Como estudiar membrana basal para la rigidez como un disparador de Biofísica en el cáncer de próstata y otras patologías relacionadas con la edad o enfermedades metabólicas

1. La inducción de la BM Rigidez inducida por el tratamiento GLA (reticulación no enzimática) Descongelar un vial congelado de la matriz BM (10 ml) mediante la incubación a 4 ° C (de pie sobre el hielo en un cuarto frío o un refrigerador) de líquido hasta que el contenido del vial se han convertido en (8-16 hr). Precaución: Si no se utiliza una habitación / refrigerador frío, cubrir toda la botella con hielo. Esto evitará que la solución madre de BM se solidifique. Para futuros experimentos y para evitar los ciclos de congelación y descongelación repetidas, preparar 25 x 0,4 ml alícuotas de cada nuevo vial de 10 ml de la matriz BM. Guarde los viales a -80 ° C hasta la fecha de caducidad indicada por el fabricante. Cuando sea necesario, descongelar los viales a 4 ° C se colocan en hielo durante 2 horas. Preparar una superficie uniforme de hielo. Colocar un portaobjetos de vidrio cámara de 8 pocillos en la parte superior del hielo para mantener una temperatura de 4 ° C durante el procedimiento de recubrimiento. Descongelar un vial de matriz BM a 4 ° C. Nota: Un 0,4 ml vial de matriz BM es suficiente para coat toda una diapositiva de la cámara 1 x 8 pocillos. Mantener el vial cubierto de hielo durante la manipulación para evitar que la matriz BM se solidifique. Cortar el extremo de dispensación de una punta de pipeta de 200 l con unas tijeras. Se enfría la punta de la pipeta 200 l de extremos romos a 4 ° C y colocarlo en un auxiliar de pipeteado capacidad de 200 l. Tomar hasta 40 l de la solución fría matriz BM en la punta de la pipeta y la transfiere en un pozo en el frío de 8 pocillos portaobjetos de vidrio de cámara. Nota: 40 l de solución de BM es suficiente para cubrir un área superficial de 0,8 cm 2. Mantenga puntas de pipeta refrigerados durante el procedimiento de recubrimiento para evitar la solidificación de la solución de BM. No introducir burbujas de aire en la solución de matriz de BM y asegurar el pozo se reviste de manera uniforme sin la formación de un menisco visible en los bordes. Repita el paso 1.4 de acuerdo con el número de pozos y cámaras requeridos. Después del recubrimiento, colocar la corredera cámara de 8 pocillos a 37 ° C durante 30 min para promover la polimerizacióndel BM. Cierre la puerta de la incubadora con mucho cuidado para evitar la perturbación no deseada de la RBM líquido. No exceda el tiempo de incubación de 30 minutos para evitar la deshidratación del gel de RBM. Nota: El gel resultante es el BM nativa reconstituida (RBM). La etapa C de incubación 37 ° no requiere 5% de CO 2. Sin embargo, por conveniencia realizar este paso en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C y 5% de CO 2 (con humidificación). Preparar glicolaldehído 50 mM (GLA) diluido en tampón de fosfato 0,2 M (pH 7,8). Esterilizar la solución pasándola a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras utilizando una jeringa de 50 ml. Para una reacción de reticulación en un volumen final de 250 l de GLA 50 mM, añadir 25 l de cianoborohidruro de sodio 0,5 M o 2,5 M de aminoguanidina a 125 l de mM GLA 100 (2x Stock) y 100 l de tampón de fosfato 0,2 M (pH 7,8 ). Esterilizar las soluciones madre pasándolos a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras utilizando una jeringa de 50 ml. Precaución: Manipular cianoborohidruro de sodio que llevaba una bata de laboratorio, guantes, protector para la cara y el respirador mientras se trabaja en una campana de humos. Añadir 250 l de solución de GLA para cubrir el gel polimerizado RBM y se incuba a 37 ° C durante 6 horas para producir un gel RBM semi-rígido o 14 horas para producir un gel rígido RBM. Nota: El volumen de GLA añadir debe cubrir el gel polimerizado RBM y debe ajustarse en consecuencia. Si se utilizan diferentes tiempos de incubación GLA, los geles de gestión por resultados deben ser analizados para determinar el pliegue aumento de la rigidez RBM (véase el paso 2.4). Preparar un control negativo mediante la incubación de un gel nativo en la GBR 250 l de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) durante 14 horas a 37 ° C. Preparar dos controles adicionales en las que se inhiben la formación de base de Schiff o Amadori reordenamiento aducto durante la reacción de reticulación, por la adición de cianoborohidruro de sodio 50 mM o aminoguanidina 250 mM. Preparar 1 M de glicina correoéster Thyl (GEE) diluido en PBS. Esterilizar la solución pasándola a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras utilizando una jeringa de 50 ml. Después de que el tiempo de incubación indicado, retire con cuidado la solución de GLA a partir de los geles reticulados RBM, GLA solución que contiene inhibidores de los geles de control y gestión por resultados PBS de control de los geles nativos RBM. Añadir 250 l de solución de GEE a todos los geles de la GBR y se incuba a 37 ° C durante 1 hr. Nota: Este paso apaga la reacción de reticulación. Lavar todos los geles RBM 10 veces en 500 l de PBS para eliminar todos los rastros de GLA y GEE. Incubar los geles RBM durante la noche a 37 ° C en 400 l de PBS para evitar su deshidratación. Analizar los geles de gestión por resultados para la acumulación de AGE, reticulación no enzimática y propiedades viscoelásticas (Pasos 2.1-2.4). Para el análisis reométrico de sus propiedades viscoelásticas preparar los geles GBR en anillos de clonación (paso 2.4). Para el cultivo celular, enjuague geles RBM 2 veces con 500 l de cultivo mídia antes de sembrar las células (pasos 5 y 6). Realizar lavados suavemente sin la punta de pipeta tocando la superficie del gel. 2. Cuantificación de no enzimática La reticulación y la rigidez de la GBR tratados con GLA Análisis fotométrico Medir la acumulación de AGE en tratados con GLA y controlar geles RBM usando análisis fotométrico para determinar la extensión de la reacción de Maillard. Después del paso 1.11, retire la PBS a partir de geles de gestión por resultados en los 8 pocillos cámara de diapositivas y añadir 250 l de agua doblemente destilada enfriada con hielo. Se incuba a 4 ° C durante 16 a 24 horas para asegurar que la matriz completa licuación. Nota: Los péptidos GBR en esta solución contienen AGE con propiedades auto-fluorescente. Transferir la solución BM licuado a un tubo de 1,5 ml y medir la emisión fluorescente de la solución usando un espectrofotómetro (longitud de onda de excitación = 370 nm; longitud de onda de emisión = 440 nm). SDS-PAGE análisis de bromuro de cianógeno péptidos Resolver los geles tratados con GLA y la GBR de control en un gel de poliacrilamida para confirmar que GLA ha inducido la reticulación y la formación de macro-fibras. Centrifugar la solución BM licuado recogido en el paso 2.1.1.2 a 10.000 xg durante 5 min a temperatura ambiente. Preparar una solución madre que contiene 2 g / ml de bromuro de cianógeno diluido en acetonitrilo. Precaución: Siempre manipule bromuro de cianógeno en una campana de humos mientras llevaba una bata de laboratorio, guantes, protector para la cara y el respirador. Eliminar el sobrenadante, volver a suspender el sedimento en gel BM en 500 l de 20 mg / ml de bromuro de cianógeno + 70% v / v de ácido fórmico y se incuba durante la noche a temperatura ambiente. Usar una jeringa desechable de 1 ml para transferir el sedimento resuspendido en gel de BM en un casete de diálisis con un corte de peso molecular 3,5 kDa. Sumergir el casete en un vaso de precipitados de vidrio de 500 ml que contiene 500 ml de agua doblemente destilada y una barra de agitación magnética.Coloque esto sobre un agitador magnético y se dializa durante una noche (16 horas) a 4 ° C (en un cuarto frío) para eliminar todas las trazas de bromuro de cianógeno y ácido fórmico. Usar una jeringa desechable de 1 ml para transferir la solución dializada BM de la casete en un tubo de 1,5 ml. Analizar 25 l de cada muestra de la BM en un gel de poliacrilamida v / v 12% 10,11. Después de SDS-PAGE, llevar a cabo la tinción con plata del gel de poliacrilamida 12 para visualizar el patrón electroforético de péptidos de bromuro de cianógeno-13 de matriz. El análisis de inmunofluorescencia microscopía Realizar la tinción de inmunofluorescencia de GLA tratar y controlar geles RBM con anti-AGE / pentosidine, anti-colágeno IV y anticuerpos anti-laminina seguido por microscopía confocal para visualizar los AGE acumulados y colágeno IV / reorganizaciones estructurales de fibra de laminina en el reticulado RBM geles 13. Nota: Utilice siempre un volumen suficiente para cubrir la entire gel de RBM durante las incubaciones y lavados sin tocar la superficie RBM con la punta de la pipeta. Para los detalles de analizar las culturas acinos 3D mediante inmunofluorescencia véase la referencia 6 y para microscopía confocal de acinos 3D véase la referencia 14. Wash GLA tratada y geles de control GBR en portaobjetos de cámara de 8 pocillos 2 veces con 300 l de PBS + (PBS que contiene 0,1 mM CaCl 2 y 0,5 mM MgCl 2) durante 5 min a RT. Retire la PBS + a continuación, añadir 300 l de 4% w / v paraformaldehído (PFA) diluido en PBS + para cubrir cada gel RBM. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente para fijar los componentes de gestión por resultados. Retire el 4% w / v solución de PFA. Añadir añadir 300 l de solución 75 mM NH4Cl + 0,5 mM MgCl 2 y se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente (repetir 5x) para extinguir la fijación. Prepare el buffer de inmunofluorescencia (IF buffer) al hacer la siguiente solución en agua estéril: NaCl 130 mM, 7 mM Na 2 HPO 4, 3,5 mM NaH2 PO 4, NaN 7,7 mM 3, 0.1% w / v albúmina de suero bovino, 0,5% v / v de polietileno glicol terc-octilfenil éter y 0,05% v / v de polietileno glicol monolaurato de sorbitán. Preparar tampón de bloqueo SI SI completándolo tampón con 20% de suero de cabra v / v. Eliminar la solución de enfriamiento y añadir 300 l de tampón de bloqueo SI a los geles de RBM para evitar reacciones no específicas. Se incuba 2 horas a temperatura ambiente en una plataforma de agitación. Retire el amortiguador de bloqueo SI e incubar los geles GBR para 16 horas a 4 ° C con 300 l de anticuerpo primario diluido en tampón de bloqueo SI (1: 500 de ratón anti-pentosidine mAb; 1/250 de conejo anti-colágeno IV pAb; 1 / 250 de conejo anti-laminina A / C pAB). Nota: Las incubaciones durante más de 20 horas a 4 ° C puede licuar la RBM. Retire el anticuerpo primario y lavar 3 veces (10 min cada una) con 300 l de tampón IF a temperatura ambiente en una plataforma de agitación. Eliminar el tampón IF yañadir 300 l de anticuerpo secundario (de cabra anti-conejo o anti-IgG de ratón [H + L]) conjugado con un fluorocromo diluido 1: 500 en tampón de bloqueo SI. Incubar durante 2 horas a temperatura ambiente en una plataforma de agitación. Eliminar el anticuerpo secundario e incubar en 300 l de tampón de IF de 10 min a temperatura ambiente. Retire el tampón IF y lavar 3 x 10 min en 300 l de PBS + a temperatura ambiente. Fijar y apagar una segunda vez, como se describió anteriormente (Pasos 2.3.1.2 y 2.3.1.3). Montar geles teñidos RBM en los medios de montaje y analizar la formación de densos paquetes de componentes principales utilizando epifluorescente o microscopía confocal. Nota: Para más detalles sobre el análisis de las culturas acinos 3D mediante inmunofluorescencia, véase la referencia 6 y para epifluorescencia y microscopía confocal de acinos 3D, véase la referencia 14. Análisis reológico Realizar análisis reométrico de GLA tratar y controlar geles RBM para medir su viscoelasticity (rigidez). Configurar geles de gestión por resultados que son de 1 mm de espesor en un molde circular con un diámetro de 8 mm. Para ello, colocar un anillo de clonación (8 mm de diámetro) dentro de un pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos y añadir BM solución matriz preparada como se describe en los pasos 1.3-1.6. Nota: Para la recapitulación exacta de los geles RBM utilizados para los experimentos, los geles RBM preparados para el análisis reométrico necesario tener la misma área de superficie y grosor que los geles RBM establecidos en las cámaras de 8 pocillos. Los geles RBM analizadas en la Figura 3 fueron de 1 mm de espesor y 8 mm de diámetro. El tratamiento de los geles de gestión por resultados establecidos en los anillos de clonación con PBS, GLA durante 6 horas y GLA durante 14 horas como se describió anteriormente (Pasos 1.8 a 1.11). Mida el módulo elástico (E) de los 8 mm de diámetro geles RBM en un reómetro con un 8 mm de placas paralelas geometría dentada, en un rango de 1 a 3% de deformación, a una oscilación de frecuencia fija de 1 Hz y una temperatura de 21 ° C. Para detalles adicionales sobre elanálisis reométrico de los geles de ECM ver referencias ver 13,15,16 referencia. Nota: E se determina a partir del módulo de almacenamiento de cizallamiento resultante (G ') a través del uso de la siguiente ecuación E = 2 * G' * (1 + v) donde v es la relación de 0,5 de Poisson, como se describe en referencia 13,15 , 16. 3. Cultura y manejo de la línea normal PEC, RWPE-1 Se cultivan las células en medio libre de suero de queratinocitos (KSFM) suplementado con 5 ng / ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF), 50 mg / ml de extracto de pituitaria bovina (BPE) y 50 U / ml de penicilina con 50 mg / ml de estreptomicina 1 RWPE-( completar KSFM). Nota: Para evitar la inducción de la transición epitelio-mesenquimal (EMT) -al igual que la transición no exponga células RWPE-1 al suero. Permitir completa KSFM para llegar a la temperatura ambiente durante 30 minutos después de la eliminación del almacenamiento a 4 ° C y no lo caliente en un baño de agua a 37 ° ya que esto inactivar el EGF y BPE. Aspirar la completaKSFM de una placa de 2 cm confluente de las células 10 RWPE-1, enjuague con 5 ml de PBS precalentado y añadir 5 ml de 0,05% v / v de tripsina de asegurar que todas las células están cubiertas con la solución. Colocar las células en un incubador de cultivo de tejido fijado en condiciones estándar de 37 ° C y 5% de CO 2 (con humidificación) durante 5 a 10 min. Comprobar el grado de tripsina después de 5 minutos y golpear suavemente la placa de cultivo para separar las células. Nota: Las celdas RWPE-1 no toleran largos períodos de tratamiento con tripsina por lo que se aconseja no manejar más de dos platos al mismo tiempo. También es importante para disociar todas las células de la placa para evitar la selección clonal. Cuando todas las células RWPE-1 han disociado, añadir 5 ml de PBS caliente que contienen 2% v v de suero / ternera fetal (FCS) para inactivar la tripsina. pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo para romper los agregados de células antes de transferir las células a un tubo de centrífuga. Centrifugar las células disociadas a 125-150 xg durante 5 min a 25 ° C, desechar el sobrenadante y volver a suspender el sedimento de células en 5 ml de completa KSFM hasta que se obtiene una suspensión de células individuales. Transferir 1 ml de las células resuspendidas en un nuevo tubo y añadir 9 ml de completa KSFM para propagar las células a una dilución 1: paso 5 para uso experimental posterior. Contar el resto de las células utilizando un hemocitómetro para la creación de acinos (véase la Sección 5.1). NOTA: NO cultivo células RWPE-1 durante más de 10 pasajes desde después de períodos prolongados de la cultura, no formen acinos con la arquitectura correcta. Cambiar los medios de cultivo cada 48 horas para asegurar el EGF y BPE permanecen activos. Nota: Integrar este cambio de medio de cualquier tratamiento que se extienden más allá de 48 horas. 4. Cultura y manejo de la línea celular HPB, HPB-1 células de cultivo de la HBP-1 en medio RPMI 1640 complementado con 5% v / v de FCS, 50 U / ml de penicilina y 50 mg / ml de estreptomicina. Se calienta lamedios de cultivo, PBS y 0,25% w / v solución de tripsina-EDTA 0,53 M a 37 ° C antes de su uso. Nota: Las células también pueden ser cultivadas en medios con 2,5% v / v FCS 8. Aspirar los medios de cultivo de una placa confluente cm 2 10 de las células HPB-1 y se lavan las células 2 x con 3 ml de PBS para eliminar todos los rastros de medios de cultivo con suero que pueden inactivar la reacción tripsina. Aspirar el PBS y añadir 3 ml de solución de tripsina-EDTA para cubrir las células. Colocar la placa en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2 (con humidificación) durante 5 min. Eliminar la solución de tripsina-EDTA cuando las células son redondas, pero permanecen unidos al plato. Lavar las células con 5 ml de PBS. Después de eliminar el PBS, añadir 5 ml de medio de cultivo y suavemente la pipeta hacia arriba y abajo para producir una suspensión de células individuales. Transferir las células a un tubo de 15 ml. Tomar 2 ml de la suspensión celular en un nuevo tubo de centrífuga con 8 ml de medio completo y la placa de las células HPB-1 ONTOA 10 cm 2 placa de cultivo a una dilución 1: paso 5 para uso experimental posterior. Contar el resto de las células utilizando un hemocitómetro para la creación de acinos (ver sección 5.2). Nota: Mantenga un registro del número de pases, ya que las células más viejas HPB-1 no forman acinos con una arquitectura adecuada. no se desea un número de pases más de 10. Cambiar los medios de cultivo cada 72 horas. 5. Cultura 3D de Próstata Acini sobre la GBR nativo y rígido Si se utilizan células RWPE-1 para formar acinos, diluir 5.000 células preparados en la etapa 3.5 en 300 l de completa KSFM suplementado con 2% v / v de la solución de BM. Si se utilizan células HPB-1 para formar acinos, diluir 2.500 células preparadas en el paso 4.5 en 300 l de RPMI 1640 medio de cultivo suplementado con 2% v / v de la solución de BM. Nota: Las celdas de la HBP-1 son más grandes que las células RWPE-1 para un menor número de células de HPB-1 se utilizan para obtener una distribución similar de los acinos después de 6 días de cultura. Semilla suavemente las células sobre la RBM nativa y AGE-rígido y con cuidado colocar las culturas en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2 (con humidificación) para asegurar una distribución uniforme de crecimiento acinos en el pozo y que cada célula se divide para producir un acina. Cada 2 días sustituyen a los medios de cultivo con medio de cultivo fresco que contenía solución v / v BM 2% para asegurar que las células han requerido de los factores de crecimiento para acina normales homeostasis. Monitorear la morfología acinares en cultivos en crecimiento mediante microscopía de campo claro 13. Nota: Después de 3 días en cultivo las células individuales formarán un grupo de> 3 células y después de 1 semana acinos glándula de la próstata con un diámetro de ~ serán observado 50 micras. Siga protocolo descrito en 2.3 para realizar inmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos para marcadores de adherencias célula-matriz, adherencias célula-célula, polaridad apico-basal y la invasividad 13. <li> Utilice un medio de montaje con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) o incluir un paso adicional (después de 2.3.12) para teñir los núcleos celulares por incubación con DAPI durante 5 minutos y lavar 2 x 5 minutos con PBS +. 6. Cultura 3D de próstata Los agregados de células tumorales en la GBR nativo y rígido células de cultivo de PC3 en RPMI 1640 que contiene 10% v / v de FCS y 50 U / ml de penicilina con 50 mg / ml de estreptomicina. Calentar los medios de cultivo, PBS y 0,25% w / v solución de tripsina-EDTA 0,53 M a 37 ° C antes de su uso. Aspirar el medio de cultivo de una placa de cultivo confluente 10 cm 2 de células PC3 y se lavan las células 2 veces con 3 ml de PBS para eliminar todos los rastros de FCS que pueden interrumpir la reacción tripsina. Aspirar el PBS y añadir 3 ml de solución de tripsina-EDTA para cubrir las células y se incuba durante 1 min. Cuando las células se redondean, pero permanecer unidos a los plato, aspirar cuidadosamente la solución de tripsina-EDTA y se lava con 3 ml de PBS aeliminar todo rastro de tripsina. Después de eliminar el PBS, añadir 5 ml de medio de cultivo y suavemente la pipeta hacia arriba y abajo para producir una suspensión de células individuales. Transferir las células a un tubo de 15 ml. Tomar 1 ml de la suspensión de células PC3 en un nuevo tubo de centrífuga y añadir 9 ml de medio de cultivo. Placa de las células en una placa de 10 cm 2 de cultivo (dilución 1:10) para uso experimental posterior. Contar las células restantes utilizando un hemocitómetro. Diluir 2.500 células PC3 preparados en la etapa 6.6 en 300 l de RPMI 1640 medio de cultivo suplementado con 2% v / v de la solución de BM para permitir la formación de un gel de gradiente en el cultivo. Sembrar suavemente las células sobre la RBM nativa y AGE-rígido y se coloca cuidadosamente la cultura en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2 (con humidificación) para asegurar una distribución uniforme de la creciente esferoides en el pozo. Cambiar los medios de cultivo cada 72 horas. Para estudiar el efecto de la GBR (EDAD-rica) rígidosobre la migración de las células tumorales de próstata, células PC3 de imagen utilizando microscopía de campo claro de vídeo de lapso de tiempo utilizando la temperatura / CO2 de control y una cámara húmeda 17. Nota: Las células PC3 crecen en mechones sobre la GBR nativa y no formen acinos con un lumen, pero si se deja de crecer más de 72 horas sobre la GBR nativa van a formar esferoides 3D. Después de la adquisición de datos, seguimiento manual de las células PC3 y calcular su velocidad de migración, la forma (relación de alargamiento) y la persistencia de la migración 17-19. Nota: Persistencia = relación D / T, D = distancia desde el principio hasta el final de la trayectoria celular, T = longitud total de la trayectoria de la célula.