Come studiare membrana basale Rigidità come biofisica trigger nel cancro alla prostata e altre patologie legate all'età o malattie metaboliche

1. L'induzione di BM Rigidità indotta da trattamenti GLA (reticolazione non enzimatica) Scongelare una fiala congelata di matrice BM (10 ml) mediante incubazione a 4 ° C (in piedi sul ghiaccio in una cella frigorifera o frigorifero) liquido finché il contenuto della fiala sono diventati (8-16 ore). Attenzione: Se una camera fredda / frigorifero non viene usato, coprire l'intera bottiglia con ghiaccio. Questo consentirà di evitare la soluzione stock di BM solidificazione. Per gli esperimenti futuri e per evitare cicli di gelo-disgelo ripetuti, preparare 25 x 0,4 ml aliquote da ogni nuovo flaconcino da 10 ml di matrice BM. fiale conservare a -80 ° C fino alla data di scadenza indicata dal produttore. Quando necessario, scongelare fiale a 4 ° C in piedi sul ghiaccio per 2 ore. Preparare una superficie uniforme di ghiaccio. Inserire un vetrino camera 8 pozzetti sopra il ghiaccio per mantenere una temperatura di 4 ° C durante la procedura di rivestimento. Scongelare una fiala di matrice di BM a 4 ° C. Nota: Un 0,4 ml flacone di matrice BM è sufficiente coat una intera diapositiva camera di 1 x 8-bene. Conservare il flaconcino coperto di ghiaccio durante la manipolazione per evitare che la matrice di BM solidificazione. Tagliare l'estremità di erogazione di un puntale 200 l con le forbici. Raffreddare il blunt-ended 200 microlitri punta della pipetta a 4 ° C e posizionarlo su di un 200 ml di aiuto la capacità di pipettaggio. Raccogliere 40 ml di soluzione fredda di matrice BM nella punta della pipetta e trasferirlo in un pozzo sul refrigerata 8 pozzetti vetrino da camera. Nota: 40 ml di soluzione di BM è sufficiente a coprire una superficie 0,8 cm 2. Tenere i puntali delle pipette refrigerate durante la procedura di rivestimento per evitare la solidificazione della soluzione BM. Non introdurre bolle d'aria nella soluzione di matrice BM e garantire il pozzo è uniformemente rivestita senza la formazione di un menisco visibile ai bordi. Ripetere passaggio 1.4 base al numero di pozzetti e camere richiesti. Dopo il rivestimento, collocare il vetrino camera 8 pozzetti a 37 ° C per 30 min per promuovere la polimerizzazionedel BM. Chiudere la porta incubatore molta attenzione per evitare eventuali disturbi del liquido RBM. Non superare il tempo di incubazione di 30 minuti per evitare la disidratazione del gel RBM. Nota: Il gel risultante è il nativo ricostituito BM (RBM). La fase C di incubazione 37 ° non richiede 5% CO 2. Tuttavia, per comodità eseguire questo passaggio in un incubatore di coltura tissutale a 37 ° C e 5% CO 2 (con umidificazione). Preparare 50 mM glicolaldeide (GLA) diluito in 0,2 M tampone fosfato (pH 7,8). Sterilizzare la soluzione passa attraverso un filtro a siringa da 0,22 micron utilizzando una siringa da 50 ml. Per una reazione di reticolazione in un volume finale di 250 ml di 50 mM GLA, aggiungere 25 ml di 0,5 M sodio cianoboroidruro o 2,5 M amminoguanidina a 125 ml di 100 mM GLA (2x archivio) e 100 ml di 0,2 M tampone fosfato (pH 7.8 ). Sterilizzare le soluzioni madre facendoli passare attraverso un filtro a siringa da 0,22 micron utilizzando una siringa da 50 ml. Attenzione: maneggiare sodiocianoboroidruro indossa un camice da laboratorio, guanti, visiera e respiratore mentre si lavora in una cappa aspirante. Aggiungere 250 pl di soluzione di GLA per coprire il gel polimerizzato RBM e incubare a 37 ° C per 6 ore per produrre un semi-rigida MLF gel o 14 ore per produrre un gel rigido MLF. Nota: Il volume di GLA aggiunto deve coprire il gel polimerizzato RBM e deve essere adeguato di conseguenza. Se si utilizzano diversi tempi di incubazione GLA, i gel RBM devono essere analizzati per determinare la piega-aumento di RBM rigidità (vedi punto 2.4). Preparare un controllo negativo incubando un gel nativo RBM in 250 ml di sterile tampone fosfato salino (PBS) per 14 ore a 37 ° C. Preparare due controlli aggiuntivi in ​​cui la formazione della base di Schiff o Amadori addotto riarrangiamento durante la reazione di reticolazione sono inibiti, con l'aggiunta di 50 mM di sodio cianoboroidruro o 250 mM amminoguanidina. Preparare 1 M glicina emetil estere (GEE) diluito in PBS. Sterilizzare la soluzione passa attraverso un filtro a siringa da 0,22 micron utilizzando una siringa da 50 ml. Dopo il periodo di incubazione indicato, rimuovere con attenzione la soluzione di GLA dai gel RBM reticolati, soluzione GLA contenente inibitori delle gel RBM di controllo e PBS dal controllo gel nativi RBM. Aggiungere 250 pl di soluzione GEE a tutti i gel RBM e incubare a 37 ° C per 1 ora. Nota: Questo passaggio placa la reazione di reticolazione. Lavare tutti i gel RBM 10 volte in 500 microlitri di PBS per rimuovere tutte le tracce di GLA e GEE. Incubare i gel RBM notte a 37 ° C in 400 ml di PBS per impedire la loro disidratazione. Analizzare i gel RBM per l'accumulo di AGE, reticolazione non enzimatica e viscoelastiche proprietà (Steps 2.1-2.4). Per l'analisi reometrica delle loro proprietà viscoelastiche preparare i gel RBM in anelli di clonazione (passo 2,4). Per coltura cellulare, sciacquare RBM gel 2 volte con 500 microlitri cultura media prima della semina le cellule (i punti 5 e 6). Eseguire lava delicatamente senza la punta della pipetta di toccare la superficie del gel. 2. Quantificazione di non enzimatica reticolazione e la rigidità dei meccanismi Trattato con GLA Analisi fotometrica Misurare l'accumulo di AGE in GLA-trattati e controllare i gel RBM utilizzando l'analisi fotometrica per determinare l'entità della reazione di Maillard. Dopo il punto 1.11, rimuovere il PBS dal gel RBM negli 8 pozzetti camera di diapositive e aggiungere 250 acqua ghiacciata ml bidistillata. Incubare a 4 ° C per 16-24 ore per assicurare che la matrice è completamente liquefatto. Nota: peptidi RBM in questa soluzione contengono le età con le proprietà auto-fluorescente. Trasferire la soluzione BM liquefatto ad una provetta da 1,5 ml e misurare l'emissione fluorescente della soluzione utilizzando uno spettrofotometro (lunghezza d'onda di eccitazione = 370 nm; emissione di lunghezza d'onda = 440 nm). SDS-PAGE analisi di bromuro di cianogeno Peptidi Risolvere i gel GLA-trattati e di controllo RBM su un gel di poliacrilammide per confermare che GLA ha indotto reticolazione e la formazione di macro-fibre. Centrifugare la soluzione BM liquefatto raccolti al passo 2.1.1.2 a 10.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Preparare una soluzione madre contenente 2 g / ml di bromuro di cianogeno diluito in acetonitrile. Attenzione: Maneggiare sempre bromuro di cianogeno in una cappa aspirante mentre indossa un camice da laboratorio, guanti, visiera e respiratore. Rimuovere il surnatante, risospendere il pellet gel BM in 500 ml di 20 mg / ml bromuro di cianogeno + 70% v / v di acido formico e incubare durante la notte a RT. Utilizzare un 1 ml siringa monouso per trasferire il gel pellet BM risospese in una cassetta di dialisi con un peso molecolare tagliato 3,5 kDa. Immergere la cassetta in un bicchiere di vetro da 500 ml contenente 500 ml di acqua bidistillata e una ancoretta magnetica.Inserire questo su un agitatore magnetico e dializzare notte (16 ore) a 4 ° C (in una camera fredda) per rimuovere tutte le tracce di bromuro di cianogeno e acido formico. Utilizzare un 1 ml siringa monouso per trasferire la soluzione BM dializzato dal cassetto in una provetta da 1,5 ml. Analizzare 25 microlitri di ciascun campione BM su un 12% v / v di poliacrilammide gel 10,11. Dopo SDS-PAGE, effettuare la colorazione argento del gel poliacrilammide 12 per visualizzare il tracciato elettroforetico di peptidi bromuro di cianogeno-matrice 13. Analisi immunofluorescenza Microscopia Eseguire immunofluorescenza colorazione di GLA trattata e controllare gel meccanismi con Anti-Age / pentosidina, anti-collagene IV e gli anticorpi anti-laminina seguita da microscopia confocale di visualizzare AGE accumulati e riarrangiamenti strutturali in fibra di laminina collagene IV / nel reticolato RBM Gel 13. Nota: utilizzare sempre un volume sufficiente a coprire la Entire gel RBM durante l'incubazione e lavaggi senza toccare la superficie RBM con la punta della pipetta. Per i dettagli di analizzare le culture acini 3D mediante immunofluorescenza vedi riferimento 6 e per la microscopia confocale di acini 3D vedi riferimento 14. Lavare GLA trattata e gel di controllo RBM in camera di diapositive 8-pozzetti 2 volte con 300 ml di PBS + (PBS contenente 0.1 mM CaCl 2 e 0,5 mM MgCl 2) per 5 minuti a RT. Rimuovere la PBS + quindi aggiungere 300 ml di 4% w / v paraformaldeide (PFA) diluito in PBS + per coprire ogni gel RBM. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente per fissare i componenti MLF. Rimuovere il 4% w / v soluzione PFA. Aggiungere aggiungere 300 ml di 75 mm NH 4 soluzione Cl + 0,5 mM MgCl 2 e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (ripetere 5 volte) per placare la fissazione. Preparare immunofluorescenza tampone (tampone IF), rendendo la seguente soluzione in acqua sterile: 130 mm NaCl, 7 mm Na 2 HPO 4, 3,5 mm NaH2 PO 4, 7.7 mM NaN 3, 0,1% w / v BSA, 0,5% v / v polietilene glicole tert-ottilfenil etere e 0,05% v / v polietilenglicole sorbitan monolaurato. Preparare SE tampone di bloccaggio, completandola tampone IF con il 20% di siero di capra v / v. Rimuovere la soluzione di tempra e aggiungere 300 ml di IF tampone di bloccaggio ai gel RBM per evitare reazioni aspecifiche. Incubare 2 ore a temperatura ambiente su una piattaforma di agitazione. Rimuovere il tampone bloccante IF e incubare i gel RBM per 16 ore a 4 ° C con 300 ml di anticorpo primario diluito in IF tampone di bloccaggio (1: 500 topo anti-pentosidina mAb; 1/250 di coniglio anti-collagene IV pAb; 1 / 250 coniglio anti-laminina A / C pAB). Nota: Incubazioni per più di 20 ore a 4 ° C può liquidize la RBM. Rimuovere l'anticorpo primario e lavare 3 volte (10 min ciascuna) con 300 ml di tampone IF a temperatura ambiente su una piattaforma di agitazione. Rimuovere il tampone IF eaggiungere 300 ml di anticorpo secondario (goat anti-rabbit o anti-topo IgG [H + L]), coniugati con un fluorocromo diluito 1: 500 in tampone di bloccaggio IF. Incubare per 2 ore a temperatura ambiente su una piattaforma di agitazione. Rimuovere l'anticorpo secondario e incubare in 300 pl di tampone IF per 10 min a temperatura ambiente. Rimuovere il tampone IF e lavare 3 x 10 minuti in 300 ml di PBS + a temperatura ambiente. Fissare e dissetare una seconda volta, come descritto sopra (passi 2.3.1.2 e 2.3.1.3). Montare colorate gel RBM nei mezzi di montaggio e analizzare la formazione di densi fasci di importanti componenti utilizzando epifluorescente o microscopia confocale. Nota: per i dettagli di analizzare le culture acini 3D mediante immunofluorescenza vedere riferimento 6 e per epifluorescente e microscopia confocale di acini 3D vedono di riferimento 14. Analisi reologico Eseguire l'analisi reometrica di GLA trattata e controllare gel RBM per misurare la loro viscoelasticity (rigidità). Impostare gel meccanismi che sono spessi in uno stampo circolare con un diametro di 8 mm 1 mm. Per fare ciò, posizionare un anello clonazione (diametro 8 mm) all'interno di un pozzetto di una piastra di coltura da 24 pozzetti e aggiungere BM soluzione matrice preparata come descritto nei passaggi 1.3-1.6. Nota: Per un'accurata ricapitolazione dei gel meccanismi utilizzati per esperimenti, i gel RBM preparate per l'analisi reometrica devono avere la stessa superficie e spessore gel meccanismi istituiti nelle camere 8 pozzetti. I gel RBM analizzati in figura 3 sono stati 1 mm di spessore e 8 mm di diametro. Trattare i gel RBM allestiti negli anelli di clonazione con PBS, GLA per 6 ore e GLA per 14 ore come descritto sopra (passi da 1,8 a 1,11). Misurare il modulo elastico (E) di 8 mm Diametro meccanismi gel su un reometro con un 8 mm piastra parallela seghettata geometria, in un intervallo di 1-3% di deformazione, ad una oscillazione frequenza fissa di 1 Hz e temperatura di 21 ° C. Per ulteriori dettagli sullaanalisi reometrica di gel ECM vedi riferimenti vedere 13,15,16 riferimento. Nota: E viene determinato dal modulo di accumulo risultante di taglio (G ') mediante l'uso della seguente equazione E = 2 * G' * (1 + v) dove v è il rapporto di Poisson di 0,5, come descritto in riferimento 13,15 , 16. 3. Cultura e manipolazione della linea normale PEC, RWPE-1 Grow RWPE-1 le cellule cheratinociti mezzi privi di siero (KSFM) integrata con 5 ng / ml fattore di crescita epidermico (EGF), 50 mg / ml di estratto di ipofisi bovina (BPE) e 50 U / ml di penicillina con 50 mg / ml di streptomicina ( completare KSFM). Nota: Per evitare l'induzione di epitelio-to-mesenchimale (EMT) -come transizione non esporre le cellule RWPE-1 al siero. Permettere la completa KSFM raggiungere RT per 30 minuti dopo la rimozione dalla conservazione a 4 ° C e non fa caldo in un 37 ° C bagnomaria in quanto ciò inattivare il FEG e BPE. Aspirare il completoKSFM da un confluenti 10 centimetri 2 piatto di RWPE-1 cellule, lavare con 5 ml di PBS preriscaldata e aggiungere 5 ml di 0,05% v / v tripsina garantire che tutte le cellule sono coperti con la soluzione. Collocare le cellule in un incubatore di coltura tissutale fissato a condizioni standard di 37 ° C e 5% CO 2 (con umidificazione) da 5 a 10 min. Controllare l'entità del tripsinizzazione dopo 5 min e toccare delicatamente la piastra di coltura per staccare le cellule. Nota: le cellule RWPE-1 non tollerano lunghi periodi di tripsinizzazione quindi si consiglia di non gestire più di due piatti contemporaneamente. E 'anche importante dissociare tutte le cellule dalla piastra per evitare selezione clonale. Quando tutte le cellule RWPE-1 si sono dissociate, aggiungere 5 ml di caldo PBS contenente 2% v / v di siero fetale bovino (FCS) per placare la tripsina. Delicatamente pipetta su e giù per rompere le aggregati di cellule prima di trasferire le cellule in una provetta da centrifuga. Centrifugare le cellule dissociate a 125-150 xg per 5 min a 25 ° C, scartare il surnatante e risospendere il pellet di cellule in 5 ml di completo KSFM fino ad ottenere una sospensione di cellule singole. Trasferire 1 ml di cellule risospese in una nuova provetta e aggiungere 9 ml di completo KSFM per propagare le cellule a una diluizione 1: 5 di passaggio per il successivo uso sperimentale. Contare il resto delle cellule utilizzando un emocitometro per l'impostazione di acini (vedere paragrafo 5.1). Nota: non cultura RWPE-1 le cellule per più di 10 passaggi da periodi di cultura dopo lunghi non formano acini con l'architettura corretta. Modificare i terreni di coltura ogni 48 ore per garantire la FEG e BPE rimangono attivi. Nota: Includere questo cambiamento mezzo per eventuali trattamenti che si estendono oltre 48 ore. 4. Cultura e Manipolazione della BPH linea cellulare, BPH-1 Culture BPH-1 in cellule RPMI 1640 supporti integrati con 5% v / v FCS, 50 U / ml di penicillina e 50 mg / ml di streptomicina. scaldare ilterreni di coltura, PBS e 0,25% w / v soluzione di tripsina-EDTA 0,53 M a 37 ° C prima dell'uso. Nota: Le cellule possono anche essere coltivate in mezzi con 2,5% v / v FCS 8. Aspirare il terreno di coltura da un confluenti 10 centimetri 2 piatto di BPH-1 le cellule e lavare le cellule 2 x con 3 ml di PBS per rimuovere tutte le tracce di terreni di coltura con siero che può placare la reazione tripsina. Aspirare il PBS e aggiungere 3 ml di soluzione di tripsina-EDTA per coprire le cellule. Porre la piastra in un incubatore a 37 ° C e 5% CO 2 (con umidificazione) per 5 min. Rimuovere la soluzione tripsina-EDTA quando le cellule sono rotondi, ma rimangono attaccati al piatto. Lavare le cellule con 5 ml di PBS. Dopo la rimozione della PBS, aggiungere 5 ml di terreni di coltura e delicatamente pipetta su e giù per produrre una sospensione di cellule singole. Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml. Prendere 2 ml di sospensione cellulare in una nuova provetta da centrifuga con 8 ml di mezzi completi e targhetta BPH-1 le cellule ontoa 10 centimetri 2 piastra di coltura ad una diluizione 1: 5 di passaggio per il successivo uso sperimentale. Contare il resto delle cellule utilizzando un emocitometro per l'impostazione di acini (vedere paragrafo 5.2). Nota: Tenere un registro del numero di passaggio, come vecchie cellule BPH-1 non formano acini con un'architettura adeguata. Un numero di passaggio superiore 10 non è desiderata. Modificare i terreni di coltura ogni 72 ore. 5. Cultura 3D della Prostata Acini su meccanismi nativi e Stiff Se RWPE-1 le cellule vengono utilizzate per formare acini, diluire 5.000 celle previste al punto 3.5 in 300 ml di completo KSFM integrato con il 2% v / v della soluzione di BM. Se BPH-1 le cellule vengono utilizzate per formare acini, diluire 2.500 celle previste al punto 4.5 in 300 ml di RPMI 1640 terreni di coltura integrato con il 2% v / v della soluzione di BM. Nota: BPH-1 le cellule sono più grandi di RWPE-1 le cellule in modo che i numeri più bassi di BPH-1 le cellule vengono utilizzati per ottenere una simile distribuzione di acini dopo 6 giorni di cultura. Sementi delicatamente le cellule sul RBM nativo e AGE-irrigidita e con attenzione inserire le culture in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2 (con umidificazione) per garantire una distribuzione uniforme di crescere acini nel pozzo e che ogni cellula si divide per produrre un acina. Ogni 2 giorni sostituire il terreno di coltura con terreni di coltura fresco contenente il 2% soluzione v / v BM per assicurare che le cellule sono i fattori di crescita necessari per acina normale omeostasi. Monitorare acinare morfologia nelle culture in crescita utilizzando la microscopia in campo chiaro 13. Nota: Dopo 3 giorni di coltura singole celle formeranno un gruppo di> 3 celle e dopo 1 settimana prostata acini con un diametro di ~ saranno osservati 50 micron. Seguire protocollo descritto in 2.3 per eseguire immunofluorescenza utilizzando anticorpi specifici per i marcatori di adesioni cellula-matrice, adesioni cellula-cellula, la polarità apico-basale e invasività 13. <li> Utilizzare un supporto di montaggio con 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) o includono un passo in più (dopo 2.3.12) per macchiare nuclei delle cellule incubando con DAPI per 5 minuti e lavare 2 x 5 minuti con PBS +. 6. cultura 3D della prostata Aggregati cellule tumorali su meccanismi nativi e Stiff cellule PC3 cultura in terreno RPMI 1640 contenente il 10% v / v FCS e 50 U / ml di penicillina con 50 ug / ml di streptomicina. Riscaldare il terreno di coltura, PBS e 0,25% w / v soluzione di tripsina-EDTA 0,53 M a 37 ° C prima dell'uso. Aspirare il terreno di coltura da un confluenti 10 centimetri 2 cultura piatto di cellule PC3 e lavare le cellule 2x con 3 ml di PBS per rimuovere tutte le tracce di FCS che può placare la reazione tripsina. Aspirare il PBS e aggiungere 3 ml di soluzione di tripsina-EDTA per coprire le cellule e incubare per 1 min. Quando le cellule diventano arrotondati, ma rimangono attaccata al piatto, aspirare accuratamente la soluzione di tripsina-EDTA e lavare con 3 ml di PBS perrimuovere tutte le tracce di tripsina. Dopo la rimozione della PBS, aggiungere 5 ml di terreni di coltura e delicatamente pipetta su e giù per produrre una sospensione di cellule singole. Trasferire le cellule in una provetta da 15 ml. Prendere 1 ml della sospensione di cellule PC3 in una nuova provetta e aggiungere 9 ml di terreni di coltura. Piastra le cellule su un piatto di 10 centimetri 2 cultura (diluizione 1:10) per il successivo uso sperimentale. Contare le cellule rimanenti utilizzando un emocitometro. Diluire 2.500 cellule PC3 previste al punto 6.6 in 300 ml di RPMI 1640 mezzi di coltura addizionato con 2% v / v della soluzione BM per consentire la formazione di un gel gradiente nella coltura. Delicatamente seminare le cellule sul RBM nativo e AGE-irrigidita e con attenzione inserire la cultura nella incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2 (con umidificazione) per garantire una distribuzione uniforme di crescere sferoidi nel pozzo. Modificare i terreni di coltura ogni 72 ore. Per studiare l'effetto della rigida RBM (ricco di AGE)sulla migrazione delle cellule tumorali della prostata, le cellule PC3 immagine utilizzando il video campo chiaro microscopia time-lapse con temperatura / CO 2 di controllo e di una camera umidificata 17. Nota: le cellule PC3 crescono in filoni sui meccanismi nativi e non fanno acini con un lume, ma se lasciato a crescere più di 72 ore su nativo RBM formeranno sferoidi 3D. Dopo l'acquisizione dei dati, tenere traccia manualmente cellule PC3 e calcolare la loro velocità di migrazione, la forma (rapporto di allungamento) e la persistenza della migrazione 17-19. Nota: Persistenza = rapporto D / T, D = distanza dall'inizio alla fine della traiettoria delle cellule, T = lunghezza totale della traiettoria delle cellule.