חלוק מעבדה, כפפות, faceshield הנשמה תוך כדי העבודה במנדף. הוסף 250 μl של פתרון GLA כדי לכסות את הג'ל RBM polymerized לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות כדי לייצר ג'ל RBM חצי נוקשה או 14 שעות כדי לייצר ג'ל RBM נוקשה. הערה: היקף GLA הוסיף חייבת לכסות את הג'ל RBM polymerized וצריך להיות בהתאם. אם פעמי דגירת GLA שונות משמשות, ג'לים RBM יש לנתח על מנת לקבוע את מתקפלת הגידול נוקש RBM (ראה שלב 2.4). כן בקרה שלילית על ידי דוגרי ג'ל יליד RBM ב 250 μl של בופר פוספט סטרילית (PBS) במשך 14 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. הכן שני פקדים נוספים, כאשר היווצרות של בסיס שיף או התארגנות adduct Amadori במהלך התגובה crosslinking מעוכבים, על ידי תוספת של cyanoborohydride נתרן 50 מ"מ או 250 מ"מ aminoguanidine. כן 1 דואר גליצין Mאסתר thyl (GEE) מדולל PBS. לעקר את הפתרון על ידי סינונו דרך המסנן מזרק 0.22 מיקרון באמצעות מזרק 50 מ"ל. לאחר זמן דגירה המצוין, בזהירות להסיר את פתרון GLA מן ג'לים RBM crosslinked, פתרון GLA המכיל מעכבים מן ג'לים RBM המלא PBS מן ג'לים RBM יליד שליטה. הוסף 250 μl של פתרון GEE לכל ג'לים RBM ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. הערה: שלב זה מרווה את התגובה crosslinking. לשטוף כל ג'לים RBM 10 פעמים ב 500 μl PBS כדי להסיר כל עקבות של GLA ו GEE. דגירת ג'לים RBM הלילה ב 37 מעלות צלזיוס 400 μl של PBS על מנת למנוע ההתייבשות שלהם. לנתח את הג'לים RBM הצטברות גיל, הלא האנזימטית נכסים crosslinking ו viscoelastic (שלבים 2.1-2.4). לניתוח rheometric נכסים viscoelastic שלהם להכין את הג'לים RBM בטבעות שיבוט (שלב 2.4). עבור תרבית תאים, לשטוף ג'לים RBM 2 פעמים עם 500 μl תרבות אותיdia לפני זריעת התאים (שלבים 5 ו -6). בצע שוטף בעדינות מבלי קצה פיפטה נגיעה במשטח ג'ל. 2. כימות ללא אנזימתי Crosslinking ונוקשות של RBM מטופלים עם GLA ניתוח פוטומטרי מדוד הצטברות הגיל שטופלו GLA ולשלוט ג'לים RBM באמצעות ניתוח photometric כדי לקבוע את מידת התגובה Maillard. לאחר שלב 1.11, להסיר את PBS מן ג'לים RBM בשקופיות הקאמריות 8-הבארות ולהוסיף 250 מים כפולים מזוקקים μl קר כקרח. דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 16-24 שעות כדי להבטיח כי המטריצה נוזלית לחלוטין. הערה: פפטידים RBM בפתרון זה מכילים גילים עם תכונות אוטומטיות ניאון. מעבירים את הפתרון בע"מ מעובה לצינור 1.5 מ"ל ולמדוד את פליטת ניאון של הפתרון באמצעות ספקטרופוטומטר (גל עירור = 370 ננומטר; = אורך גל הפליטה 440 ננומטר). ניתוח SDS-PAGE של פפטידים ציאנוגן ברומיד פתור את הג'לים GLA שטופלו ובקרה RBM על ג'ל polyacrylamide כדי לאשר GLA יש המושרה crosslinking לבין היווצרות של סיבים מאקרו. צנטריפוגה הפתרון בע"מ מעובה שנאספו שלב 2.1.1.2 ב XG 10,000 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. כן פתרון מניות המכיל 2 גרם / מיליליטר של ציאנוגן ברומיד המדולל אצטוניטריל. זהירות: תמיד טפלו ציאנוגן ברומיד במנדף כשהוא לבוש מעיל מעבדה, כפפות, faceshield ההנשמה. הסר את supernatant, מחדש להשעות את גלולה ג'ל BM ב 500 μl של 20 מ"ג / ציאנוגן ברומיד מ"ל + 70% v / v חומצה פורמית דגירה לילה ב RT. השתמש מזרק חד פעמי 1 מיליליטר להעביר גלולת ג'ל BM resuspended לתוך קלטת דיאליזה עם משקל מולקולרי המנותק 3.5 kDa. להטביע את הקלטת לתוך כוס זכוכית 500 מ"ל המכיל 500 מ"ל של מים כפולות מזוקקים בר ומערבבים מגנטי.מניחים את זה על בוחש מגנטי dialyze לילה (16 שעות) בשעה 4 ° C (בחדר קר) כדי להסיר כל עקבות של ציאנוגן ברומיד וחומצה פורמית. השתמש מזרק חד פעמי 1 מ"ל להעביר הפתרון בע"מ dialyzed מתוך הקלטת לתוך צינור 1.5 מ"ל. נתחו 25 μl של כל דגימה BM על ג'ל polyacrylamide נ 12% / v 10,11. בעקבות SDS-PAGE, לבצע צביעת כסף של ג'ל polyacrylamide 12 כדי להמחיש את דפוס electrophoretic של פפטידים-מטריקס ציאנוגן ברומיד 13. ניתוח מיקרוסקופי Immunofluorescent בצע מכתים immunofluorescent של GLA מטופלים ולשלוט ג'לים RBM עם נוגדנים אנטי-אייג '/ pentosidine, אנטי-קולגן IV ואנטי laminin ואחריו מיקרוסקופיה confocal לדמיין AGEs שנצבר קולגן IV / rearrangements מבניים סיבים laminin ב RBM crosslinked ג'לים 13. הערה: השתמש תמיד נפח מספיק כדי לכסות את entiמחדש ג'ל RBM במהלך incubations ושוטף בלי לגעת פני השטח RBM עם קצה פיפטה. לפרטים לנתח תרבויות acini 3D ידי immunofluorescence ראה התייחסות 6 ו במיקרוסקופ confocal של acini 3D ראה התייחסות 14. לשטוף GLA מטופלים וג'ל מלאה RBM בשקופיות קאמרית 8-בארות 2 פעמים עם 300 μl של PBS + (PBS המכיל 0.1 מ"מ CaCl 2 ו -0.5 מ"מ MgCl 2) במשך 5 דקות ב RT. הסר את PBS + ולאחר מכן להוסיף 300 μl של 4% w / v paraformaldehyde (PFA) מדולל PBS + לכסות כל ג'ל RBM. דגירה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי לתקן את הרכיבים RBM. הסר 4% w / v פתרון PFA. להוסיף להוסיף 300 μl של 75 מ"מ NH 4 Cl + 0.5 פתרון מ"מ MgCl 2 ו דגירה במשך 5 דקות ב RT (לחזור 5x) כדי להרוות את קיבעון. הכן חיץ Immunofluorescence (IF חיץ) על ידי הפיכת הפתרון הבא במים סטריליים: 130 mM NaCl, 7 מ"מ Na 2 4 HPO, 3.5 מ"מ לאא2 PO 4, 7.7 מ"מ NaN 3, 0.1% w / v בסרום שור אלבומין, 0.5% v / v פוליאתילן גליקול tert- octylphenyl האתר ו 0.05% v / v פוליאתילן גליקול monolaurate sorbitan. להכין אם חיץ חסימה ידי השלמת IF חיץ עם 20% נסיוב עז V / V. הסר את הפתרון מרווה ולהוסיף 300 μl של אם חסימת חיץ הג'לים RBM למנוע תגובות ספציפיות. דגירת שעה 2 ב RT על פלטפורמה רועדת. הסר את חוצץ חסימת IF ו- דגירה ג'לים RBM במשך 16 שעות ב 4 ° C עם 300 μl של נוגדן ראשוני מדולל אם חסימת חיץ (1: 500 עכבר מב אנטי pentosidine; 1/250 ארנב PAB IV אנטי-קולגן; 1 / ארנב 250 אנטי laminin / C PAB). הערה: incubations למשך זמן ארוך יותר מ -20 שעות ב 4 ° C. יכול liquidize RBM. הסר את הנוגדן הראשוני לשטוף 3 פעמים (10 דקות כל אחד) עם 300 μl של חיץ IF בטמפרטורת החדר על פלטפורמת רועד. הסר את חוצץ IF ו-להוסיף 300 μl של נוגדנים משני (נגד ארנב עיזים או IgG-עכבר אנטי [H + L]) מצומדות עם fluorochrome מדולל 1: 500 ב IF חסימת חיץ. דגירה עבור שעה 2 ב RT על פלטפורמה רועדת. הסר את נוגדנים משני דגירה 300 μl של חיץ IF במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את חוצץ IF ו- לשטוף 3 x 10 דקות ב 300 μl של PBS + בטמפרטורת החדר. תקן להרוות בשנית, כפי שתואר לעיל (צעדים 2.3.1.2 ו 2.3.1.3). הר ג'לים RBM מוכתם במדיה הרכבה ולנתח את ההיווצרות של צרורות צפופות של רכיבים עיקריים באמצעות epifluorescent או confocal. הערה: לפרטים לנתח תרבויות acini 3D ידי immunofluorescence ראה התייחסות 6 ועבור epifluorescent ו מיקרוסקופיה confocal של acini 3D ראה התייחסות 14. ניתוח ראולוגיות ביצוע ניתוח rheometric של GLA מטופלים ולשלוט ג'לים RBM למדוד נ שלהםiscoelasticity (נוקשות). הגדרת ג'לים RBM כי הם 1 מ"מ עובי בתוך תבנית עגולה בקוטר של 8 מ"מ. לשם כך, במקום טבעת שיבוט (בקוטר 8 מ"מ) בתוך גם צלחת תרבות 24 היטב ומוסיפים BM פתרון מטריקס מוכן כמתואר בשלבים 1.3-1.6. הערה: שהשחזור מדויק של הג'לים RBM המשמשים בניסויים, ג'לים RBM מוכן לניתוח rheometric צריך לעבור את אותה שטח הפנים ועובי כמו ג'לים RBM להגדיר בתאי 8-היטב. הג'לים RBM ניתח באיור 3 היו 1 מ"מ עובי ו -8 מ"מ קוטר. פנקו את הג'לים RBM שהוקם טבעות שיבוט עם PBS, GLA עבור 6 שעות ו GLA במשך 14 שעות כפי שתואר לעיל (שלבים 1.8 כדי 1.11). מדוד את מודולוס האלסטיות (E) של הג'לים RBM בקוטר 8 מ"מ על rheometer בעלת לוחית 8 מ"מ במקביל משוננת גיאומטריה, על פני טווח של מתח 1-3%, בכל תנודת תדר קבועה של 1Hz וטמפרטורה של 21 מעלות צלזיוס. לפרטים נוספים אודותניתוח rheometric ג'לים ECM לראות אזכור לראות 13,15,16 התייחסות. הערה: E נקבעת מודולוס אחסון גזירה שיעורר (G ') באמצעות המשוואה הבאה: E = 2 * G' * (1 + v) כאשר V היא מקדם פואסון של 0.5, כמתואר התייחסות 13,15 , 16. תרבות טיפול 3. קו PEC הרגיל, RWPE-1 לגדול RWPE-1 התאים סרום ללא מדיה keratinocyte (KSFM) בתוספת 5 ng / גורם הגדילה באפידרמיס מ"ל (EGF), 50 מיקרוגרם / מ"ל תמצית בלוטת יותרת המוח שור (BPE) ו -50 U / פניצילין מ"ל עם 50 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין ( להשלים KSFM). הערה: כדי למנוע גיוס של אפיתל-to-mesenchymal (EMT) מעבר-כמו אל תחשוף תאי RWPE-1 בסרום. אפשר להשלים KSFM להגיע RT למשך 30 דקות לאחר הסרת מאחסון ב 4 ° C ולעשות לא חם באמבט מים 37 ° C כמו זה יהיה להשבית את EGF ו BPE. לשאוב מלאKSFM מתוך צלחת ומחוברות 10 ס"מ 2 תאים RWPE-1, לשטוף עם 5 מ"ל של PBS מחומם מראש ולהוסיף 5 מ"ל של 0.05% טריפסין V / V להבטיח כי כל התאים מכוסים הפתרון. מניחים את התאים בתרבית רקמה החממה נקבע בתנאים סטנדרטיים של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 (עם humidification) במשך 5 עד 10 דקות. בדוק את מידת trypsinization לאחר 5 דק 'לטפוח בעדינות את צלחת התרבות כדי לנתק את התאים. הערה: תאים RWPE-1 לא לסבול תקופות ארוכות של trypsinization ולכן מומלץ לא לטפל יותר משני לוחות באותו זמן. כמו כן, חשוב לנתק את כל התאים מהצלחת להימנע ברירת שבטים. כאשר כל התאים RWPE-1 יש ומפורר, להוסיף 5 מ"ל של PBS חם המכיל 2% v / v עוברית עגל בסרום (FCS) כדי להרוות את טריפסין. פיפטה בעדינות מעלה ומטה כדי לפזר את אגרגטים התא לפני העברת התאים צינור צנטריפוגות. צנטריפוגה התאים מנתקים אותו ב 125-150 xגרם במשך 5 דקות במהירות של 25 ° C, וזורקים supernatant מחדש להשעות גלולה של התאים 5 מ"ל של שלמה KSFM עד ההשעיה של תאים בודדים מתקבל. העברה 1 מיליליטר של התאים מחדש מושעה לתוך צינור חדש ולהוסיף 9 מיליליטר של שלמה KSFM להפיץ את התאים ב דילול 1: מעבר 5 לשימוש ניסיוני הבא. לספור את שאר התאים באמצעות hemocytometer להקמת acini (ראה סעיף 5.1). הערה: אין תרבות RWPE-1 תאים עבור יותר מ -10 קטעים מאז תקופות ממושכות לאחר התרבות הם לא יוצרים acini עם הארכיטקטורה הנכונה. שנה את התקשורת והתרבות כל 48 שעות כדי להבטיח את EGF ו BPE נשארים פעילים. הערה: כלול שינוי בינוני זו לכל טיפולים מרחיבים מעבר 48 שעות. תרבות 4. טיפול של הקו הסלולרי BPH, BPH-1 BPH-1 תרבות התאים RPMI 1640 התקשורת השלים עם 5% FCS V / V, 50 פניצילין U / ml ו -50 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין. מומלץ לחמם אתהתקשורת והתרבות, PBS ו 0.25% w / v טריפסין-0.53 M פתרון EDTA עד 37 ° C לפני השימוש. הערה: תאים יכולים גם להיות מתורבת בתקשורת עם v 2.5% / V 8 FCS. לשאוב התקשורת והתרבות מתוך צלחת ומחוברות 10 ס"מ 2 תאים BPH-1 לשטוף את התאים 2 x עם 3 מ"ל של PBS להסיר כל עקבות של התקשורת והתרבות עם סרום שעשויים להרוות את התגובה טריפסין. לשאוב PBS ולהוסיף 3 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA כדי לכסות את התאים. מניחים את הצלחת להגדיר באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 (עם humidification) במשך 5 דקות. הסר את הפתרון טריפסין-EDTA כשהתאים הם עגולים אך נשארים מחוברים המנה. שטפו תאים עם 5 מ"ל של PBS. לאחר הסרת PBS, מוסיפים 5 מ"ל של התקשורת בתרבות פיפטה בעדינות מעלה ומטה כדי לייצר ההשעיה של תאים בודדים. העברת התאים צינור 15 מ"ל. קח 2 מיליליטר של השעית התא לתוך צינור צנטריפוגות חדש עם 8 מיליליטר של מדיה מלאה ו צלחת תאי BPH-1 ontOA 10 סנטימטרים 2 צלחת התרבות ב דילול 1: מעבר 5 לשימוש ניסיוני הבא. לספור את שאר התאים באמצעות hemocytometer להקמת acini (ראה סעיף 5.2). הערה: יש לשמור תיעוד של מספר המעבר, כמו תאי BPH-1 מבוגר לא יוצר acini עם ארכיטקטורה נכונה. מספר מעבר יותר מ -10 אינו רצוי. שנה את התקשורת והתרבות כל 72 שעות. 5. תרבות 3D של בלוטת הערמונית acini על RBM Native והנוקשה אם תאי RWPE-1 נמצאים בשימוש כדי ליצור acini, לדלל 5,000 תאים מוכנים בשלב 3.5 ב 300 μl של שלמה KSFM בתוספת 2% v / v הפתרון בע"מ. אם BPH-1 תאים נמצאים בשימוש כדי ליצור acini, לדלל 2,500 תאים מוכן בשלב 4.5 ב 300 μl של התקשורת בתרבות RPMI 1640 בתוספת 2% v / v פתרון בע"מ. הערה: BPH-1 תאים שגודלם עולה על תאים RWPE-1 כך מספרים נמוכים יותר של תאים BPH-1 משמשים כדי להשיג חלוקה דומה של acini לאחר 6 ימים של מבוי סתוםture. בעדינות זרע התאים על RBM יליד-התקשח AGE ובזהירות למקם את התרבויות להגדיר באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 (עם humidification) כדי להבטיח חלוקה שווה של acini הגוברת היטב שכל שתא מתחלק לייצר acina אחד. כל 2 ימים להחליף את התקשורת והתרבות עם תקשורת ותרבות טריה המכילה פתרון 2% v / v בע"מ על מנת להבטיח כי תאי גורמי הצמיחה נדרשים acina הנורמלי הומאוסטזיס. צג מורפולוגיה acinar בתרבויות גדלו באמצעות מיקרוסקופ brightfield 13. הערה: לאחר 3 ימים בתרבות תאים בודדים יהוו אשכול> 3 תאים ואחרי acini בלוטת 1 שבוע הערמונית בקוטר של ~ 50 מיקרומטר יקויימו. עקוב פרוטוקול המתואר 2.3 לבצע immunofluorescence באמצעות נוגדנים ספציפיים עבור סמנים של הידבקויות תא-מטריקס, הידבקויות תאים תאים, קוטביות basal-apico ואת הפולשנות 13. <li> השתמש במדיה גובר עם 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) או לכלול צעד נוסף (אחרי 2.3.12) להכתים גרעיני תאים על ידי דוגרים עם DAPI במשך 5 דקות ולשטוף 2 x 5 דקות עם PBS +. 6. אגרגטים תאים סרטניים 3D התרבות של ערמונית על RBM Native והנוקשה תאי PC3 תרבות במדיום RPMI 1640 FCS המכיל 10% v / v ו -50 U / פניצילין מ"ל עם 50 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין. מומלץ לחמם את התקשורת והתרבות, PBS ו 0.25% w / v טריפסין-0.53 פתרון M EDTA עד 37 ° C לפני השימוש. לשאוב התקשורת והתרבות מצלחת תרבות 10 ס"מ 2 ומחוברות של תאים PC3 לשטוף את התאים 2x עם 3 מ"ל של PBS כדי להסיר כל עקבות של FCS שיכולים להרוות את התגובה טריפסין. לשאוב PBS ולהוסיף 3 מ"ל של תמיסת טריפסין-EDTA כדי לכסות את התאים דגירה במשך 1 דקות. כאשר התאים הופכים מעוגל, אבל להישאר מחובר המנה, בזהירות לשאוב את הפתרון טריפסין-EDTA ולשטוף עם 3 מ"ל של PBSלהסיר כל עקבות של טריפסין. לאחר הסרת PBS, מוסיפים 5 מ"ל של התקשורת בתרבות פיפטה בעדינות מעלה ומטה כדי לייצר ההשעיה של תאים בודדים. העברת התאים צינור 15 מ"ל. קח 1 מ"ל של השעיה התא PC3 לתוך צינור צנטריפוגות חדשות ולהוסיף 9 מ"ל של התקשורת והתרבות. פלייט התאים על צלחת תרבות 2 10 סנטימטרים (01:10 דילול) לשימוש ניסיוני הבא. ספירת התאים הנותרים באמצעות hemocytometer. לדלל 2,500 תאי PC3 מוכן בשלב 6.6 ב 300 μl של התקשורת בתרבות RPMI 1640 בתוספת v / v 2% של פתרון BM כדי לאפשר היווצרות של ג'ל שיפוע בתרבות. בעדינות זרע התאים על RBM יליד-התקשח AGE ובזהירות למקם את התרבות לתוך החממה נקבע על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 (עם humidification) כדי להבטיח חלוקה שווה של גדל spheroids בבאר. שנה את התקשורת והתרבות כל 72 שעות. כדי לחקור את ההשפעה של RBM הנוקשה (AGE העשירי)על נדידת תאים סרטניים בערמונית, תאי PC3 התמונה באמצעות מיקרוסקופיה זמן לשגות וידאו brightfield באמצעות בקרת טמפרטורה / CO 2 בתא humidified 17. הערה: תאי PC3 לגדול בקווצות על RBM יליד ואינם מהווים acini עם לומן, אבל אם נותר לגדול יותר מ -72 שעות על הילידים RBM הם יהוו spheroids 3D. בעקבות הרכישה נתונים, באופן ידני לעקוב אחר תאים PC3 ולחשב מהירות הנדידה שלהם, הצורה (יחס התארכות) והתמדה של הגירה 17-19. הערה: התמדה = יחס D / T, D = המרחק מתחילתו ועד סופו של מסלול התא, T = האורך הכולל של מסלול התא.

Representative Results

3D הערמונית acini בתרבית על Stiff RBM לאחר 6 ימים בתרבות, פץ נגזר רקמות ערמונית נורמליות (RWPE-1) (איור 1 א) ורקמות BPH (BPH-1) (איור 1 ב) טופס acini על ילידים (PBS מטופלים) RBM כי מאורגנים spheroids האחיד של אפיתל תאים. Acini אלה יש גם את המאפיינים של פץ מאורגן עם קוטביות הפסגה אל הבסיס וכן לומינל גלוי שטח 13,20. Acini נוצר על ידי פץ נגזר רקמות ערמונית נורמליות (RWPE-1) (איור 1 א) ורקמות BPH (BPH-1) (איור 1B) על התקשחה (AGE העשירי) RBM (שטופלה GLA) יש ארכיטקטורה שבשה (הסטה מ spheroidal כדי מצולעים בכושר ותאי בולטות / נודדות מן acini לעידן עשירי RBM) (איור 1 א). אלה acini מאופיינים גם על ידי פץ מאורגן מאוד כי איבדו קוטביות הפסגה אל הבסיס שלהם עם רווח לומינל קטן או אפסי 13. איור 1:. הערמונית אפיתל תאים שגודלו כמו 3D הבלוטות acini על ממברנה מרתף מחדש Native ונוקשה (RBM) (א) תמונות Brightfield של RWPE-1 תאים שגודלו במשך 12 שעות עד 6 ימים על ג'ל RBM שטופלו PBS (מקורי) או 50 מ"מ glycolaldehyde במשך 14 שעות (AGE עשירים; נוקשה); בר סולם = 50 מיקרומטר. (ב) BPH-1 תאים, גדל כמתואר פאנל; ברי סולם = 50 מיקרומטר; נתונים הוא נציג של 3 ניסויים בלתי תלויים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. טבלה 1 "src =" / files / ftp_upload / 54,230 / 54230table1.jpg "/> טבלה 1:. מאפייני הערמונית אפיתל RWPE-1 acini גדל על שפת אם, חצי נוקשה ו ממברנה מרתף מחדש קשה (RBM) RWPE-1 acini גדלו על RBM טרום שטופלו PBS במשך 14 שעות (מקורי), glycolaldehyde (GLA במשך 6 שעות (חצי נוקשה) או GLA) במשך 14 שעות (נוקשה). לקבלת הצורה acinar, אחוז (%) ± סטיית תקן (SD) של עגול, חצי מצולעים מצולעים acini חושבו מתוך 5 ניסויים בלתי תלויים (50 acini לכמת לכל מצב). גודל acinar יחסית חושבה (יליד RBM = 100%) מן 3 ניסויים בלתי תלויים. לקבלת הפולשנות,% ± acini SD עם תאים בולטים אחד או יותר חושבו מתוך 3 ניסויים בלתי תלויים. שינוי פולד מחושב על ידי חלוקת שווי הממוצע שהושג בתנאים חצי נוקשים או נוקשים ידי הערך המקביל תנאי ילידים. ערכי P מחושבים באמצעות מבחן t (α = 0.05). ontent "FO: keep-together.within-page =" 1 "> נוקשות RBM תלויות גיל גדל מקדמת נדידת תאים סרטניים בערמונית PC3 תאי PC3 גדלו על ילידי RBM להעביר על ידי קשר תאי תאים רציף, בעוד שתאי PC3 גדלו על גיל עשירי (נוקשה) RBM מהלך עצמאי מכל (איור 2 א) אחרים. לאחר 72 שעות בתאי PC3 תרבות מהוות מוקדים (spheroids) על ילידים (PBS מטופלים) RBM, ואילו תאי PC3 על RBM הנוקשה (AGE העשירי) לא מן spheroids ולהעביר באופן עצמאי (תרשים 2B). תאי PC3 על RBM הנוקשה (AGE העשירי) הם מוארכים יותר מאשר תאי PC3 גדל על RBM ילידים (איור 2 ג). תאי PC3 על RBM נוקשה להעביר מהר יותר מתאים PC3 גדל על RBM הילידים (2D איור). תאי PC3 על RBM נוקשה להציג ירידה התמדה בהשוואה לתאים PC3 גדל על RBM הילידים (איור 2E). <img aLT = "איור 2" src = "/ files / ftp_upload / 54,230 / 54230fig2.jpg" /> איור 2:. נדידת תאים סרטניים הערמונית על ממברנה מרתף מחדש Native ונוקשה (RBM) (א) תמונות Brightfield של תאי PC3 גדל על ג'לים RBM שטופלו PBS (מקורי) או 50 מ"מ glycolaldehyde במשך 14 שעות (AGE-עשיר, נוקשה) . תאים היו צילמו באמצעות מיקרוסקופ brightfield (אובייקטיבי 10X) ושיעור רכישת 1 התמונה לכל שעה במשך 12 שעות ואחריו תא מעקב ליצור מסלולים. מהתמונות המוצגות מתאימות נקודות הזמן לאחר 0, 3, 6, 9 ו -12 שעות. מסלולים של תאים בודדים מוצגים עבור נקודת 12 שעות הזמן. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ב) בתאים PC3 בתרבית על RBM יליד או נוקשה במשך 72 שעות, צילמו כמתואר בלוח (א). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. פרטים מראים אזור נבחר בהגדלת 2X. (ג) ממוצע ± סטיית תקן אורך תא (מיקרומטר); הבדל משמעותי בין RBM יליד RBM נוקשה (p = 1.2 x 10 -23). ( <strאונג> D) ממוצע ± סטיית תקן מהירות (מיקרומטר / hr) שנמדדות מסלולי התא; הבדל משמעותי בין RBM יליד RBM הנוקשה (p = 0.004). (E) ממוצע ± סטיית תקן התמדה של תנועת התא (יחס D / T, כאשר D = המרחק מתחילתו ועד סופו של מסלול התא, T = האורך הכולל של מסלול התא); הבדל משמעותי בין RBM יליד RBM הנוקשה (p = 0.0007). עבור לוחות לספירה> 10 תאים נותחו, נתונים הוא נציג של 3 ניסויים בלתי תלויים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

פרוטוקול עבור הדור של acini הבלוטות 3D מ MECs ג'ל טהור RBM ⁶ שונתה במחקר קודם על ידי תוספת של 4 מ"ג / מ"ל סוג אני קולגן מטריקס RBM. התוספת של קולגן הביאה מודולוס האלסטיות של הג'ל RBM גובר מצד 175 ± 37 כדי 1589 ± 380 פסקל. 9.1 פי גידול זה נוקש מווסת את הצמיחה, הישרדות, ההגירה והבחנה של MECs ^21. פרוטוקול שונה שוב על ידי לרבות הורה חורג טיפול עם D – (-) – ריבוז לקדם crosslinking אנזימטית של קולגן מסוג I כי נוספו הג'ל RBM. הגידול 15 פי כתוצאה נוקשות נמצא לשתף פעולה עם השינוי בשעור של MECs לקדם התנהגות פולשנית שלהם ^22. הגישה ניסיון מהסוג מוסיף לי קולגן כדי ג'ל RBM מקלה על האינטראקציה הישירה של MECs עם סיבי קולגן, אשר מתרחש רק ברקמות אנושיות לאחר המכשול הפיזי בין stromaאפיתל שמספקת BM עוברת שפלה פרוטאוליטים. על ידי יצירת acini הבלוטות 3D מ פץ ג'ל RBM טהור טרום שטופלו GLA, הפרוטוקול הנוכחי פותח את הדרך ללמוד כיצד קשיחות בע"מ כשלעצמו יכול לעורר התנהגות פולשנית שלהם (איור 3). רמות קשיחות בע"מ המושרה בפרוטוקול זה יש רלוונטי פיסיולוגי. דגירה עם 50 מ"מ GLA עבור 6 שעות ו -14 שעות בהתאמה הגדילה את moduli אלסטי של הג'ל RBM טהור 175 ± 90 ו 322 ± 160 לעומת 122 ± 55 פסקל ג'ל RBM שטופלו PBS (טבלה 1). 1.7 ל 3.2 לקפל זו העלייה נוקשה RBM משכפלת את גידול 2.5- ל -3.4 פי נוקשות שנצפו ממאיר לעומת ערמונית נורמלית או BPH רקמות ^23-26. כפי שצוין בפרסום אחרון ¹³ השינויים המורפולוגיים מושרה על ידי ההצטברות של AGE וקשיחות RBM ב acini PEC ניתן לכמת עבור שינוי משמעותי סטטיסטית מן arounded לצורתו מצולעים, ירד לומינל / אזור acinar הכולל, ותאי בולטות נודדות מן acina לעידן עשירי RBM (איור 3). Immunoblotting יכול לשמש גם כדי להעריך סמנים של EMT (הפסד למשל של E-cadherin ¹³⁾ ואת התנהגות התכווצות (שרשרת-2 אור שרירן פוספורילציה למשל, pMLC2 ¹³⁾ ב פץ הגדלים רגילה לעומת RBM נוקשה (איור 3). הערכה נוספת באמצעות מכתים immunofluorescent ו מיקרוסקופיה confocal ניתן ליישם כדי להמחיש את BM (למשל laminin, קולגן IV וגיל הצטברות ^13), קוטביות הפסגה אל הבסיס הסלולרית (למשל לוקליזציה הפסגה של EEA1: אנטיגן endosomal מוקדם 1; ו GM130: 130 ציס-Golgi kDa סמן ¹³⁾ ודפוסי הסלולר של מולקולות הדבקה (לוקליזציה E-cadherin למשל לצמתים תאים תאים ¹³⁾ (איור 3).

<img aLT = "איור 3" src = "/ files / ftp_upload / 54,230 / 54230fig3.jpg" />
איור 3:. סקירה של הפרוטוקולים השונים שהוצגו כאן התרשים מתאר כיצד להכין להקשיח את הקרום במרתף מחדש (RBM) עם glycolaldehyde (תגובת מייארד), איך זרע תאים אל RBM הנוקשה, כיצד לנתח את RBM הנוקשה ( היקף תגובת Maillard) ונהלים, שניתן להשתמש בם כדי לנתח את השינויים התאיים ומולקולריים המושרים על ידי RBM AGE-עשיר. גיל, endproducts גליקציה המתקדם; BM, קרום במרתף; DAPI, 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole; EEA1, אנטיגן endosomal מוקדם 1; GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GLA, glycolaldehyde; GEE, אתיל אסתר גליצין; GM130, 130 kDa סמן ציס-Golgi; p-MLC2 (Thr18 / Ser19), שרירן שרשרת-2 אור פוספורילציה באתרים תראונין 18 סרין 19; RBM, קרום במרתף מחדש; SDS-PAGE, ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן. לקבלת RWPE1 acini בר סולם = 10 מיקרומטר; עבור תאים סרטניים PC3סולם spheroids בר = 100 מיקרומטר. נתון זה יש הבדל בין התייחסות ^13. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

שלבים לפתרון הבעיה יהיה צורך אם D – (-) – ריבוז נבחר כסוכן crosslinking עבור RBM. במהלך פיתוח פרוטוקול נמצא כי טיפול עם 1 M D – (-) – ריבוז במשך 72 שעות, כפי שתואר לעיל עבור ג'לים RBM / קולגן ^22, מביא את התייבשות ההצטמקות של ג'לים RBM. ההערכה של ריכוזים נמוכים של D – (-) – ריבוז ושעות טיפול קצרות עשויה לעזור להתגבר על מגבלה זו.

מגבלה פוטנציאלית יישומים עתידיים של הפרוטוקול יכולה להיות נתקלה בם רמות גבוהות של נוקשות RBM הן רצויות. אם פעמי דגירה ארוכות ריכוזים גבוהים יותר של GLA משמשים כדי לגרום לרמות גבוהות של נוקשות ג'ל RBM זה יהיה צורך להעריך אם יש תנאי טיפול אלה השפעה על הישרדות ובחלוקה של תאים, כפי שתואר לעיל ^13. כמו כן יש לציין כי הדגירה של תאים RWPE-1 עם סרום גורם מעבר EMT דמוי פנוטיפי וחשיפה בסרום או חומרים המכילים בסרום יש להימנע. לדוגמא, אם ניסויים כרוכים transfection של קצר מפריעי RNA (siRNA) oligonucleotides, ההליך צריך להיות מותאם באמצעות תאי RWPE-1 גדלו ב KSFM, מבלי לכבות את תאי תקשורת transfection בסרום נמוך. חסרון זה עלול לסכן את רמת גן ההשתקה מושג כאשר באמצעות siRNA חולף גישות במודל. עבור מטרות חלבון מסוימות זה יהיה מומלץ להעסיק וקטורי shRNA מושרים עבור להשתקת גנים מתכוננת ואת הירידה ברמות חלבון. עיבודים המשלבים crosslinking האנזימטית ידי תא סטרומה או מונואמין lysyl הקשורים תאים סרטניים (לקס) ¹⁷ יכול גם להיות משולב בתוך דגמים עתידיים.

jove_content "> פרוטוקול זה יקל על המחקר העתידי של מנגנונים פרו-פולשני מופעלים על ידי נוקשות תלויות גיל בע"מ ב פץ (RWPE-1, BPH-1) והערכת המטרות אנטי-גרורתית PTCs פולשנית (PC3). בהתחשב בכך BPH נחשב הפרעה מטבולית ^27, פרוטוקול זה גם סולל את הדרך לקראת ההבנה המשופרת שלנו על הקשר בין הפרעות מטבוליות וסיכון לסרטן הערמונית גדל. בהתחשב בכך נוקשות בע"מ המושרה על ידי חשיפתה גילים יכולות להיות הטריגר הפולשנות בסרטן אחר סוגים, זה יהיה עניין להשתמש בפרוטוקול להקים מודלים דומים המשלבים תאים נורמלים אפיתל ותאי גידול מאיברים אחרים (למשל שד, מעי גס, שחלות, לבלב).

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול, יחד עם התזמונים שלהם, מסוכם באיור 4. במהלך השלב הראשוני זה הכרחי כדי לשמור על פתרון המניות של RBM על 4 מעלות צלזיוס בזמן שהוא מפשיר למנוע pol שלהymerization. טיפים פיפטה לא צריך להיות ממוקם לתוך התמיסה RM המניה עד שהם כבר מקורר עד 4 ° C. עבור השלב הבא חשוב גם כדי להבטיח את השקופיות הקאמריות יש equilibrated עד 4 מעלות צלזיוס לפני שהם מכוסים פתרון RBM. ברגע הטמפרטורה של פתרון RBM היא עלתה מעל 4 מעלות צלזיוס הוא יעבור פילמור בלתי הפיך כדי ליצור ג'ל. זה חיוני כי RBM אינה מופרע בשלב פילמור כדי להבטיח שהיא יוצרת משטח ישר מתאים תרבית תאים וניתוח מיקרוסקופי. משך הדגירה עם GLA עם או בלי מעכבי התגובה Maillard (cyanoborohydride נתרן amingoguanidine) יקבע איך נוקשה הג'ל RBM הופך. מומלץ להשתמש דגירת hr 6 עם GLA אם תנאים חצי נוקשים נדרשים, דגירת 14 שעות אם נדרשים תנאים נוקשים (טבלה 1). פעמי דגירה חלופיות או ריכוזים של GLA יכולות לשמש אם רמות שונותשל קשיחות הם רצויים. בניתוח rheological במקרה זה של הג'לים RBM צריך להיות משולב כצעד הכרחי. בעקבות הצעד של מרווה התגובה Maillard ידי הדגירה עם GEE ואת השלבים כביסה הבאים עם PBS, ג'לים RBM ניתן להשתמש מיד או לאחסן 4 ° C עד 48 שעות לפני השימוש בהם עבור תרבית תאים. לאחר בתרביות תאים מוגדרות חשוב לשנות את מדיום התרבות (כולל כל טיפולים) כל ימים. מומלץ לשמור על תרביות תאי 3D עבור 3-12 ימים בהתאם לפרמטרים תחת חקירה. לקבלת 3D PEC acini מומלץ לנתח התרבויות לאחר 6 ימים, לניתוח 3D PTC spheroids מומלצת לאחר 3 ימים של תרבות בערכאה הראשונה.

איור 4:. סקירה פשוטה של הפרוטוקול עם שלבי תזמונים קריטיים הצביע על פלהבתרשים w מתאר כיצד להכין להקשיח את הקרום במרתף מחדש (RBM) עם glycolaldehyde (תגובת מייארד) בצעדי תזמונים קריטיים מצוינים. נקודות כאשר הפרוטוקול ניתן לעצור, וג'ל RBM מאוחסן, מסומנים גם. RBM, קרום במרתף מחדש; GLA, glycolaldehyde; GEE, אתיל אסתר גליצין; ON, לילה; PBS, פוספט שנאגר מלוח; RT, בטמפרטורת החדר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Simon Hayward (Vanderbilt University Medical Center) for the BPH-1 cells; and Thomas Cox and Janine Erler (Biotech Research & Innovation Centre, University of Copenhagen) for their assistance with rheological measurements. MR-T was funded by Worldwide Cancer Research, formerly The Association of International Cancer Research (Grant 08-0803 to JS), The British Embassy Montevideo and Agencia Nacional de Investigacion e Innovacion (UK_RH_2015_1_2 to MR-T). MC was supported by Prostate Cancer UK (Grant S14-017 to JS and GS). KW was funded by The China Scholarship Council. MAM was funded by The Saudi Arabian Cultural Bureau.

Materials

I – Material for monolayer culture
BPH-1	CaP Cell Line Database	PCaCL-132	Contact: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu
Complete keratinocyte serum-free media	ThermoFisher Scientific	17005-075	Do not warm at 37 ºC before use
Fetal calf serum	First Link UK Ltd	02-00-850	Store at -20 ºC in aliquots
PC3	American Type Culture Collection	CRL-1435
Penicillin/streptomycin	ThermoFisher Scientific	15070-063
Phosphate Buffer Saline (Dulbecco A) tablets	Oxoid	BR0014G
RPMI 1640 medium	Sigma-Aldrich	R5886	warm in 37 ºC water bath before use
RWPE-1	American Type Culture Collection	CRL-11609
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4049
Name	Company	Catalog Number	Comments
II – Material for 3D culture
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	271004
Aminoguanidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	396494	Irritating to eyes, respiratory system and skin
Chamber slides, 8-well	Thermo Scientific Nunc Lab-Tek	TKT-210-816M
Culture Matrix reconstituted basement membrane (rBM) reduced growth factor extract	AMS Biotechnology	3445-005-01	Store Basement membrane (BM) at -80 ºC in aliquots
Cyanogen bromide	Sigma-Aldrich	C91492	Toxic by contact skin and inhalation
Formic acid	Sigma-Aldrich	695076
Glycine ethyl ester hydrochloride (GEE)	Sigma-Aldrich	50060	Irritating to eyes
Glycolaldehyde dimer (GLA)	Sigma-Aldrich	G6805
Sodium cyanoborohydride	Sigma-Aldrich	71435	Highly flammable; Toxic by contact skin and inhalation
Syringe filter 0.22 microns	Appleton Woods	BC680
Name	Company	Catalog Number	Comments
III – Material to quantify Maillard reaction
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	ThemoFisher Scientific	D3571	light sensitive and store at -20 ºC in aliquots
Cloning cylinders	Sigma-Aldrich	C1059
Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate	ThemoFisher Scientific	A-11001	light sensitive
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate	ThemoFisher Scientific	A-11034	light sensitive
Goat serum	Abcam	ab7481	Store at -20 ºC in aliquots
Vectashield mounting media	Vector Laboratories	H-1000
Mouse anti-pentosidine clone PEN-12 mAb	TransGenic Inc	KH012
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	F8775	Store at -20 ºC in aliquots
Rabbit anti-human collagen IV polyclonal antibody	Acris Antibodies	R1041	Store at -20 ºC in aliquots
Rabbit anti-laminin A/C pAb	Santa Cruz Biotechnology Inc	sc-7292	Store at -20 ºC in aliquots
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton-X100)	Sigma-Aldrich	T9284
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Tween-20)	Sigma-Aldrich	P1379
Dialysis cassette Slide-A-Lyzer	ThemoFisher Scientific	66333
Name	Company	Catalog Number	Comments
IV – Equipment
ARG2 controlled strain rotational rheometer	T.A. Instruments
Axiovert S100 (20x magnification) microscope	Zeiss
CO2 controlled humidified incubation chamber for Zeiss Axio S100 microscope	Solent Scientific
Confocal Axiovert 200M (40x, 63x magnification) microscope	Zeiss
Olympus LH50A microscope fitted with a digital camera using phase-contrast	Olympus
PHERAstar Plus plate reader spectrophotometer	BMG Labtech
Name	Company	Catalog Number	Comments
V – Software
Image J 1.47v	National Institute of Health, USA
MetaXpress	Molecular Divices

References

Timpl, R., Brown, J. C. Supramolecular assembly of basement membranes. Bioessays. 18 (2), 123-132 (1996).
Yurchenco, P. D., Ruben, G. C. Type IV collagen lateral associations in the EHS tumor matrix. Comparison with amniotic and in vitro networks. Am J Pathol. 132 (2), 278-291 (1988).
Halfter, W., et al. Protein composition and biomechanical properties of in vivo-derived basement membranes. Cell Adh Migr. 7 (1), 64-71 (2013).
Candiello, J., Cole, G. J., Halfter, W. Age-dependent changes in the structure, composition and biophysical properties of a human basement membrane. Matrix Biol. 29 (5), 402-410 (2010).
To, M., et al. Diabetes-induced morphological, biomechanical, and compositional changes in ocular basement membranes. Exp Eye Res. 116, 298-307 (2013).
Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
Bello, D., Webber, M. M., Kleinman, H. K., Wartinger, D. D., Rhim, J. S. Androgen responsive adult human prostatic epithelial cell lines immortalized by human papillomavirus 18. Carcinogenesis. 18 (6), 1215-1223 (1997).
Hayward, S. W., et al. Establishment and characterization of an immortalized but non-transformed human prostate epithelial cell line: BPH-1. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 31 (1), 14-24 (1995).
Kaighn, M. E., Narayan, K. S., Ohnuki, Y., Lechner, J. F., Jones, L. W. Establishment and characterization of a human prostatic carcinoma cell line (PC-3). Invest Urol. 17 (1), 16-23 (1979).
Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
Rabilloud, T. Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis. Electrophoresis. 11 (10), 785-794 (1990).
Rodriguez-Teja, M., et al. AGE-modified basement membrane cooperates with Endo180 to promote epithelial cell invasiveness and decrease prostate cancer survival. J Pathol. 235 (4), 581-592 (2015).
Graf, B. W., Boppart, S. A. Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models. Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).
Yao, N. Y., Larsen, R. J., Weitz, D. A. Probing nonlinear rheology with inertio-elastic oscillations. J Rheology. 52 (4), 1013-1025 (2008).
Baker, A. M., Bird, D., Lang, G., Cox, T. R., Erler, J. T. Lysyl oxidase enzymatic function increases stiffness to drive colorectal cancer progression through FAK. Oncogene. 32 (14), 1863-1868 (2013).
Caley, M. P., et al. Tumor-associated Endo180 requires stromal-derived LOX to promote metastatic prostate cancer cell migration on human ECM surfaces. Clin Exp Metastasis. 3 (2), 151-165 (2016).
Sturge, J., Wienke, D., East, L., Jones, G. E., Isacke, C. M. GPI-anchored uPAR requires Endo180 for rapid directional sensing during chemotaxis. J Cell Biol. 162 (5), 789-794 (2003).
Sturge, J., Wienke, D., Isacke, C. M. Endosomes generate localized Rho-ROCK-MLC2-based contractile signals via Endo180 to promote adhesion disassembly. J Cell Biol. 175 (2), 337-347 (2006).
Rodriguez-Teja, M., et al. Survival Outcome and EMT Suppression Mediated by a Lectin Domain Interaction of Endo180 and CD147. Mol Cancer Res. 13 (3), 538-547 (2015).
Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
Carson, W. C., et al. Material characterization of ex vivo prostate tissue via spherical indentation in the clinic. Med Eng Phys. 33 (3), 302-309 (2011).
Hoyt, K., et al. Tissue elasticity properties as biomarkers for prostate cancer. Cancer Biomark. 4 (4-5), 213-225 (2008).
Krouskop, T. A., Wheeler, T. M., Kallel, F., Garra, B. S., Hall, T. Elastic moduli of breast and prostate tissues under compression. Ultrason Imaging. 20 (4), 260-274 (1998).
Zhang, M., et al. Quantitative characterization of viscoelastic properties of human prostate correlated with histology. Ultrasound Med Biol. 34 (7), 1033-1042 (2008).
Corona, G., et al. Benign prostatic hyperplasia: a new metabolic disease of the aging male and its correlation with sexual dysfunctions. Int J Endocrinol. , (2014).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Rodriguez-Teja, M., Breit, C., Clarke, M., Talar, K., Wang, K., Mohammad, M. A., Pickwell, S., Etchandy, G., Stasiuk, G. J., Sturge, J. How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases. J. Vis. Exp. (115), e54230, doi:10.3791/54230 (2016).

Automatically Generated