Como Estudar Basement Membrane Rigidez como um gatilho Biofísica no cancro da próstata e outras patologias relacionadas com a idade ou Doenças Metabólicas

1. Indução da BM Rigidez induzida pela GLA Tratamento (reticulação não enzimática) Descongelar uma ampola congelada de matriz BM (10 ml) por incubação a 4 ° C (de pé sobre gelo numa câmara fria ou refrigerador) líquido até que o conteúdo do frasco se tornaram (8-16 h). Cuidado: Se um quarto frio / frigorífico não for utilizado, cobrir toda a garrafa com gelo. Isso vai evitar que a solução estoque da BM solidifique. Para experiências futuras e evitar os ciclos de descongelamento congelamento repetidas, preparar 25 x 0,4 mL de alíquotas de cada novo frasco de 10 ml da matriz BM. frascos armazenar a -80 ° C até o prazo de validade indicado pelo fabricante. Quando necessário, descongelar frascos a 4 ° C que estão em gelo durante 2 hr. Prepare uma superfície uniforme de gelo. Coloque uma lâmina de vidro câmara de 8 poços em cima de gelo para manter uma temperatura de 4 ° C durante o processo de revestimento. Descongelar um frasco de matriz BM a 4 ° C. Nota: Uma 0,4 ml frasco de matriz BM é suficiente para coat um slide de câmara de 1 x 8 poços inteiro. Manter o frasco coberto de gelo durante o manuseio para evitar a matriz BM solidifique. Cortar a extremidade de distribuição de uma ponteira 200 mL com uma tesoura. Resfriar o blunt-ended 200 mL ponta da pipeta para 4 ° C e coloque-a a um auxílio capacidade de pipetagem 200 mL. Tome-se 40 ul da solução fria matriz BM para a ponta da pipeta e transferi-lo para um poço no-8 bem lâmina de vidro câmara refrigerada. Nota: 40 ul de solução BM é suficiente para cobrir uma área de superfície de 0,8 cm2. Manter as pontas das pipetas refrigerados durante o procedimento de revestimento, para evitar a solidificação da solução BM. Não introduzir bolhas de ar na solução da matriz BM e assegurar que o poço é revestido uniformemente, sem a formação de um menisco visível nas bordas. Repetir o passo 1.4 de acordo com o número de poços necessários e câmaras. Após o revestimento, colocar a corrediça câmara de 8 poços a 37 ° C durante 30 min para promover a polimerizaçãoda BM. Feche a porta da incubadora com muito cuidado para evitar qualquer perturbação indesejada do RBM líquido. Não exceda o tempo de incubação de 30 min para evitar a desidratação do gel RBM. Nota: O gel resultante é o nativo reconstituído BM (RBM). O passo de incubação a 37 ° C não necessita de 5% de CO 2. No entanto, por conveniência realizar este passo num incubador de cultura de tecido fixada em 37 ° C e 5% de CO 2 (com humidificação). Prepare glicolaldeído 50 mM (ABL) diluído em tampão fosfato 0,2 M (pH 7,8). Esterilizar a solução por passagem através de um filtro de seringa de 0,22 micron utilizando uma seringa de 50 ml. Para uma reacção de reticulação, num volume final de 250 ul de GLA 50 mM, adicionar 25 ul de cianoboro-hidreto de sódio 0,5 M ou 2,5 M de aminoguanidina, a 125 ul de ABL 100 mM (2x estoque) e 100 ul de tampão fosfato 0,2 M (pH 7,8 ). Esterilizar a soluções de reserva, passando-os através de um filtro de seringa de 0,22 micron utilizando uma seringa de 50 ml. Cuidado: Pega cianoborohidreto de sódio vestindo um jaleco, luvas, máscaras de proteção e máscara, enquanto trabalhava em um exaustor. Adicionar 250 uL de solução de GLA a cobrir o gel RBM polimerizado e incubar a 37 ° C durante 6 horas para produzir um gel semi-rígida RBM ou 14 h para produzir um gel duro RBM. Nota: O volume de ABL adicionado deve cobrir o gel RBM polimerizada e deve ser ajustado em conformidade. Se forem utilizados diferentes tempos de incubação ABL, os géis RBM devem ser analisados ​​para determinar a vezes de aumento na RBM rigidez (ver Passo 2.4). Preparar um controlo negativo através da incubação de um gel nativo RBM em 250 ul de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS) durante 14 h a 37 ° C. Preparar dois controlos adicionais onde a formação da base de Schiff ou de Amadori aducto rearranjo durante a reacção de reticulação são inibidas, pela adição de cianoboro-hidreto de sódio a 50 mM ou 250 mM de aminoguanidina. Prepare 1 M de glicina eéster Thyl (GEE) diluído em PBS. Esterilizar a solução por passagem através de um filtro de seringa de 0,22 micron utilizando uma seringa de 50 ml. Após o tempo de incubação indicado, retire cuidadosamente a solução GLA dos géis RBM reticuladas, solução GLA contendo inibidores de géis RBM controle e PBS dos géis RBM nativos de controle. Adicionar 250 uL de solução de GEE para todos os géis RBM e incubar a 37 ° C durante 1 h. Nota: Esta etapa sacia a reacção de reticulação. Lave todos os géis RBM 10 vezes em 500 mL PBS para remover todos os vestígios de ABL e GEE. Incubar os géis RBM durante a noite a 37 ° C em 400 ul de PBS para impedir a sua desidratação. Analisar os géis RBM para a acumulação de AGE, de reticulação não enzimática e viscoelásticas propriedades (Passos 2,1-2,4). Para a análise Rheometric de suas propriedades viscoelásticas preparar os géis RBM em anéis de clonagem (passo 2.4). Para cultura de células, lavar géis RBM 2 vezes com 500 mL de cultura media antes da semeadura das células (etapas 5 e 6). Realizar lavagens suavemente, sem a ponta da pipeta tocar a superfície do gel. 2. Quantificação de não enzimática reticulação e rigidez da RBM Tratada com GLA análise fotométrica Medir a acumulação de AGE em GLA-tratada e controlar géis RBM usando análise fotométrica para determinar a extensão da reacção de Maillard. Após o passo 1.11, remover o PBS a partir de géis RBM nas lâminas de câmara de 8-poços e adicionar 250 mL de água bi-destilada gelada. Incubar a 4 ° C durante 16-24 h, para assegurar que a matriz é completamente liquefeitos. Nota: peptídeos RBM nesta solução conter as idades com propriedades auto-fluorescente. Transferir a solução BM liquefeito para um tubo de 1,5 ml e medir a emissão de fluorescência da solução utilizando um espectrofotómetro (excitação comprimento de onda = 370 nm; comprimento de onda de emissão = 440 nm). SDS-PAGE Análise de brometo de cianogénio Peptides Resolver os géis GLA-tratados e RBM controlo sobre um gel de poliacrilamida para confirmar que ABL tem induzido a reticulação e a formação de macro-fibras. Centrifugar a solução BM liquefeito recolhidas no passo 2.1.1.2 a 10.000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Prepara-se uma solução de estoque contendo 2 g / ml de brometo de cianogénio em acetonitrilo diluída. Cuidado: Sempre lidar com brometo de cianogênio em um exaustor enquanto usava um jaleco, luvas, máscaras de proteção e máscara. Remover o sobrenadante, re-suspender o sedimento em gel BM em 500 ul de 20 mg / ml de brometo de cianogénio + 70% v / v ácido fórmico e incubar durante a noite à TA. Usar uma seringa de 1 ml descartável para transferir o sedimento ressuspenso em gel BM numa cassete de diálise com um peso molecular de corte 3,5 kDa. Submerge a cassete numa proveta de vidro de 500 ml contendo 500 ml de água duplamente destilada e uma barra de agitação magnética.Coloque esta sobre um agitador magnético e diálise durante a noite (16 horas) a 4 ° C (numa sala fria) para remover todos os vestígios de brometo de cianogénio e ácido fórmico. Usar uma seringa de 1 ml descartável para transferir a solução dialisada BM a partir da cassete para um tubo de 1,5 ml. Analisar 25 uL de cada amostra sobre uma BM 12% de gel de poliacrilamida v / v 10,11. Após SDS-PAGE, coloração com prata realização do gel de poliacrilamida a 12 para visualizar o padrão electroforético de peptídeos de brometo de cianogénio-matriz 13. Análise de imunofluorescência Microscopia Execute coloração de imunofluorescência de ABL tratada e controlar géis RBM com anti-AGE / pentosidina, anti-colágeno IV e anticorpos anti-laminina seguido por microscopia confocal para visualizar AGEs acumulados e colágeno IV / rearranjos estruturais de fibra de laminina na RBM reticulado géis 13. Nota: Utilize sempre um volume suficiente para cobrir a entire gel RBM durante incubações e lavagens sem tocar a superfície do RBM com a ponta da pipeta. Para mais detalhes sobre a análise culturas acini 3D por imunofluorescência ver referência 6 e para a microscopia confocal de ácinos 3D ver a referência 14. Lavar ABL tratada e géis controlo RBM em lâminas de 8 poços câmara 2 vezes com 300 ul de PBS + (PBS contendo 0,1 mM de CaCl 2 e 0,5 mM de MgCl2) durante 5 min à TA. Remover o PBS +, em seguida, adicionar 300 uL de 4% w / v de paraformaldeído (PFA) diluída em PBS + para cobrir cada gel RBM. Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente para fixar os componentes RBM. Remover a 4% w / v solução de PFA. Adicionar 300 ul de adicionar mM NH 4 Cl + solução de 75 mM de MgCl 2, 0,5 e incubar durante 5 min à temperatura ambiente (repetir 5x) para extinguir a fixação. Preparar tampão de imunofluorescência (IF tampão), fazendo a seguinte solução em água estéril: 130 mM de NaCl, 7 mM de Na 2 HPO 4, 3,5 mM de NaH2 PO 4, 7,7 mM NaN 3, 0,1% w / v de albumina de soro bovino, 0,5% v / v de polietileno-glicol-terc-octilfenil éter e 0,05% v / v de polietilenoglicol sorbitano. Prepare IF tampão de bloqueio, completando tampão IF com 20% de soro de cabra v / v. Remover a solução de têmpera e adicione 300 ml de IF tampão de bloqueio aos géis RBM para evitar reações inespecíficas. Incubar 2 horas a RT em uma plataforma de agitação. Remover o tampão de bloqueio e incubar SE RBM os géis durante 16 horas a 4 ° C com 300 uL de anticorpo primário diluído em tampão de bloqueio SE (1: 500 de murganho anti-mAb pentosidina; 1/250 de coelho anti-colagénio IV pAb; 1 / 250 de coelho anti-laminina / C pAB). Nota: As incubações por mais de 20 horas, a 4 ° C pode liquidificar o RBM. Remover o anticorpo primário e lava-se 3 vezes (10 minutos cada) com 300 ul de tampão IF à temperatura ambiente numa plataforma de agitação. Remover o tampão de IF eadicionar 300 uL de anticorpo secundário (anticorpo de cabra anti-coelho ou anti-rato IgG [H + L]) conjugado com um fluorocromo diluído 1: 500 em tampão de bloqueio SE. Incubar durante 2 horas à temperatura ambiente numa plataforma de agitação. Remover o anticorpo secundário e incubar em 300 ul de tampão IF durante 10 min à temperatura ambiente. Remover o tampão de IF e lavar 3 x 10 min em 300 ul de PBS + à temperatura ambiente. Fix e extingue-se uma segunda vez, como descrito acima (Passos 2.3.1.2 e 2.3.1.3). Montar géis RBM manchadas nos meios de montagem e analisar a formação de feixes densos de componentes principais, utilizando epifluorescência ou microscopia confocal. Nota: Para mais informações sobre análise de culturas acini 3D por imunofluorescência ver referência 6 e de epifluorescência e microscopia confocal de ácinos 3D ver a referência 14. Análise reológica Realizar análise Rheometric de ABL tratada e controlar géis RBM para medir a sua viscoelasticity (rigidez). Configurar géis RBM que são 1 mm de espessura em um molde circular com um diâmetro de 8 mm. Para fazer isso, coloque um anel de clonagem (8 mm de diâmetro) dentro de um poço de uma placa de cultura de 24 cavidades e adicionar a BM solução de matriz preparados conforme descrito nos Passos 1,3-1,6. Nota: Para recapitulação precisa dos géis RBM utilizados para fins experimentais, os géis preparados para análise RBM Rheometric precisa de ter a mesma área de superfície e espessura que os géis RBM criadas em câmaras de 8 poços. Os géis RBM analisados ​​na Figura 3 foram de 1 mm de espessura e 8 mm de diâmetro. Trate os géis RBM criados nos anéis de clonagem com PBS, GLA durante 6 horas e GLA, durante 14 horas, como descrito acima (Passos 1.8 a 1.11). Medir o módulo de elasticidade (E) dos géis RBM 8 mm de diâmetro sobre um reómetro com 8 mm de placas paralelas serrilhadas geometria, ao longo de um intervalo de 1-3% de deformação, a uma frequência de oscilação fixa de 1 Hz e a temperatura de 21 ° C. Para detalhes adicionais sobre aanálise Rheometric de géis ECM ver referências ver 13,15,16 referência. Nota: E é determinada a partir da resultante módulo de armazenamento de cisalhamento (G '), através da utilização da seguinte equação E = 2 * L' * (1 + V) em que v é a razão de 0,5 de Poisson, conforme descrito em referência 13,15 , 16. 3. Cultura e manipulação da linha normal PEC, RWPE-1 Cresça RWPE-1 de células em meios isentos de soro de queratinócitos (KSFM) suplementado com 5 ng / ml de factor de crescimento epidérmico (EGF), 50 ug / ml de extracto de pituitária de bovino (BPE) e 50 U / ml de penicilina, com 50 ug / ml de estreptomicina ( completar KSFM). Nota: Para evitar a indução de epitelial-a-mesenquimal (EMT) -como transição não expõem células RWPE-1 ao soro. Permitir completa KSFM atingir a TA durante 30 min após a remoção de armazenamento a 4 ° C e não aquecido num banho de água a 37 ° C, pois isso irá inactivar o EGF e BPE. Aspirar o completoKSFM de um confluente 10 cm2 placa de células RWPE-1, lavar com 5 ml de PBS pré-aquecido e adicionar 5 ml de 0,05% v / v de tripsina de assegurar que todas as células são cobertas com a solução. Colocar as células numa incubadora de cultura de tecido fixado em condições padrão de 37 ° C e 5% de CO 2 (com humidificação) durante 5 a 10 min. Verificar a extensão da tripsinização após 5 minutos e bata suavemente na placa de cultura para separar as células. Nota: células RWPE-1 não toleram longos períodos de tripsinização por isso é aconselhado a não lidar com mais de duas placas ao mesmo tempo. É também importante a dissociar-se todas as células a partir da placa para evitar a selecção clonal. Quando todas as células RWPE-1 têm dissociado, adicionar 5 ml de PBS quente contendo 2% / v de soro fetal bovino v (FCS) para extinguir a tripsina. Pipeta suavemente cima e para baixo para romper os agregados de células antes da transferência das células para um tubo de centrífuga. Centrifugar as células dissociadas em 125-150 xg durante 5 min a 25 ° C, descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 5 ml de completa KSFM até se obter uma suspensão de células individuais. Transferir 1 ml das células ressuspensas para um novo tubo e adicionar 9 ml de completa KSFM para propagar as células numa diluição 1: passagem 5 para uso experimental subsequente. Contar o resto das células usando um hemocitômetro para a criação de ácinos (ver Secção 5.1). Nota: Não cultura células RWPE-1 para mais de 10 passagens desde após períodos prolongados de cultura que eles não formam ácinos com a arquitetura correta. Alterar os meios de cultura a cada 48 horas para garantir a EGF e BPE permanecem ativos. Nota: Incluir esta mudança de meio para quaisquer tratamentos que se estendem para além de 48 horas. 4. Cultura e manipulação da linha de células BPH, BPH-1 BPH-1 de células de cultura em meio RPMI 1640 complementado com 5% v / v de FCS, 50 U / ml de penicilina e 50 ug / ml de estreptomicina. aqueça omeios de cultura, PBS e 0,25% w / v de solução de tripsina-EDTA a 0,53 M a 37 ° C antes da utilização. Nota: As células também podem ser cultivadas em meios com 2,5% v / v de FCS 8. Aspirar o meio de cultura a partir de um confluente 10 cm2 placa de células BPH-1 e lava-se as células 2 x com 3 ml de PBS para remover todos os vestígios de meio de cultura com soro, que pode temperar a reacção tripsina. Aspirar o PBS e adicionar 3 ml de solução de tripsina-EDTA para cobrir as células. Colocar a placa numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2 (com humidificação) durante 5 min. Remover a solução de tripsina-EDTA, quando as células são redondas, mas manter-se ligada ao prato. Lavar as células com 5 ml de PBS. Após a remoção do PBS, adicionam-se 5 ml de meio de cultura e gentilmente pipeta-se para baixo e para produzir uma suspensão de células individuais. Transferir as células para um tubo de 15 ml. 2 ml da suspensão de células para um novo tubo de centrífuga com 8 mL de meio completo e a chapa células BPH-1 ontOA 10 cm2 placa de cultura a uma diluição de 1: 5 passagem para uso experimental subsequente. Contar o resto das células usando um hemocitômetro para a criação de ácinos (ver Secção 5.2). Nota: Mantenha um registro do número passagem, como as células mais velhas BPH-1 não formam ácinos com uma arquitectura adequada. Um número de passagens mais do que 10 não é desejado. Alterar os meios de cultura a cada 72 horas. 5. Cultura 3D da próstata Gland Acini na RBM Native e Stiff Se as células RWPE-1 estão a ser utilizados para formar ácinos, dilui-se 5000 células, preparado no passo 3.5, em 300 ul de KSFM completo suplementado com 2% v / v de solução BM. Se as células BPH-1 estão a ser utilizados para formar ácinos, diluir 2.500 células, preparado no passo 4.5, em 300 ul de meio RPMI 1640 meio de cultura suplementado com 2% v / v de solução BM. Nota: as células BPH-1 são maiores do que as células RWPE-1, de modo mais baixos números de células BPH-1 são utilizadas para se obter uma distribuição semelhante de ácinos após 6 dias de cultura. Suavemente semear as células para o RBM nativa e endureceu-AGE e cuidadosamente colocar as culturas numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2 (com humidificação) para assegurar uma distribuição uniforme de crescimento ácinos no bem e que cada célula se divide para produzir um acina. A cada 2 dias substituir o meio de cultura com meio de cultura fresco contendo 2% v / v de BM para assegurar que as células têm os factores de crescimento necessários para o normal acina homeostase. Monitorar morfologia acinar em culturas em crescimento por meio de microscopia de campo claro 13. Nota: Após 3 dias em cultura as células individuais vai formar um conjunto de células de> 3 e após 1 semana ácinos glândula da próstata com um diâmetro de ~ será observado 50 uM. Seguir o protocolo descrito no ponto 2.3 para executar imunofluorescência utilizando anticorpos específicos para os marcadores de adesões célula-matriz, adesões célula-célula, a polaridade APICO-basal e invasividade 13. <li> Use um meio de montagem com 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) ou incluir uma etapa adicional (após 2.3.12) para corar os núcleos das células por incubação com DAPI durante 5 minutos e lava-se 2 x 5 min com PBS +. 6. Cultura 3D de próstata Agregados tumor de células no RBM Native e Stiff Cultura de células PC3 em meio RPMI 1640 contendo 10% v / v de FCS e 50 U / ml de penicilina, com 50 ug / ml de estreptomicina. Aquece-se a meios de cultura, PBS e 0,25% w / v de solução de tripsina-EDTA a 0,53 M a 37 ° C antes da utilização. Aspirar o meio de cultura a partir de uma placa de cultura de 10 cm2 confluente de células PC3 e lavar as células 2x com 3 ml de PBS para remover todos os vestígios de FCS que podem extinguir a reacção de tripsina. Aspirar o PBS e adicionar 3 ml de solução de tripsina-EDTA para cobrir as células e incuba-se durante 1 min. Quando as células se tornam arredondadas, mas permanecer ligada ao prato, aspirar cuidadosamente a solução de tripsina-EDTA e lava-se com 3 ml de PBS pararemover todos os vestígios de tripsina. Após a remoção do PBS, adicionam-se 5 ml de meio de cultura e gentilmente pipeta-se para baixo e para produzir uma suspensão de células individuais. Transferir as células para um tubo de 15 ml. Tomar 1 ml da suspensão de células PC3 para um novo tubo de centrifugação e adicionar 9 ml de meio de cultura. Placa as células em um prato de 10 cm 2 de cultura (1:10) para uso experimental subsequente. Contar as células restantes usando um hemocitômetro. Diluir 2.500 células PC3 preparadas na etapa 6.6, em 300 ul de meio RPMI 1640 meio de cultura suplementado com 2% v / v de solução de BM para permitir a formação de um gel de gradiente na cultura. Gentilmente semear as células para a RBM nativa e endureceu-AGE e coloque cuidadosamente a cultura na incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2 (com umidificação) para assegurar uma distribuição de crescer esferóides no poço. Alterar os meios de cultura a cada 72 horas. Para estudar o efeito da dura RBM (rico em AGE)na migração de células tumorais da próstata, imagem células PC3 usando vídeo brightfield microscopia de lapso de tempo usando temperatura / CO 2 controle e uma câmara úmida 17. Nota: células PC3 crescer em fios sobre RBM nativa e não fazem ácinos com um lúmen, mas se deixou de crescer mais de 72 horas na RBM nativa eles vão formar esferóides 3D. Após a aquisição de dados, controlar manualmente as células PC3 e calcular sua velocidade de migração, de forma (relação de alongamento) e persistência da migração 17-19. Nota: Persistência = relação D / T, D = distância do início ao fim da trajetória celular, T = comprimento total da trajetória celular.