Hoe om te studeren Basement Membrane stijfheid als biofysische Trigger bij prostaatkanker en andere Leeftijdsgebonden Pathologies of Metabole Ziekten

1. Inductie van BM stijfheid GLA geïnduceerd door behandeling (niet-enzymatische Crosslinking) Ontdooi een bevroren flacon BM matrix (10 ml) door incubatie bij 4 ° C (op ijs in een koude kamer of koelkast) totdat de inhoud van het flesje geworden vloeistof (8-16 uur). Let op: Als een koude ruimte / koelkast niet wordt gebruikt, hebben betrekking op de hele fles met ijs. Hiermee wordt voorkomen dat de voorraad oplossing van BM stollen. Voor toekomstige experimenten en herhaalde vries dooi cycli te voorkomen, voorbereiden 25 x 0,4 ml porties van elk nieuw 10 ml flacon van BM matrix. flacons Bewaren bij -80 ° C tot de vervaldatum aangegeven door de fabrikant. Wanneer nodig, flacons ontdooien bij 4 ° C staan ​​op ijs gedurende 2 uur. Bereid een vlakke ondergrond van ijs. Plaats een 8-well kamer glasplaatje bovenop het ijs tot een temperatuur van 4 ° C tijdens de bekledingswerkwijze te handhaven. Dooi een flacon BM matrix bij 4 ° C. Opmerking: Een 0,4 ml flacon van BM matrix is ​​voldoende om coat een hele 1 x 8-well kamer dia. De flacon bedekt met ijs tijdens het hanteren om te voorkomen dat de BM matrix stollen. Snijd de afgifte einde van een 200 ul pipetpunt met een schaar. Koel de stompe 200 ul pipetpunt tot 4 ° C en plaats het op een 200 ul capaciteit pipetteren hulp. Neem 40 pi van de koude BM matrix oplossing in de pipet en over te dragen in een goed op de gekoelde 8-well kamer glasplaatje. Opmerking: 40 pl BM oplossing is voldoende om een oppervlak van 0,8 cm2 omvatten. Houd pipetpunten gekoeld tijdens de bekledingsprocedure om stolling van het BM oplossing voorkomen. Geen luchtbellen te introduceren in de BM matrixoplossing en zorgen voor goed gelijkmatig bedekt zonder de vorming van een meniscus zichtbaar aan de randen. Herhaal stap 1,4 volgens het aantal putten en kamers nodig. Na het bekleden, plaats de 8-well kamer dia bij 37 ° C gedurende 30 minuten om de polymerisatie te bevorderenvan de BM. Sluit de incubator deur zeer zorgvuldig om ongewenste verstoring van de vloeistof rBM voorkomen. Niet meer dan de 30 min incubatietijd om uitdroging van de RBM gel te vermijden. Opmerking: De resulterende gel is de inheemse opgelost BM (RBM). De 37 ° C incubatiestap vereist geen 5% CO2. Echter, voor het gemak uitvoeren van deze stap in een weefselkweek incubator ingesteld op 37 ° C en 5% CO 2 (met bevochtiging). Bereid 50 mM glycolaldehyde (GLA) verdund in 0,2 M fosfaatbuffer (pH 7,8). Steriliseer de oplossing door deze door een 0,22 micron spuitfilter met behulp van een 50 ml spuit. Een verknopingsreactie in een eindvolume van 250 pl 50 mM GLA, voeg 25 ul van 0,5 M natriumcyaanboorhydride of 2,5 M aminoguanidine aan 125 gl 100 mM GLA (2x) en per 100 gl 0,2 M fosfaatbuffer (pH 7,8 ). Steriliseer de stamoplossingen door hen te passeren door een 0,22 micron spuit filter met behulp van een 50 ml spuit. Let op: Hanteer natriumcyaanboorhydride het dragen van een laboratoriumjas, handschoenen, faceshield en ademhalingsapparaat tijdens het werken in een zuurkast. Voeg 250 ul van GLA oplossing van het gepolymeriseerde rBM gel te bedekken en incubeer bij 37 ° C gedurende 6 uur tot een semi-stijve rBM gel of 14 uur een stijve gel rBM produceren. Opmerking: Het volume van de GLA toegevoegd, moet de gepolymeriseerde rBM gel bedekken en moeten dienovereenkomstig worden aangepast. Als verschillende GLA incubatietijden worden gebruikt, moet de rBM gels worden geanalyseerd om de vouw-verhoging rBM stijfheid te bepalen (zie stap 2.4). Bereid een negatieve controle door het incuberen van een natief rBM gel in 250 gl steriel met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) gedurende 14 uur bij 37 ° C. Bereid twee aanvullende controles waarbij de vorming van de Schiffse base of adduct Amadori herschikking tijdens de verknopingsreactie worden geremd door de toevoeging van 50 mM natriumcyaanboorhydride of 250 mM aminoguanidine. Bereid 1 M glycine ethyl ester (GEE) verdund in PBS. Steriliseer de oplossing door deze door een 0,22 micron spuitfilter met behulp van een 50 ml spuit. Na de aangegeven incubatietijd, aandachtig de GLA-oplossing van de verknoopte rBM gels verwijderen, GLA oplossing die remmers van de controle rBM gels en PBS via het bedieningspaneel inheemse rBM gels. Voeg 250 ul van GEE oplossing voor alle rBM gels en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. Opmerking: Deze stap lest de verknopingsreactie. Was alle rBM gels 10 keer in 500 pl PBS om alle sporen van GLA en GEE verwijderen. Incubeer de rBM gels nacht bij 37 ° C in 400 pl PBS om uitdroging te voorkomen. Analyseer de rBM gels AGE accumulatie, niet-enzymatische verknoping en visco-elastische eigenschappen (Stappen 2,1-2,4). Voor reometrische analyse van hun visco-elastische eigenschappen te bereiden de rBM gels in klonen ringen (Stap 2.4). Voor celcultuur afspoelen rBM gels 2 maal met 500 ul cultuur media voor het zaaien van de cellen (Stappen 5 en 6). Voer wast zachtjes zonder de pipetpunt aanraken van het gel oppervlak. 2. Kwantificering van niet-enzymatische verknoping en stijfheid van rBM Behandeld met GLA fotometrische Analyse Meet AGE accumulatie in GLA-behandelde en controle rBM gels met behulp van fotometrische analyse om te bepalen de omvang van de Maillard-reactie. Na Step 1.11, verwijder de PBS uit rBM gels in de 8-wells kamer dia's en voeg 250 ul ijskoud dubbel gedestilleerd water. Incubeer bij 4 ° C gedurende 16-24 uur zodat de matrix volledig vloeibaar. Opmerking: rBM peptiden in deze oplossing bevatten AGEs met auto-fluorescerende eigenschappen. Breng de vloeibare BM oplossing een 1,5 ml buis en meet de fluorescentie-emissie van de oplossing met een spectrofotometer (excitatie golflengte = 370 nm, emissiegolflengte = 440 nm). SDS-PAGE analyse van cyanogeenbromide peptiden Los het GLA behandelde en controle rBM gels op een polyacrylamidegel om te bevestigen dat GLA verknoping en vorming van macro-vezels heeft veroorzaakt. Centrifugeer de vloeibaar BM oplossing verzameld in stap 2.1.1.2 bij 10.000 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Bereid een voorraadoplossing van 2 g / ml cyanogeenbromide verdund in acetonitril. Let op: Behandel cyanogeenbromide in een zuurkast terwijl het dragen van een laboratoriumjas, handschoenen, faceshield en gasmasker. Verwijder het supernatant, resuspendeer de BM gel pellet in 500 ui van 20 mg / ml cyanogeenbromide + 70% v / v mierenzuur en incubeer overnacht bij kamertemperatuur. Gebruik een 1 ml wegwerpspuit met de geresuspendeerde pellet BM gel over in een dialyse cassette met een molecuulgewicht uit 3,5 kDa. Dompel de cassette in een 500 ml glazen beker met 500 ml dubbel gedestilleerd water en een magnetische roerstaaf.Plaats dit op een magnetische roerder en dialyseer gedurende de nacht (16 uur) bij 4 ° C (in een koude kamer) om alle sporen van cyanogeenbromide en mierezuur verwijderen. Gebruik een 1 ml wegwerpspuit de BM gedialyseerde oplossing uit de cassette over in een 1,5 ml buis. Analyse 25 pl van elk monster BM op een 12% v / v polyacrylamidegel 10,11. Na SDS-PAGE, voert zilverkleuring van de polyacrylamide gel 12 op het elektroforetisch patroon van cyanogeenbromide peptiden matrix 13 visualiseren. Immunofluorescentie Microscopy Analyse Voer immunofluorescentie kleuring van GLA behandelde en controle rBM gels met anti-AGE / pentosidine, anti-collageen IV en anti-laminine-antilichamen gevolgd door confocale microscopie om geaccumuleerde AGE en collageen IV / laminine fiber structurele herschikkingen te visualiseren in de verknoopte rBM gels 13. Let op: Gebruik altijd een voldoende volume om de enti dekkenre rBM gel tijdens incubaties en wast zonder het aanraken van de RBM-oppervlak met de pipet tip. Voor meer informatie over het analyseren van 3D acini culturen door immunofluorescentie zie referentie 6 en voor confocale microscopie van 3D acini zie referentie 14. Wassen GLA behandelde en controle rBM gels 8-putjes objectglaasjes kamer 2 maal met 300 pi PBS + (PBS dat 0,1 mM CaCl2 en 0,5 mM MgCl2) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de PBS + voeg 300 ul van 4% w / v paraformaldehyde (PFA) verdund in PBS + elke rBM gel omvatten. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om de rBM componenten op te lossen. Verwijder de 4% w / v oplossing PFA. Voeg voeg 300 ul van 75 mM NH4 Cl + 0,5 mM MgCl2-oplossing en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (herhalen 5x) om de fixatie te blussen. Bereid Immunofluorescentie buffer (IF buffer) door de volgende oplossing in steriel water: 130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3,5 mM NaH2 PO 4, 7,7 mM NaN3, 0,1% w / v runderserumalbumine, 0,5% v / v polyethyleen glycol tert-octylfenyl ether en 0,05% v / v polyethyleen glycol sorbitan monolauraat. Bereid IF blokkerende buffer door aanvulling IF-buffer met 20% v / v geit serum. Verwijder het blussen oplossing en voeg 300 ul van IF blokkeerbuffer de rBM gels niet-specifieke reacties te voorkomen. Incubeer 2 uur bij KT op een schuddend platform. Verwijder de IF blokkeerbuffer en incubeer de rBM gels 16 uur bij 4 ° C met 300 gl primair antilichaam verdund in blokkerende buffer IF (1: 500 anti-muis mAb pentosidine; 1/250 konijnen anti-collageen IV pAb; 1 / 250 konijnen anti-laminine A / C pAb). Opmerking: Incubaties langer dan 20 uur bij 4 ° C kan de rBM liquidize. Verwijder het primaire antilichaam en was 3 keer (10 minuten elk) met 300 pl IF-buffer bij kamertemperatuur op een schuddend platform. Verwijder de IF-buffer envoeg 300 ul van het secundaire antilichaam (geit anti-konijn of anti-muis IgG [H + L]) geconjugeerd met een fluorochroom verdund 1: 500 in blokkerende buffer IF. Incubeer gedurende 2 uur bij kamertemperatuur op een schuddend platform. Verwijder het secundaire antilichaam en geïncubeerd in 300 pl IF buffer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder de IF-buffer en was 3 x 10 min in 300 pl PBS + op kamertemperatuur. Fix en lessen voor de tweede keer, zoals hierboven (Stappen 2.3.1.2 en 2.3.1.3) beschreven. Monteer lood rBM gels in de montage media en analyseren van de vorming van dichte bundels van de belangrijkste onderdelen met behulp van epifluorescerende of confocale microscopie. Opmerking: Voor meer informatie over het analyseren van 3D acini culturen door immunofluorescentie zie referentie 6 en voor epifluorescerende en confocale microscopie van 3D acini zie referentie 14. reologische Analyse Voer reometrische analyse van GLA behandelde en controle rBM gels om hun v meteniscoelasticity (stijfheid). Opgericht rBM gels die 1 mm in een ronde mal met een diameter van 8 mm. Om dit te doen, plaatst u een klonen ring (8 mm diameter) in een putje van een 24-well cultuur plaat en voeg BM matrix oplossing bereid zoals beschreven in de stappen 1,3-1,6. Opmerking: Voor een nauwkeurige herhaling van de RBM gels gebruikt voor experimenten, de rBM gels voorbereid reometrische analyse moeten dezelfde oppervlakte en dikte als de rBM gels opgericht in het 8-well kamers hebben. De rBM gelen in Figuur 3 werden geanalyseerd 1 mm dik en 8 mm in diameter. Behandel de rBM gels opgericht in de kloneringsringen met PBS, GLA 6 uur en GLA voor 14 uur zoals hierboven (stap 1,8-1,11) beschreven. Meet de elasticiteitsmodulus (E) van de 8 mm diameter rBM gels op een reometer met een parallelle plaat 8 mm getand geometrie, een bereik van 1-3% rek, met een vaste frequentie oscillatie van 1Hz en temperatuur van 21 ° C. Voor meer informatie over dereometrische analyse van ECM gels zie referenties zie referentie 13,15,16. Opmerking: E wordt bepaald uit de resulterende afschuiving opslagmodulus (G ') door middel van de volgende vergelijking E = 2 * G * (1 + v) waarbij v de verhouding van Poisson 0,5, zoals beschreven in referentie 13,15 , 16. 3. Cultuur en Behandeling van de Normal PEC lijn, RWPE-1 Grow RWPE-1 cellen in keratinocyt serum-vrij medium (KSFM), aangevuld met 5 ng / ml epidermale groeifactor (EGF), 50 ug / ml runderhypofyse-extract (BPE) en 50 U / ml penicilline 50 ug / ml streptomycine ( voltooien KSFM). Opmerking: Om de inductie van epitheliale-to-mesenchymale voorkomen (EMT) -achtige overgang niet RWPE-1-cellen bloot te stellen aan serum. Bieden volledige KSFM tot kamertemperatuur komen gedurende 30 minuten na verwijdering uit opslag bij 4 ° C en niet warm in een 37 ° C waterbad omdat dit de EGF en BPE zal inactiveren. Zuig de volledigeKSFM van een confluente 10 cm 2 bord RWPE-1 cellen, spoelen met 5 ml voorverwarmde PBS en voeg 5 ml 0,05% v / v trypsine die op cellen zijn bedekt met de oplossing. Plaats de cellen in een weefselkweek incubator ingesteld op standaardcondities van 37 ° C en 5% CO 2 (met bevochtiging) gedurende 5 tot 10 minuten. Controleer de omvang van de behandeling met trypsine na 5 min en tik voorzichtig de cultuur plaat om de cellen los. Opmerking: RWPE-1 cellen niet langdurig trypsine tolereren Dus is het raadzaam meer dan twee platen niet omgaan tegelijk. Het is ook belangrijk om alle cellen te scheiden van de plaat klonale selectie voorkomen. Wanneer alle RWPE-1 cellen gedissocieerd, voeg 5 ml warm PBS dat 2% v / v foetaal kalfsserum (FCS) om de trypsine te lessen. Voorzichtig pipet op en neer te breken van de cel aggregaten voor het overbrengen van de cellen naar een centrifugebuis. Centrifugeer de cellen los van elkaar op 125-150 xg gedurende 5 minuten bij 25 ° C, verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet van cellen in 5 ml compleet KSFM tot een suspensie van afzonderlijke cellen is verkregen. Breng 1 ml van de geresuspendeerde cellen in een nieuwe buis en voeg 9 ml volledig KSFM aan de cellen propageren bij een 1: 5 verdunning passage voor verdere experimenten gebruikt. Tel de rest van de cellen met een hemocytometer voor het instellen acini (zie paragraaf 5.1). Let op: Niet cultuur RWPE-1-cellen voor meer dan 10 passages want na langere perioden van de cultuur ze niet acini met de juiste architectuur te vormen. Verander het kweekmedium elke 48 uur om ervoor te zorgen de EGF en BPE actief blijven. Opmerking:: Dit medium verandering voor alle behandelingen die verder reiken dan 48 uur. 4. Cultuur en Behandeling van de BPH Cell Line, BPH-1 Cultuur BPH-1 cellen in RPMI 1640 medium aangevuld met 5% v / v FCS, 50 U / ml penicilline en 50 ug / ml streptomycine. Verwarm dekweekmedia PBS en 0,25% w / v trypsine-EDTA 0,53 M oplossing van 37 ° C voor gebruik. Opmerking: Cellen kunnen ook in media worden gekweekt met 2,5% v / v FCS 8. Zuig het kweekmedium van een confluente 10 cm 2 plaat van BPH-1 cellen en was de cellen 2 x met 3 ml PBS om alle sporen van kweekmedia met serum dat trypsine reactie kan blussen verwijderen. Zuig het PBS en voeg 3 ml trypsine-EDTA-oplossing om de cellen te dekken. Plaats de plaat in een incubator ingesteld op 37 ° C en 5% CO 2 (met bevochtiging) gedurende 5 min. Verwijder de trypsine-EDTA-oplossing wanneer de cellen zijn rond maar blijven aan de schotel. Was de cellen met 5 ml PBS. Na verwijdering van het PBS, voeg 5 ml kweekmedium en voorzichtig pipet op en neer om een ​​suspensie van afzonderlijke cellen. Overdracht van de cellen om een ​​15 ml buis. Neem 2 ml van de celsuspensie in een nieuwe centrifugebuis met 8 ml compleet medium en plaat de BPH-1 cellen ontoa 10 cm 2 cultuur plaat bij een 1: 5 passage verwatering voor latere experimenteel gebruik. Tel de rest van de cellen met een hemocytometer voor het instellen acini (zie paragraaf 5.2). Opmerking: Houd een verslag van de passage nummer, aangezien oudere BPH-1 cellen acini met een goede architectuur vormen. Een passage nummer meer dan 10 is niet gewenst. Verander het kweekmedium elke 72 uur. 5. 3D-cultuur van de Prostaat Acini op inheemse en stijf rBM Als RWPE-1-cellen worden gebruikt om acini gevormd, verdun 5000 cellen bereid in stap 3.5 in 300 gl compleet KSFM aangevuld met 2% v / v oplossing van BM. Als BPH-1 cellen worden gebruikt om acini gevormd, verdun 2500 cellen bereid in stap 4.5 in 300 ul RPMI 1640 kweekmedium aangevuld met 2% v / v oplossing van BM. Opmerking: BPH-1 cellen zijn groter dan RWPE-1 cellen, zodat het kleiner aantal BPH-1 cellen worden gebruikt om een ​​vergelijkbare verdeling van acini verkregen na 6 dagen cultuur. Voorzichtig zaad de cellen op de natieve en AGE verstijfde rBM en plaats voorzichtig het kweken in een incubator ingesteld op 37 ° C en 5% CO 2 (met bevochtiging) om een gelijkmatige verdeling van het kweken acini in de put en dat elke cel deelt een acina produceren. Elke 2 dagen vervangen kweekmedium vers kweekmedium met 2% v / v BM oplossing zodat de cellen groeifactoren vereist voor normaal acina homeostase. Monitor acinar morfologie in groeiende kweken met behulp van helderveld microscopie 13. Opmerking: na 3 dagen in cultuur afzonderlijke cellen van een cluster van> 3 cellen vormen en na 1 week prostaatklier acini met een diameter van ~ 50 urn worden waargenomen. Volg protocol in 2.3 beschreven immunofluorescentie uit te voeren met behulp van antilichamen die specifiek zijn voor markers van cel-matrix adhesies, cel-cel adhesie, apico-basale polariteit en invasiviteit 13. <li> Gebruik een montage media met 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) of beschikken over een extra stap (na 2.3.12) naar celkernen vlek door incubatie met DAPI gedurende 5 minuten en was 2 x 5 min met PBS +. 6. 3D-cultuur van de prostaattumor Cell Aggregaten op inheemse en stijf rBM Cultuur PC3 cellen in RPMI 1640 medium dat 10% v / v FCS en 50 U / ml penicilline 50 ug / ml streptomycine. Verwarm de kweekmedia PBS en 0,25% w / v trypsine-EDTA 0,53 M oplossing van 37 ° C voor gebruik. Zuig het kweekmedium van een confluente 10 cm 2 kweekschaal van PC3 cellen en was de cellen 2x met 3 ml PBS om alle sporen van FCS dat de trypsine reactie kan blussen verwijderen. Zuig het PBS en voeg 3 ml trypsine-EDTA-oplossing om de cellen te bedekken en incubeer gedurende 1 min. Wanneer de cellen worden afgerond, maar blijft bevestigd aan de schaal voorzichtig zuig het trypsine-EDTA-oplossing en was met 3 ml PBS omVerwijder alle sporen van trypsine. Na verwijdering van het PBS, voeg 5 ml kweekmedium en voorzichtig pipet op en neer om een ​​suspensie van afzonderlijke cellen. Overdracht van de cellen om een ​​15 ml buis. Neem 1 ml van het PC3 celsuspensie in een nieuwe centrifugebuis en voeg 9 ml van de cultuur media. Plate de cellen op een 10 cm 2 cultuur schotel (1:10 verdunning) voor later experimenteel gebruik. Tel de resterende cellen met een hemocytometer. Verdun 2500 PC3 cellen die zijn bereid in stap 6.6 in 300 ul RPMI 1640 kweekmedium aangevuld met 2% v / v BM oplossing om de vorming van een gradiënt gel in de cultuur. Voorzichtig zaad de cellen op de natieve en AGE verstijfde rBM en plaats voorzichtig de cultuur in de op 37 ° C en 5% CO 2 (met bevochtiging) incubator gelijkmatige verdeling van sferoïden groeien in de put waarborgen. Verander het kweekmedium elke 72 uur. Om het effect van stijve (AGE-rijke) rBM bestuderenop prostaat tumorcel migratie, het PC3 cellen met behulp van helderveld video time-lapse microscopie met behulp van temperatuur / CO 2 controlepunten en een vochtige kamer 17. Opmerking: PC3 cellen groeien in strengen op inheemse rBM en geen acini met een lumen niet te vormen, maar als links naar meer dan 72 uur te groeien op inheemse rBM zullen ze 3D bolletjes vormen. Naar aanleiding van data-acquisitie, handmatig PC3 cellen volgen en de berekening van hun migratie snelheid, vorm (rek ratio) en persistentie van migratie 17-19. Opmerking: Persistence = verhouding D / T, D = afstand van het begin tot het einde van de cel traject, T = totale lengte van de cel van de bal.