How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases

Mercedes Rodriguez-Teja; Claudia Breit; Mitchell Clarke; Kamil Talar; Kai Wang; Mohammad A. Mohammad; Sage Pickwell; Guillermina Etchandy; Graeme J. Stasiuk; Justin Sturge

doi:10.3791/54230

JoVE Journal > Cancer Research

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Cancer Research

كيفية دراسة بدروم غشاء تصلب بمثابة الزناد البيوفيزيائية في سرطان البروستاتا وعلوم الأمراض الأخرى ذات الصلة العمر أو الأمراض الاستقلابية

Published: September 20, 2016

doi:

10.3791/54230

Mercedes Rodriguez-Teja¹, Claudia Breit², Mitchell Clarke³, Kamil Talar³, Kai Wang³, Mohammad A. Mohammad³, Sage Pickwell³, Guillermina Etchandy¹, Graeme J. Stasiuk³, Justin Sturge³

¹Departamento de Genética, Facultad de Medicina,Universidad de la República (UDELAR), ²Department of Mechanistic Cell Biology,Max Planck Institute of Molecular Physiology, ³School of Biological, Biomedical & Environmental Sciences,University of Hull

Summary

نحن هنا شرح بروتوكول لنمذجة المكروية الفيزيائية الحيوية حيث يشابك وزيادة تصلب الغشاء القاعدي (BM) الناجم عن endproducts غلكأيشن المتقدم (أجس) له أهمية المرضية.

Abstract

نحن هنا وصف بروتوكول التي يمكن استخدامها لدراسة المكروية الفيزيائية الحيوية ذات الصلة إلى زيادة سماكة وتصلب الغشاء القاعدي (BM) خلال الأمراض المرتبطة بالعمر واضطرابات التمثيل الغذائي (مثل السرطان والسكري وأمراض الاوعية الدموية الدقيقة، واعتلال الشبكية، اعتلال الكلية والاعتلال العصبي) . فرضية من هذا النموذج هو يشابك غير الأنزيمية من BM (RBM) المصفوفة التي أعيد تنظيمها العلاج مع glycolaldehyde (GLA) لتعزيز المتقدمة غلكأيشن endproduct (AGE) جيل عن طريق تفاعل ميلارد. تعامل أمثلة من التقنيات المخبرية التي يمكن استخدامها لتأكيد جيل AGE، يشابك غير الأنزيمية وزيادة صلابة في GLA ترد الإدارة القائمة على النتائج. وتشمل هذه إعداد الإدارة القائمة على النتائج الأم (تعامل مع الفوسفات مخزنة المالحة، PBS) وتصلب الإدارة القائمة على النتائج (تعامل مع GLA) لتحديد ما يلي: محتوى AGE من خلال تحليل الضوئية والفحص المجهري مناعي، يشابك غير الأنزيمية من قبل الصوديوم دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميدالكهربائي للهلام (SDS PAGE)، وكذلك الفحص المجهري متحد البؤر، وفي زيادة صلابة باستخدام rheometry. الإجراء الموضح هنا يمكن أن تستخدم لزيادة صلابة (الرجوعية المرنة، E) الإدارة القائمة على النتائج تصل إلى 3.2 أضعاف، بما يتفق مع القياسات التي أجريت في الاصحاء المريضة أنسجة البروستاتا البشرية. لإعادة المكروية الفيزيائية الحيوية المرتبطة بالشيخوخة والبروستات غدة المريضة أدخلت ثلاثة أنواع خلايا البروستاتا إلى الإدارة القائمة على النتائج المحلية وتصلب الإدارة القائمة على النتائج: RWPE-1، الخلايا الظهارية البروستاتا (المتوقَّع (PECs)) المشتقة من غدة البروستاتا الطبيعية. BPH-1، المتوقَّع (PECs) المستمدة من غدة البروستاتا تتأثر تضخم البروستاتا الحميد (BPH). وPC3، الخلايا المتنقل المستمدة من سرطان العظم الثانوي القادمة من سرطان البروستاتا. ويمكن قياس معلمات متعددة، بما في ذلك حجم وشكل وخصائص الغازية من عنيبات غدي 3D التي شكلتها RWPE-1 و BPH-1 على مواطن مقابل تصلب الإدارة القائمة على النتائج، ومتوسط طول الخلية، وسرعة المهاجرة واستمرار حركة الخلية من spher 3Dالكويكبات التي شكلتها خلايا PC3 تحت نفس الظروف. خلية مسارات الإشارات وتوطين التحت خلوية من البروتينات يمكن أيضا تقييم.

Introduction

The basement membrane (BM) is a sheet of specialized extracellular matrix (ECM) that maintains stable tissue borders by separating layers of epithelial cells from the stroma¹. Covalent crosslinking between adjacent triple helices of collagen IV in the BM stabilizes their lateral association by establishing an irregular network of super-twisted helices². These collagen IV lattices act as a scaffold for its interaction with laminin and other BM components¹. The structural arrangement of the BM provides it with the mechanical strength and rigidity necessary for the normal development of glandular epithelia³.

During aging and disease the BM progressively thickens and stiffens^3,4. For example, a 3-fold increase in the elastic modulus (E) of the ocular BM occurs between the ages of 50 and 80 in the normal population, and this stiffening is further exacerbated in metabolic disorders like diabetes⁵. The structural and biomechanical changes in the BM that result in its increased stiffness occur when its ECM components, collagen IV and laminin, become non-enzymatically crosslinked following their exposure to advanced glycation endproducts (AGEs).

The purpose of the method described here was to establish a model for the investigation of how BM stiffness, due to AGE exposure, promotes prostate epithelial cell (PEC) and prostate tumour cell (PTC) invasiveness in the context of the switch to metastatic prostate cancer (PCa). To do this a previous method used for generating 3D glandular acini from mammary epithelial cells (MECs) in reconstituted rBM gels⁶ was adapted to include an additional step where the rBM gels are pre-treated with glycolaldehyde (GLA). Several techniques for assessing GLA induced crosslinking and stiffening of pre-treated rBM gels are described, including photometric analysis, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE), confocal microscopy and rheometric analysis. The prostate cell types selected for culture on the pre-stiffened rBM include: RWPE-1, PECs derived from a normal prostate gland⁷; BPH-1, PECs derived from a prostate gland affected by BPH⁸; and PC3, metastatic PTCs derived from a secondary tumor located in the vertebral bone of a prostate cancer (PCa) patient⁹.

In addition to advancing the study of prostate gland pathology, the protocol for stiffening of rBM gels by their treatment with GLA can be adapted to investigate how BM stiffness contributes to other age-related pathologies and metabolic disorders. For example, the model can be directly applied to investigate how metastatic cancer is induced by BM stiffness in organs such as the breast, colon, ovary and pancreas by the incorporation of appropriate cell types. Furthermore, the protocol can be adapted to investigate how stiff BM promotes biomechanical mechanisms of disease progression in diabetes-related microvascular disease, retinopathy, nephropathy and neuropathy.

Protocol

1. تحريض BM تصلب المستحث بواسطة GLA المعاملة (يشابك غير الأنزيمية) ذوبان الجليد قارورة المجمدة من BM مصفوفة (10 مل) التي يحتضنها عند 4 درجات مئوية (واقفا على الجليد في غرفة باردة أو الثلاجة) السائل حتى أصبحت محتويات القارورة (8-16 ساعة). تحذير: إذا لم يتم استخدام غرفة / الثلاجة الباردة، تغطية زجاجة كاملة مع الثلج. وهذا يمنع حل سهم BM من التصلب. في التجارب المستقبلية وتجنب تكرار دورات ذوبان التجميد، وإعداد 25 × 0.4 مل قسامات من كل جديد 10 مل قارورة من BM المصفوفة. مخزن قارورة في -80 درجة مئوية حتى تاريخ انتهاء الصلاحية المشار إليها من قبل الشركة المصنعة. عند الحاجة، وذوبان الجليد قارورة في 4 درجات مئوية واقفا على الجليد لمدة 2 ساعة. إعداد حتى سطح الجليد. وضع 8 جيدا الشرائح غرفة زجاجية على رأس الجليد للحفاظ على درجة حرارة 4 درجات مئوية خلال إجراء الطلاء. ذوبان الجليد قارورة من BM مصفوفة في 4 درجات مئوية. ملاحظة: واحد 0.4 مل قارورة من BM مصفوفة كافية لالصر على كامل الشريحة غرفة 1 × 8 جيدا. إبقاء قنينة مغطاة بالثلج أثناء التعامل مع لمنع مصفوفة BM من التصلب. قطع نهاية الاستغناء عن ماصة 200 ميكرولتر باستخدام المقص. تبريد كليلة العضوية 200 ميكرولتر ماصة إلى 4 درجات مئوية ووضعه على لمساعدات قدرة pipetting ل200 ميكرولتر. تناول 40 ميكرولتر من حل مصفوفة BM البارد في تلميح ماصة ونقلها في بئر على المبردة 8 جيدا الشرائح غرفة زجاجية. ملاحظة: 40 ميكرولتر من حل BM ما يكفي لتغطية مساحة قدرها 0.8 سم 2. الحفاظ على نصائح ماصة المبرد أثناء إجراء طلاء لتجنب تصلب الحل BM. لا يعرض فقاعات الهواء إلى حل مصفوفة BM وضمان مغلفة جيدا بالتساوي دون تشكيل الغضروف المفصلي مرئية عند الحواف. كرر الخطوة 1.4 وفقا لعدد من الآبار والدوائر المطلوبة. بعد طلاء، ضع الشريحة الغرفة 8 جيدا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتعزيز البلمرةمن BM. إغلاق باب الحاضنة بعناية فائقة لتجنب اضطراب غير مرغوب فيه من الإدارة القائمة على النتائج السائلة. لا تتجاوز فترة حضانة 30 دقيقة لتجنب الجفاف من هلام الإدارة القائمة على النتائج. ملاحظة: هلام الناتج هو الأصلي أعيد BM (RBM). لا يتطلب C حضانة خطوة 37 درجة 5٪ CO 2. ومع ذلك، من أجل راحة تنفيذ هذه الخطوة في حاضنة زراعة الأنسجة وضعت في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 (مع الترطيب). تجهيز 50 ملي glycolaldehyde (GLA) المخفف في 0.2 م العازلة الفوسفات (درجة الحموضة 7.8). تعقيم الحل عن طريق تمرير من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرون باستخدام حقنة 50 مل. لرد فعل يشابك في الحجم النهائي من 250 ميكرولتر من 50 ملي GLA، إضافة 25 ميكرولتر من 0.5 M سيان بورهيدريد الصوديوم أو 2.5 M أمينوغوانيدين إلى 125 ميكرولتر من 100 ملي GLA (2X الأسهم) و 100 ميكرولتر من 0.2 M الفوسفات العازلة (الرقم الهيدروجيني 7.8 ). تعقيم حلول الأوراق المالية من قبل تمريرها من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرون باستخدام حقنة 50 مل. تحذير: التعامل مع سيان بورهيدريد الصوديوم يرتدي معطف المختبر، والقفازات، faceshield والتنفس الصناعي بينما كان يعمل في غطاء الدخان. إضافة 250 ميكرولتر من حل GLA لتغطية هلام الإدارة القائمة على النتائج بلمرة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات لإنتاج الإدارة القائمة على النتائج هلام شبه قاسية أو 14 ساعة لإنتاج مادة هلامية الإدارة القائمة على النتائج قاسية. ملاحظة: وارتفع حجم GLA يجب أن تغطي جل الإدارة القائمة على النتائج بلمرة، وينبغي تبعا لذلك. إذا تم استخدام مختلف الأوقات حضانة GLA، وينبغي تحليل المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج لتحديد-زيادة أضعاف في الإدارة القائمة على النتائج صلابة (انظر الخطوة 2.4). إعداد السيطرة السلبية التي يحتضنها هلام الإدارة القائمة على النتائج الأصلي في 250 ميكرولتر من العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لمدة 14 ساعة على 37 درجة مئوية. إعداد عنصري تحكم إضافية حيث يتم تحول دون تشكيل قاعدة شيف أو Amadori ناتج إضافة إعادة ترتيب خلال رد فعل يشابك، من خلال إضافة 50 ملي سيان بورهيدريد الصوديوم أو 250 ملي أمينوغوانيدين. إعداد 1 M الجلايسين هthyl استر (جي) المخفف في برنامج تلفزيوني. تعقيم الحل عن طريق تمرير من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرون باستخدام حقنة 50 مل. بعد فترة حضانة المشار إليه، وإزالة بعناية حل GLA من المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج crosslinked، حل GLA التي تحتوي على مثبطات من المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج السيطرة وبرنامج تلفزيوني من السيطرة على المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج الأم. إضافة 250 ميكرولتر من محلول جي لجميع المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. ملاحظة: هذه الخطوة يروي رد فعل يشابك. يغسل كل المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج 10 مرات في 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني لإزالة كل آثار للتأجير وجي. احتضان المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لمنع الجفاف بهم. تحليل المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج لتراكم AGE، يشابك غير الأنزيمية واللزجة خصائص (خطوات 2،1-2،4). لتحليل rheometric ممتلكاتهم اللزجة إعداد المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج في حلقات الاستنساخ (الخطوة 2.4). لزراعة الخلايا، وشطف المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج 2 مرات مع 500 ميكرولتر الثقافة ليديا قبل البذر الخلايا (الخطوات 5 و 6). أداء يغسل بلطف دون طرف ماصة لمس سطح هلام. 2. الكمي لغير الأنزيمية يشابك وتصلب الإدارة القائمة على النتائج المعالجة مع GLA تحليل الضوئية قياس تراكم AGE في GLA المعاملة والسيطرة على المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج باستخدام التحليل الضوئية لتحديد مدى تفاعل ميلارد. بعد الخطوة 1.11، إزالة برنامج تلفزيوني من المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج في 8 آبار الشرائح الغرفة وإضافة 250 ميكرولتر الماء المقطر المزدوج الجليد الباردة. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 16-24 ساعة للتأكد من أن مصفوفة المسال تماما. ملاحظة: الببتيدات الإدارة القائمة على النتائج في هذا الحل تحتوي على أجس مع خصائص السيارات الفلورسنت. نقل الحل BM المسال إلى أنبوب 1.5 مل وقياس الانبعاثات الفلورسنت من الحل باستخدام مقياس الطيف الضوئي (الطول الموجي الإثارة = 370 نانومتر، الانبعاثات الطول الموجي = 440 نانومتر). SDS-PAGE تحليل السيانوجين بروميد الببتيدات حل المواد الهلامية المعاملة GLA ومراقبة الإدارة القائمة على النتائج على هلام بولي أكريلاميد للتأكد من أن GLA قد يسببها يشابك وتشكيل ألياف الماكرو. أجهزة الطرد المركزي في حل BM المسال التي تم جمعها في الخطوة 2.1.1.2 في 10000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يعد حل الأسهم التي تحتوي على 2 غرام / مل من بروميد السيانوجين مخففة في الأسيتونتريل. تحذير: التعامل دائما بروميد السيانوجين في غطاء الدخان في حين يرتدي معطف المختبر، والقفازات، faceshield وأجهزة التنفس الصناعي. إزالة طاف، وإعادة تعليق هلام بيليه BM في 500 ميكرولتر من 20 ملغ / مل بروميد السيانوجين + 70٪ ت / ت حمض الفورميك واحتضان بين عشية وضحاها في RT. استخدام 1 مل حقنة واحدة لنقل معلق BM هلام بيليه في كاسيت لغسيل الكلى مع الوزن الجزيئي قطع 3.5 كيلو دالتون. غمر الكاسيت في كوب زجاج 500 مل تحتوي على 500 مل من الماء المقطر المزدوج وشريط مغناطيسي.وضع هذا على محرك مغناطيسي وdialyze بين عشية وضحاها (16 ساعة) في 4 درجات مئوية (في غرفة باردة) لإزالة كل آثار بروميد السيانوجين وحمض الفورميك. استخدام 1 مل حقنة واحدة لنقل الحل BM مدال من الكاسيت في أنبوب 1.5 مل. تحليل 25 ميكرولتر من كل عينة BM على 12٪ ت / ت هلام بولي أكريلاميد 10،11. بعد SDS-PAGE، تنفيذ تلطيخ الفضة من هلام بولي أكريلاميد 12 لتصور نمط الكهربي من الببتيدات السيانوجين بروميد مصفوفة 13. تحليل مناعي المجهر أداء مناعي تلطيخ للتأجير معالجتها والسيطرة على المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج مع anti-AGE / pentosidine، ومكافحة الكولاجين الرابع وأضداد laminin تليها المجهري متحد البؤر لتصور أجس المتراكمة والكولاجين الرابع / الألياف laminin إعادة ترتيب الهيكلية في الإدارة القائمة على النتائج crosslinked المواد الهلامية 13. ملاحظة: دائما استخدام كمية كافية لتغطية انتيإعادة هلام الإدارة القائمة على النتائج خلال حضانات ويغسل دون لمس السطح الإدارة القائمة على النتائج مع طرف ماصة. للحصول على تفاصيل تحليل الثقافات عنيبات 3D المناعي انظر المرجع 6 وللفحص المجهري متحد البؤر من عنيبات 3D أنظر المرجع 14. غسل GLA المعالجة والمواد الهلامية تحكم الإدارة القائمة على النتائج في الشرائح 8 آبار غرفة 2 مرات مع 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني + (PBS تحتوي على 0.1 ملي CaCl 2 و 0.5 ملي MgCl 2) لمدة 5 دقائق على RT. إزالة برنامج تلفزيوني + ثم إضافة 300 ميكرولتر من 4٪ ث / ت امتصاص العرق (PFA) المخفف في برنامج تلفزيوني + لتغطية كل هلام الإدارة القائمة على النتائج. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإصلاح مكونات الإدارة القائمة على النتائج. إزالة 4٪ ث / ت حل PFA. إضافة إضافة 300 ميكرولتر من 75 ملي NH 4 الكلور + 0.5 ملي MgCl 2 الحل واحتضان لمدة 5 دقائق على RT (اكرر 5X) لإرواء التثبيت. إعداد عازلة المناعي (IF عازلة) بجعل حل التالية في العقيمة المياه: 130 مم كلوريد الصوديوم، 7 ملي نا 2 هبو 4، 3.5 مم ناه2 ص 4، 7.7 مم نان 3، 0.1٪ ث / ت زلال المصل البقري، و 0.5٪ ت / ت البولي ايثيلين جلايكول ثالثي octylphenyl الأثير و 0.05٪ ت / ت البولي ايثيلين جلايكول صوربيتان monolaurate. إعداد IF عازلة تمنع من خلال استكمال إذا عازلة مع 20٪ ت / ت مصل الماعز. إزالة حل تبريد وإضافة 300 ميكرولتر من IF عازلة تمنع والمواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج لمنع التفاعلات الغير مرغوب فيها. احتضان 2 ساعة على RT على منصة تهتز. إزالة المنطقة العازلة الحجب إذا واحتضان المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج لمدة 16 ساعة في 4 درجات مئوية مع 300 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية مخففة في IF عازلة تمنع (1: 500 الماوس مكافحة pentosidine ماب، 1/250 أرنب المضادة للالكولاجين الرابع PAB، 1 / 250 أرنب مكافحة laminin A / C PAB). ملاحظة: حضانات لمدة أطول من 20 ساعة على 4 درجات مئوية يمكن liquidize الإدارة القائمة على النتائج. إزالة الأجسام المضادة الأولية ويغسل 3 مرات (10 دقيقة لكل منهما) مع 300 ميكرولتر من العازلة IF في درجة حرارة الغرفة على منصة تهتز. إزالة المنطقة العازلة إذا وإضافة 300 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية (الماعز المضادة للأرنب أو المضادة للماوس مفتش [H + L]) مترافق مع تألقي المخفف 1: 500 في IF عازلة تمنع. احتضان لمدة 2 ساعة على RT على منصة تهتز. إزالة الأجسام المضادة الثانوية واحتضان في 300 ميكرولتر من العازلة إذا لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة المنطقة العازلة إذا وغسل 3 × 10 دقيقة في 300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني + في درجة حرارة الغرفة. إصلاح ويطفئ مرة ثانية، كما هو موضح أعلاه (خطوات 2.3.1.2 و2.3.1.3). جبل الهلام الملون الإدارة القائمة على النتائج في وسائل الإعلام تصاعد وتحليل تشكيل حزم كثيفة من المكونات الرئيسية باستخدام epifluorescent أو المجهري متحد البؤر. ملاحظة: للحصول على تفاصيل تحليل الثقافات عنيبات 3D المناعي انظر المرجع 6 وepifluorescent والفحص المجهري متحد البؤر من عنيبات 3D أنظر المرجع 14. تحليل الريولوجية لتحليل rheometric للتأجير المعالجة والسيطرة على المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج لقياس لهم ضدiscoelasticity (تصلب). إعداد المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج التي هي 1 مم في قالب دائري بقطر 8 مم. للقيام بذلك، ضع حلقة الاستنساخ (8 مم) داخل بئر من لوحة ثقافة 24-جيدا وإضافة BM حل مصفوفة أعد كما هو موضح في خطوات 1،3-1،6. ملاحظة: للحصول على خلاصة دقيقة من المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج المستخدمة في التجارب، والمواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج التي أعدت لتحليل rheometric تحتاج إلى الحصول على نفس المساحة السطحية وسمك مثل الهلام الإدارة القائمة على النتائج التي أنشئت في غرف 8 جيدا. وكانت المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج التي تم تحليلها في الشكل 3 1 مم و 8 مم في القطر. علاج المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج التي أنشئت في الحلقات الاستنساخ مع برنامج تلفزيوني، GLA عن 6 ساعات وتأجير لمدة 14 ساعة كما هو موضح أعلاه (خطوات 1،8 حتي 1،11). قياس معامل المرونة (E) من 8 مم المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج على مقياس غلفاني مع 8 ملم لوحة موازية مسنن الهندسة، على مجموعة من٪ سلالة 1-3، في التذبذب تردد ثابت لل1HZ ودرجة الحرارة من 21 درجة مئوية. للحصول على تفاصيل إضافية حولتحليل rheometric من المواد الهلامية ECM يرى المراجع ترى 13،15،16 المرجعية. ملاحظة: يتم تحديد E من الناتج معامل التخزين القص (G ') من خلال استخدام المعادلة التالية E = 2 * G' * (1 + ت) حيث v هي نسبة بواسون 0.5، كما هو موضح في إشارة 13،15 16. 3. الثقافة والتعامل مع خط عادي PEC، RWPE-1 تنمو RWPE-1 الخلايا في وسائل الإعلام الحرة المصل القرنية (KSFM) تستكمل مع 5 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة (EGF)، 50 ميكروغرام / مل استخراج الغدة النخامية البقري (BPE)، و 50 U / البنسلين مل مع 50 ميكروغرام / مل الستربتومايسين ( استكمال KSFM). ملاحظة: لتجنب تحريض-الظهارية لالوسيطة (EMT) تشبه الانتقال لا تعرض خلايا RWPE-1 إلى مصل. السماح الكامل KSFM للوصول RT لمدة 30 دقيقة بعد إزالة من تخزين عند 4 درجات مئوية، ولا يطيقون في 37 ° C حمام الماء حيث سيؤدي ذلك إلى تعطيل صندوق تعديل العولمة الأوروبي وBPE. نضح كاملةKSFM من سم 2 لوحة متكدسة 10 من RWPE-1 الخلايا، وشطف مع 5 مل من قبل تحسنت برنامج تلفزيوني وإضافة 5 مل من 0.05٪ ت / ت التربسين ضمان تغطية جميع الخلايا مع الحل. وضع الخلايا في نسيج الثقافة الحاضنة وضعت في ظروف قياسية من 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 (مع الترطيب) لمدة 5 إلى 10 دقائق. تحقق من مدى trypsinization بعد 5 دقائق والاستفادة بلطف لوحة الثقافة لفصل الخلايا. ملاحظة: RWPE-1 الخلايا لا يتسامح مع فترات طويلة من trypsinization ذلك ينصح بعدم التعامل مع أكثر من اثنين من لوحات في نفس الوقت. ومن المهم أيضا أن يفرق كل الخلايا من لوحة لتجنب اختيار نسيلي. عندما نأت جميع الخلايا RWPE-1، إضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني الدافئة التي تحتوي على 2٪ ت / ت مصل العجل الجنين (FCS) لإخماد التربسين. ماصة بلطف صعودا وهبوطا لتفريق المجاميع الخلية قبل نقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي. الطرد المركزي الخلايا نأت على 125-150 سز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة 25 درجة مئوية، وتجاهل طاف وإعادة تعليق بيليه الخلايا في 5 مل من اكتمال KSFM حتى يتم الحصول على تعليق من الخلايا وحيدة. نقل 1 مل من الخلايا إعادة علقت في أنبوب جديد وإضافة 9 مل من اكتمال KSFM لنشر خلايا في 1: مرور التخفيف 5 للاستخدام التجريبي لاحقا. حساب بقية الخلايا باستخدام عدادة الكريات لإقامة عنيبات (انظر القسم 5.1). ملاحظة: لا هل الثقافة RWPE-1 خلايا لأكثر من 10 الممرات منذ فترات بعد فترات طويلة من الثقافة التي لا تشكل عنيبات مع بنية صحيحة. تغيير ثقافة وسائل الإعلام كل 48 ساعة لضمان EGF وBPE تبقى نشطة. ملاحظة: تضمين هذا التغيير المتوسطة لأي من العلاجات التي تتجاوز 48 ساعة. 4. الثقافة والمناولة من الخط خلية BPH، BPH-1 ثقافة BPH-1 الخلايا في RPMI 1640 وسائل الإعلام تستكمل مع 5٪ ت / ت FCS، 50 U / البنسلين مل و 50 ميكروغرام / مل الستربتومايسين. تدفئةوسائل الإعلام والثقافة، وبرنامج تلفزيوني و 0.25٪ ث / ت التربسين- 0.53 M EDTA الحل إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. ملاحظة: يمكن أيضا مثقف الخلايا في وسائل الإعلام مع 2.5٪ ت / ت FCS 8. نضح في وسائل الإعلام ثقافة من سم 2 لوحة متكدسة 10 من BPH-1 الخلايا وغسل الخلايا 2 × مع 3 مل من برنامج تلفزيوني لإزالة كل آثار للثقافة وسائل الإعلام مع المصل التي قد تطفئ رد فعل التربسين. نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة 3 مل من محلول التربسين-EDTA لتغطية الخلايا. وضع لوحة في مجموعة حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 (مع الترطيب) لمدة 5 دقائق. إزالة الحل التربسين-EDTA عند الخلايا هي الجولة ولكن لا تزال تعلق على طبق. غسل الخلايا مع 5 مل من برنامج تلفزيوني. بعد إزالة برنامج تلفزيوني، إضافة 5 مل من وسائل الإعلام والثقافة، وبلطف ماصة صعودا وهبوطا لإنتاج تعليق خلايا مفردة. نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل. تأخذ 2 مل من تعليق الخلية في أنبوب الطرد المركزي الجديدة مع 8 مل من وسائل الاعلام كاملة ولوحة من BPH-1 خلايا ونطالزراعة العضوية 10 لوحة الثقافة سم 2 في 1: مرور التخفيف 5 للاستخدام التجريبي لاحقا. حساب بقية الخلايا باستخدام عدادة الكريات لإقامة عنيبات (انظر القسم 5.2). ملاحظة: احتفظ بسجل لعدد مرور، كما أقدم خلايا BPH-1 لا تشكل عنيبات مع بنية سليمة. عدم رغبتك عدد مرور أكثر من 10. تغيير ثقافة وسائل الإعلام كل 72 ساعة. 5. 3D ثقافة غدة البروستاتا عنيبات على الإدارة القائمة على النتائج الأصليين وتصلب إذا كان يتم استخدام RWPE-1 الخلايا لتشكيل عنيبات، وتمييع 5000 خلايا أعدت في الخطوة 3.5 في 300 ميكرولتر من اكتمال KSFM تستكمل مع 2٪ ت / ت من حل BM. إذا كان يتم استخدام BPH-1 الخلايا لتشكيل عنيبات، وتمييع 2500 خلايا أعدت في الخطوة 4.5 في 300 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة RPMI 1640 تستكمل مع 2٪ ت / ت من حل BM. ملاحظة: BPH-1 الخلايا هي أكبر من RWPE-1 الخلايا بحيث انخفاض أعداد BPH-1 خلايا تستخدم للحصول على توزيع مماثل من عنيبات بعد 6 أيام من طريق مسدودتلح. البذور بلطف الخلايا على الإدارة القائمة على النتائج الأم وتشديد AGE وبعناية وضع الثقافات في مجموعة حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 (مع الترطيب) لضمان توزيع عادل لزراعة عنيبات في البئر وأن كل تنقسم فيها الخلية لإنتاج acina واحد. كل أيام 2 استبدال ثقافة وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام ثقافة جديدة تحتوي على 2٪ حل ت / ت BM لضمان أن الخلايا قد عوامل النمو اللازمة لacina الطبيعي التوازن. مراقبة عنيبية التشكل في الثقافات المتزايدة باستخدام brightfield المجهري 13. ملاحظة: بعد 3 أيام في الثقافة الخلايا الفردية ستشكل مجموعة من> 3 خلايا وبعد 1 أسبوع غدة البروستات عنيبات التي يبلغ قطرها 50 ميكرومتر ~ وسيراعى. اتبع بروتوكول الموصوفة في 2.3 لأداء المناعي باستخدام الأجسام المضادة المحددة للعلامات التصاقات خلية مصفوفة، التصاقات خلية خلية، القطبية apico القاعدية والغازية (13). <li> استخدام وسائل الإعلام مع تصاعد 4 "، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) أو تضمين خطوة إضافية (بعد 2.3.12) إلى وصمة عار نواة الخلية التي يحتضنها مع دابي لمدة 5 دقائق ويغسل 2 × 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني +. 6. 3D ثقافة البروستاتا المجاميع ورم خلية على الإدارة القائمة على النتائج الأصليين وتصلب الخلايا ثقافة PC3 في المتوسط 1640 RPMI تحتوي على 10٪ ت / FCS v و 50 U / البنسلين مل مع 50 ميكروغرام / مل الستربتومايسين. تسخين سائل الإعلام والثقافة، برنامج تلفزيوني و 0.25٪ ث / ت حل التربسين- 0.53 M EDTA إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. نضح في وسائل الإعلام ثقافة من طبق ثقافة متكدسة 10 سم 2 من خلايا PC3 وغسل الخلايا 2X مع 3 مل من برنامج تلفزيوني لإزالة كل آثار FCS التي يمكن أن يطفئ رد الفعل التربسين. نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة 3 مل من محلول التربسين-EDTA لتغطية الخلايا واحتضان لمدة 1 دقيقة. عندما تصبح خلايا دائرية، ولكن لا تزال تعلق على طبق، ونضح بعناية الحل التربسين-EDTA ويغسل مع 3 مل من برنامج تلفزيوني لإزالة جميع آثار التربسين. بعد إزالة برنامج تلفزيوني، إضافة 5 مل من وسائل الإعلام والثقافة، وبلطف ماصة صعودا وهبوطا لإنتاج تعليق خلايا مفردة. نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل. خذ 1 مل من تعليق خلية PC3 في أنبوب الطرد المركزي الجديدة وإضافة 9 مل من وسائل الاعلام والثقافة. لوحة الخلايا على صحن 10 سم 2 الثقافة (01:10 تمييع) للاستخدام التجريبي لاحقا. عد الخلايا المتبقية باستخدام عدادة الكريات. تمييع 2500 خلايا PC3 أعدت في الخطوة 6.6 في 300 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة RPMI 1640 تستكمل مع 2٪ ت / ت من حل BM للسماح لتشكيل مادة هلامية التدرج في الثقافة. البذور بلطف الخلايا على الإدارة القائمة على النتائج الأم وتشديد AGE ووضع بعناية الثقافة في مجموعة حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 (مع الترطيب) لضمان التوزيع العادل لزراعة الكروية في البئر. تغيير ثقافة وسائل الإعلام كل 72 ساعة. لدراسة تأثير تصلب الإدارة القائمة على النتائج (-AGE الغني)على البروستاتا هجرة الخلايا السرطانية وخلايا PC3 الصورة باستخدام brightfield الفيديو في الوقت الفاصل بين المجهري باستخدام درجة حرارة / CO 2 السيطرة وغرفة ترطيب 17. ملاحظة: خلايا PC3 تنمو بشكل جدائل على الإدارة القائمة على النتائج المحلية ولا تشكل عنيبات مع التجويف، ولكن إذا تركت لتنمو أكثر من 72 ساعة على الإدارة القائمة على النتائج الأم التي ستشكل الكروية 3D. وبعد الحصول على البيانات يدويا تعقب الخلايا PC3 وحساب سرعتهم الهجرة، شكل (نسبة استطالة)، واستمرار الهجرة 17-19. ملاحظة: استمرار = نسبة D / T، D = المسافة من البداية الى النهاية لمسار الخلية، T = الطول الكلي للمسار الخلية.

Representative Results

3D البروستاتا عنيبات مثقف على الجثة الإدارة القائمة على النتائج بعد 6 أيام في الثقافة، المتوقَّع (PECs) مشتقة من نسيج البروستاتا الطبيعية (RWPE-1) (الشكل 1A) والأنسجة BPH (BPH-1) (الشكل 1B) شكل عنيبات على مواطن (PBS المعالجة) الإدارة القائمة على النتائج التي يتم تنظيمها في الكروية زي الظهارية الخلايا. يكون لهذه عنيبات أيضا خصائص بيكس درجة عالية من التنظيم مع قمي لالقاعدية القطبية واللمعية مرئية الفضاء 13،20. وعنيبات التي شكلتها المتوقَّع (PECs) مشتقة من نسيج البروستاتا الطبيعية (RWPE-1) (الشكل 1A) والأنسجة BPH (BPH-1) (الشكل 1B) على تشديد الإدارة القائمة على النتائج (-AGE الغني) (تعامل مع GLA) لديها بنية تعطلت (تحويل من كروي إلى متعدد الأضلاع في الشكل وخلايا جاحظ / المهاجرة من عنيبات في سن الغنية RBM) (الشكل 1A). هذه تتميز عنيبات أيضا المتوقَّع (PECs) غير منظمة للغاية التي فقدت الأقطاب-قمي لالقاعدية مع مساحة اللمعية صغيرة أو معدومة 13. الشكل 1: البروستات طلائي الخلايا كما نمت 3D غدية عنيبات على الأصلية والجثة بدروم إعادة تشكيل غشاء (RBM) (A) صور Brightfield من RWPE-1 الخلايا نمت لمدة 12 ساعة تصل إلى 6 أيام على المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج تعامل مع برنامج تلفزيوني (اللغة الأم) أو 50 ملي glycolaldehyde لمدة 14 ساعة (-AGE غنية، شديدة)؛ شريط النطاق = 50 ميكرون. (ب) BPH-1 الخلايا، ونمت كما هو موضح في لوحة A؛ الحانات النطاق = 50 ميكرون. البيانات ممثل من 3 تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الجدول 1 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 54230 / 54230table1.jpg "/> وقد نمت خصائص البروستات طلائي RWPE-1 عنيبات نمت على السكان الأصليين، وشبه الجثة والجثة بدروم إعادة تشكيل غشاء (RBM) RWPE-1 عنيبات على الإدارة القائمة على النتائج قبل تعامل مع برنامج تلفزيوني لمدة 14 ساعة (اللغة الأم)، glycolaldehyde (GLA: الجدول 1. ) لمدة 6 ساعة (شبه قاسية) أو تأجير لمدة 14 ساعة (قاسية). لشكل عنيبية، فإن النسبة المئوية (٪) ± الانحراف المعياري (SD) جولة، وحسبت عنيبات شبه مضلع والمضلع من 5 تجارب مستقلة (50 عنيبات كميا في حالة). تم احتساب نسبة حجم عنيبية (الأم الإدارة القائمة على النتائج = 100٪) من 3 تجارب مستقلة. للغزو، وحسبت٪ ± عنيبات SD مع واحد أو أكثر من الخلايا جاحظ من 3 تجارب مستقلة. ويتم احتساب تغيير أضعاف بقسمة متوسط القيمة التي تم الحصول عليها تحت ظروف شبه شديدة أو شديدة من القيمة المطابقة للشروط المحلية. قيم P تحسب باستخدام اختبار (ت) الطالب (α = 0.05). ontent "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> AGE تعتمد زيادة الإدارة القائمة على النتائج صلابة تعزز PC3 البروستاتا هجرة الخلايا السرطانية خلايا PC3 نمت على الإدارة القائمة على النتائج الأم تهاجر من خلال الحفاظ على استمرار الاتصال خلية خلية، في حين أن خلايا PC3 نمت على AGE الغني (قاسية) الإدارة القائمة على النتائج التحرك بشكل مستقل عن بعضها البعض (الشكل 2A). بعد 72 ساعة في خلايا PC3 الثقافة تشكل بؤر (الكروية) على مواطن (PBS المعالجة) الإدارة القائمة على النتائج، في حين أن خلايا PC3 على تصلب (-AGE الغنية) الإدارة القائمة على النتائج لا من الكروية والهجرة بشكل مستقل (الشكل 2B). خلايا PC3 على تصلب الإدارة القائمة على النتائج (-AGE الغنية) هي أكثر ممدود من خلايا PC3 نمت على الأم الإدارة القائمة على النتائج (الشكل 2C). خلايا PC3 على تصلب الإدارة القائمة على النتائج تهاجر أسرع من خلايا PC3 نمت على الإدارة القائمة على النتائج الأم (الشكل 2D). خلايا PC3 على تصلب الإدارة القائمة على النتائج عرض انخفاضا في استمرار بالمقارنة مع خلايا PC3 نمت على الأم الإدارة القائمة على النتائج (الشكل 2E). <img aLT = "الشكل 2" SRC = "/ ملفات / ftp_upload / 54230 / 54230fig2.jpg" /> الشكل 2: البروستات الهجرة ورم خلية على الأصلية والجثة بدروم إعادة تشكيل غشاء (RBM) (A) صور Brightfield من خلايا PC3 نمت على المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج تعامل مع برنامج تلفزيوني (الأم) أو glycolaldehyde 50 ملي لمدة 14 ساعة (-AGE الأغنياء، وقاسية) . تم تصوير الخلايا باستخدام المجهر brightfield (الهدف 10X)، ومعدل حيازة 1 صورة في ساعة لمدة 12 ساعة تليها خلية تتبع لتوليد مسارات. الصور المعروضة تتوافق مع نقاط الوقت بعد 0، 3، 6، 9 و 12 ساعة. وتظهر مسارات الخلايا وحيدة لنقطة زمنية 12 ساعة. شريط مقياس = 100 ميكرون. خلايا (ب) PC3 مثقف على الإدارة القائمة على النتائج الأم أو شديدة لمدة 72 ساعة، وتصويرها كما هو موضح في لوحة (A). شريط مقياس = 100 ميكرون. ويوضح التفاصيل منطقة مختارة في 2X التكبير. (C) يعني ± SD طول الخلية (ميكرون)؛ فرق كبير بين الإدارة القائمة على النتائج المحلية وقاسية الإدارة القائمة على النتائج (ع = 1.2 × 10 -23). ( <strأونج> D) يعني ± SD سرعة (ميكرون / ساعة) تحسب من مسارات الخلية؛ فرق كبير بين الإدارة القائمة على النتائج المحلية وتصلب الإدارة القائمة على النتائج (ع = 0.004). (E) يعني ± SD استمرار حركة الخلية (نسبة D / T، حيث D = المسافة من البداية الى النهاية لمسار الخلية، T = الطول الكلي للمسار الخلية). فرق كبير بين الإدارة القائمة على النتائج المحلية وتصلب الإدارة القائمة على النتائج (ع = 0.0007). لوحات وقد تم تحليل CE> 10 الخلايا، البيانات هو ممثل من 3 تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

تم تعديل بروتوكول لتوليد 3D عنيبات غدي من MECs في المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج نقية ⁶ في دراسة سابقة بإضافة 4 ملغ نوع / مل أنا الكولاجين لمصفوفة الإدارة القائمة على النتائج. أدت إضافة الكولاجين في معامل مرونة من هلام الإدارة القائمة على النتائج زيادة من 175 ± 37-1589 ± 380 الضغط بمقياس الباسكال. هذه الزيادة 9.1 أضعاف في صلابة التضمين النمو والبقاء والهجرة وتمايز MECs ^21. تم تعديل بروتوكول مرة أخرى بما في ذلك خطوة العلاج مع د – (-) – الريبوز لتعزيز يشابك غير الأنزيمية من الكولاجين النوع الأول التي أضيفت إلى هلام الإدارة القائمة على النتائج. تم العثور الناتجة من زيادة 15 ضعفا في صلابة للتعاون مع التحول أنكجنيك من MECs لتعزيز السلوك الغازية ^22. المنهج التجريبي إضافة النوع الأول الكولاجين إلى المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج يسهل التفاعل المباشر من MECs مع ألياف الكولاجين، والذي يحدث فقط في الأنسجة البشرية بعد حاجز مادي بين سدىوظهارة التي تقدمها BM يخضع تدهور بروتين. عن طريق توليد عنيبات غدي 3D من المتوقَّع (PECs) في المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج نقية قبل المعاملة مع GLA، البروتوكول الحالي يفتح الطريق لدراسة كيفية BM صلابة في حد ذاتها يمكن أن تؤدي إلى السلوك الغازية (الشكل 3). مستويات BM صلابة يتسبب في هذا البروتوكول لها أهمية فسيولوجية. الحضانة مع 50 ملي تأجير لمدة 6 ساعة و 14 ساعة على التوالي زاد الرجوعية المرنة للهلام الإدارة القائمة على النتائج النقي إلى 175 ± 90 و 322 ± 160 مقارنة ب 122 ± 55 الضغط بمقياس الباسكال في الهلام الإدارة القائمة على النتائج تعامل مع برنامج تلفزيوني (الجدول 1). هذه الزيادة 1،7-3،2 أضعاف في الإدارة القائمة على النتائج صلابة يلخص 2.5- إلى 3.4 أضعاف زيادة في صلابة لوحظ في خبيث مقارنة البروستاتا الطبيعية أو الأنسجة BPH ^23-26. كما هو مبين في منشور صدر مؤخرا ¹³ التغييرات الشكلية الناجمة عن تراكم AGE والإدارة القائمة على النتائج صلابة في PEC عنيبات يمكن قياسها كميا لتحول كبير إحصائيا من عounded إلى شكل متعدد الأضلاع، وانخفاض اللمعية / المساحة الكلية عنيبية، وجاحظ الخلايا المهاجرة من acina في سن الغنية الإدارة القائمة على النتائج (الشكل 3). ويمكن أيضا Immunoblotting استخدامها لتقييم علامات EMT (مثل فقدان E-كادهيرين ¹³⁾ وسلوك مقلص (على سبيل المثال فسفرته ضوء الميوسين سلسلة 2، pMLC2 ¹³⁾ في بيكس نمت في وضعها الطبيعي مقابل تصلب الإدارة القائمة على النتائج (الشكل 3). مزيد من التقييم باستخدام تلوين مناعي والفحص المجهري متحد البؤر يمكن تطبيقها على تصور BM (مثل laminin، الكولاجين الرابع وتراكم AGE ^13)، الخلوية قمي إلى القاعدية القطبية (على سبيل المثال توطين القمي EEA1: بداية endosomal مستضد 1؛ وGM130: 130 كيلو دالتون رابطة الدول المستقلة جولجي علامة ¹³⁾ والأنماط الخلوية من جزيئات الالتصاق (على سبيل المثال كادهيرين E التوطين إلى تقاطعات خلية خلية ¹³⁾ (الشكل 3).

<img aLT = "الشكل 3" SRC = "/ ملفات / ftp_upload / 54230 / 54230fig3.jpg" />
الشكل (3): لمحة عامة عن البروتوكولات المختلفة المقدمة هنا يصور الرسم كيفية إعداد وتصلب الغشاء القاعدي المعاد (RBM) مع glycolaldehyde (تفاعل ميلارد)، وكيفية البذور الخلايا إلى الإدارة القائمة على النتائج قاسية، وكيفية تحليل الإدارة القائمة على النتائج شديدة ( مدى تفاعل ميلارد) والإجراءات التي يمكن استخدامها لتحليل التغيرات الخلوية والجزيئية الناجمة عن الإدارة القائمة على النتائج-AGE الغنية. AGE، endproducts غلكأيشن المتقدم؛ BM، الغشاء القاعدي. دابي، 4، 6 diamidino-2-phenylindole. EEA1، في وقت مبكر مستضد endosomal 1؛ GAPDH، غليسيرألدهيد-3-فوسفات نازعة. GLA، glycolaldehyde. جي، جليكاين إيثيل استر، GM130، 130 كيلو دالتون رابطة الدول المستقلة جولجي علامة. ف MLC2 (Thr18 / Ser19)، الميوسين ضوء سلسلة 2 فسفرته في مواقع ثريونين 18 و سيرين 19. الإدارة القائمة على النتائج، الغشاء القاعدي المعاد. SDS-PAGE، كبريتات الصوديوم دوديسيل هلام بولي أكريلاميد الكهربائي. للحصول على شريط RWPE1 عنيبات مقياس = 10 ميكرون. لالخلايا السرطانية PC3شريط الكروية مقياس = 100 ميكرون. تم تعديل هذا الرقم من إشارة ^13. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

سوف خطوات حل المشاكل يكون ضروريا إذا D – يتم اختيار الريبوز وكيلا يشابك الإدارة القائمة على النتائج – (-). خلال تطوير بروتوكول وجد أن المعاملة مع 1 M D – (-) – الريبوز لمدة 72 ساعة، كما هو موضح سابقا عن المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج / الكولاجين ^22، أسفر عن الجفاف وانكماش المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج. تقييم تركيزات أقل من D – (-) – الريبوز والأوقات العلاج أقصر قد تساعد في التغلب على هذا القيد.

يمكن أن تصادف وجود قيود محتملة في التطبيقات المستقبلية للبروتوكول حيث المطلوب مستويات أعلى من الإدارة القائمة على النتائج صلابة. إذا تم استخدامها مرات حضانة أطول وتركيزات أعلى من GLA للحث على مستويات أعلى من الإدارة القائمة على النتائج هلام صلابة سيكون من الضروري ل تقييم ما إذا كانت هذه الشروط معاملة لها تأثير على بقاء الخلية والانتشار، كما هو موضح سابقا ^(13). كما تجدر الإشارة إلى أن حضانة RWPE-1 الخلايا مع المصل يؤدي الى مثل EMT التحول المظهري والتعرض لمصل أو المواد المحتوية على مصل ينبغي تجنبها. على سبيل المثال، إذا تنطوي على تجارب ترنسفكأيشن بالتدخل قصيرة الحمض النووي الريبي (سيرنا) [أليغنوكليوتيد، ينبغي أن يكون الأمثل الإجراء باستخدام خلايا RWPE-1 نمت في KSFM، دون تبديل الخلايا إلى انخفاض وسائل الإعلام ترنسفكأيشن المصل. هذا العيب يمكن أن يقلل من مستوى الجينات إسكات يتحقق عند استخدام سيرنا عابرة النهج في النموذج. لبعض الأهداف البروتين فإنه ينصح لتوظيف ناقلات shRNA محرض لإسكات الجينات الانضباطي وانخفاض المطلوب في مستويات البروتين. ويمكن أيضا أن تدمج التعديلات التي تتضمن يشابك الأنزيمي خلية اللحمية أو الخلايا السرطانية الليزيل المرتبطة أوكسيديز (لوكس) ¹⁷ في نماذج المستقبل.

jove_content "> وهذا البروتوكول تسهيل الدراسة المستقبلية للآليات الموالية الغازية الناجمة عن تعتمد على العمر BM صلابة في بيكس (RWPE-1، BPH-1) وتقييم أهداف مكافحة المنتشر في PTCs الغازية (PC3). وبالنظر إلى أن BPH يعتبر اضطراب التمثيل الغذائي ^27، هذا البروتوكول يمهد الطريق أيضا نحو لدينا فهم أفضل للعلاقة بين الاضطرابات الأيضية وزيادة خطر الاصابة بسرطان البروستاتا. وبالنظر إلى أن BM صلابة الناجم عن التعرض لأجس قد تكون نقطة انطلاق لغزو في السرطان الأخرى أنواع، وسوف تكون ذات فائدة لاستخدام بروتوكول لانشاء نماذج مماثلة التي تتضمن الخلايا الظهارية الطبيعية والخلايا السرطانية من الأجهزة الأخرى (مثل الثدي والقولون والمبيض والبنكرياس).

وتتلخص الخطوات الحاسمة في البروتوكول، جنبا إلى جنب مع توقيتها، في الشكل (4). وخلال الخطوة الأولى من الضروري للحفاظ على حل سهم الإدارة القائمة على النتائج في 4 درجات مئوية في حين أنه يذوب لمنع بول لymerization. لا ينبغي أن توضع نصائح ماصة في حل الأسهم RM حتى وتأثرت إلى 4 درجات مئوية. للخطوة التالية من المهم أيضا لضمان والمتوازنة الشرائح غرفة إلى 4 درجة مئوية قبل والمغلفة هم مع الحل الإدارة القائمة على النتائج. حالما يتم زيادة درجة حرارة المحلول الإدارة القائمة على النتائج فوق 4 درجات مئوية فإنه سيخضع البلمرة لا رجعة فيها لتشكيل مادة هلامية. من الضروري أن الإدارة القائمة على النتائج غير منزعجة خلال المرحلة البلمرة لضمان أن تشكل حتى السطح مناسبة لزراعة الخلايا والتحليل المجهري. ومدة الحضانة مع GLA مع أو بدون مثبطات للتفاعل ميلارد (سيان بورهيدريد الصوديوم وamingoguanidine) تحديد كيفية قاسية يصبح جل الإدارة القائمة على النتائج. فمن المستحسن استخدام حضانة 6 ساعات مع GLA إذا كانت هناك حاجة ظروف شبه صلبة، والحضانة 14 ساعة إذا كانت هناك حاجة ظروف قاسية (الجدول 1). حضانة مرات بديلة أو تركيزات GLA يمكن أن تستخدم إذا كانت مستويات مختلفةمن صلابة والمطلوب. في هذا التحليل حالة الانسيابية من المواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج بحاجة إلى أن تدرج كخطوة أساسية. بعد خطوة من التبريد للتفاعل ميلارد من الحضانة مع جي والخطوات اللاحقة الغسيل مع برنامج تلفزيوني، والمواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج يمكن استخدامها على الفور أو تخزين عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 48 ساعة قبل استخدامها للثقافة الخلية. مرة واحدة يتم تعيين مزارع الخلايا تصل من المهم تغيير ثقافة المتوسط (بما في ذلك أي علاج) كل يومين. فمن المستحسن للحفاظ على مزارع الخلايا 3D ل3-12 أيام وفقا لمعايير قيد التحقيق. ل3D عنيبات PEC فمن المستحسن لتحليل الثقافات بعد 6 أيام، ول3D المؤسسة العامة للاتصالات الكروية تحليل ينصح بعد 3 أيام من الثقافة في المقام الأول.

الشكل (4): نظرة عامة بسيطة من بروتوكول مع خطوات الهامة والتوقيت وأشارت فلوالرسم البياني ث يصور كيفية إعداد وتشديد الطابق السفلي غشاء المعاد (RBM) مع glycolaldehyde (مايار رد فعل) مع الخطوات الحاسمة ومواعيد المشار إليها. نقاط حيث البروتوكول يمكن وقفها، والمواد الهلامية الإدارة القائمة على النتائج تخزين، وأشار أيضا. الإدارة القائمة على النتائج، الغشاء القاعدي المعاد. GLA، glycolaldehyde. جي، جليكاين إيثيل استر، ON، بين عشية وضحاها. برنامج تلفزيوني، مخزنة فوسفات المالحة. RT، درجة حرارة الغرفة. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Simon Hayward (Vanderbilt University Medical Center) for the BPH-1 cells; and Thomas Cox and Janine Erler (Biotech Research & Innovation Centre, University of Copenhagen) for their assistance with rheological measurements. MR-T was funded by Worldwide Cancer Research, formerly The Association of International Cancer Research (Grant 08-0803 to JS), The British Embassy Montevideo and Agencia Nacional de Investigacion e Innovacion (UK_RH_2015_1_2 to MR-T). MC was supported by Prostate Cancer UK (Grant S14-017 to JS and GS). KW was funded by The China Scholarship Council. MAM was funded by The Saudi Arabian Cultural Bureau.

Materials

I – Material for monolayer culture
BPH-1	CaP Cell Line Database	PCaCL-132	Contact: simon.hayward@mcmail.vanderbilt.edu
Complete keratinocyte serum-free media	ThermoFisher Scientific	17005-075	Do not warm at 37 ºC before use
Fetal calf serum	First Link UK Ltd	02-00-850	Store at -20 ºC in aliquots
PC3	American Type Culture Collection	CRL-1435
Penicillin/streptomycin	ThermoFisher Scientific	15070-063
Phosphate Buffer Saline (Dulbecco A) tablets	Oxoid	BR0014G
RPMI 1640 medium	Sigma-Aldrich	R5886	warm in 37 ºC water bath before use
RWPE-1	American Type Culture Collection	CRL-11609
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4049
Name	Company	Catalog Number	Comments
II – Material for 3D culture
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	271004
Aminoguanidine hydrochloride	Sigma-Aldrich	396494	Irritating to eyes, respiratory system and skin
Chamber slides, 8-well	Thermo Scientific Nunc Lab-Tek	TKT-210-816M
Culture Matrix reconstituted basement membrane (rBM) reduced growth factor extract	AMS Biotechnology	3445-005-01	Store Basement membrane (BM) at -80 ºC in aliquots
Cyanogen bromide	Sigma-Aldrich	C91492	Toxic by contact skin and inhalation
Formic acid	Sigma-Aldrich	695076
Glycine ethyl ester hydrochloride (GEE)	Sigma-Aldrich	50060	Irritating to eyes
Glycolaldehyde dimer (GLA)	Sigma-Aldrich	G6805
Sodium cyanoborohydride	Sigma-Aldrich	71435	Highly flammable; Toxic by contact skin and inhalation
Syringe filter 0.22 microns	Appleton Woods	BC680
Name	Company	Catalog Number	Comments
III – Material to quantify Maillard reaction
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	ThemoFisher Scientific	D3571	light sensitive and store at -20 ºC in aliquots
Cloning cylinders	Sigma-Aldrich	C1059
Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate	ThemoFisher Scientific	A-11001	light sensitive
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate	ThemoFisher Scientific	A-11034	light sensitive
Goat serum	Abcam	ab7481	Store at -20 ºC in aliquots
Vectashield mounting media	Vector Laboratories	H-1000
Mouse anti-pentosidine clone PEN-12 mAb	TransGenic Inc	KH012
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	F8775	Store at -20 ºC in aliquots
Rabbit anti-human collagen IV polyclonal antibody	Acris Antibodies	R1041	Store at -20 ºC in aliquots
Rabbit anti-laminin A/C pAb	Santa Cruz Biotechnology Inc	sc-7292	Store at -20 ºC in aliquots
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether (Triton-X100)	Sigma-Aldrich	T9284
Polyethylene glycol sorbitan monolaurate (Tween-20)	Sigma-Aldrich	P1379
Dialysis cassette Slide-A-Lyzer	ThemoFisher Scientific	66333
Name	Company	Catalog Number	Comments
IV – Equipment
ARG2 controlled strain rotational rheometer	T.A. Instruments
Axiovert S100 (20x magnification) microscope	Zeiss
CO2 controlled humidified incubation chamber for Zeiss Axio S100 microscope	Solent Scientific
Confocal Axiovert 200M (40x, 63x magnification) microscope	Zeiss
Olympus LH50A microscope fitted with a digital camera using phase-contrast	Olympus
PHERAstar Plus plate reader spectrophotometer	BMG Labtech
Name	Company	Catalog Number	Comments
V – Software
Image J 1.47v	National Institute of Health, USA
MetaXpress	Molecular Divices

References

Timpl, R., Brown, J. C. Supramolecular assembly of basement membranes. Bioessays. 18 (2), 123-132 (1996).
Yurchenco, P. D., Ruben, G. C. Type IV collagen lateral associations in the EHS tumor matrix. Comparison with amniotic and in vitro networks. Am J Pathol. 132 (2), 278-291 (1988).
Halfter, W., et al. Protein composition and biomechanical properties of in vivo-derived basement membranes. Cell Adh Migr. 7 (1), 64-71 (2013).
Candiello, J., Cole, G. J., Halfter, W. Age-dependent changes in the structure, composition and biophysical properties of a human basement membrane. Matrix Biol. 29 (5), 402-410 (2010).
To, M., et al. Diabetes-induced morphological, biomechanical, and compositional changes in ocular basement membranes. Exp Eye Res. 116, 298-307 (2013).
Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
Bello, D., Webber, M. M., Kleinman, H. K., Wartinger, D. D., Rhim, J. S. Androgen responsive adult human prostatic epithelial cell lines immortalized by human papillomavirus 18. Carcinogenesis. 18 (6), 1215-1223 (1997).
Hayward, S. W., et al. Establishment and characterization of an immortalized but non-transformed human prostate epithelial cell line: BPH-1. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 31 (1), 14-24 (1995).
Kaighn, M. E., Narayan, K. S., Ohnuki, Y., Lechner, J. F., Jones, L. W. Establishment and characterization of a human prostatic carcinoma cell line (PC-3). Invest Urol. 17 (1), 16-23 (1979).
Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
Rabilloud, T. Mechanisms of protein silver staining in polyacrylamide gels: a 10-year synthesis. Electrophoresis. 11 (10), 785-794 (1990).
Rodriguez-Teja, M., et al. AGE-modified basement membrane cooperates with Endo180 to promote epithelial cell invasiveness and decrease prostate cancer survival. J Pathol. 235 (4), 581-592 (2015).
Graf, B. W., Boppart, S. A. Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models. Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).
Yao, N. Y., Larsen, R. J., Weitz, D. A. Probing nonlinear rheology with inertio-elastic oscillations. J Rheology. 52 (4), 1013-1025 (2008).
Baker, A. M., Bird, D., Lang, G., Cox, T. R., Erler, J. T. Lysyl oxidase enzymatic function increases stiffness to drive colorectal cancer progression through FAK. Oncogene. 32 (14), 1863-1868 (2013).
Caley, M. P., et al. Tumor-associated Endo180 requires stromal-derived LOX to promote metastatic prostate cancer cell migration on human ECM surfaces. Clin Exp Metastasis. 3 (2), 151-165 (2016).
Sturge, J., Wienke, D., East, L., Jones, G. E., Isacke, C. M. GPI-anchored uPAR requires Endo180 for rapid directional sensing during chemotaxis. J Cell Biol. 162 (5), 789-794 (2003).
Sturge, J., Wienke, D., Isacke, C. M. Endosomes generate localized Rho-ROCK-MLC2-based contractile signals via Endo180 to promote adhesion disassembly. J Cell Biol. 175 (2), 337-347 (2006).
Rodriguez-Teja, M., et al. Survival Outcome and EMT Suppression Mediated by a Lectin Domain Interaction of Endo180 and CD147. Mol Cancer Res. 13 (3), 538-547 (2015).
Paszek, M. J., et al. Tensional homeostasis and the malignant phenotype. Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).
Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139 (5), 891-906 (2009).
Carson, W. C., et al. Material characterization of ex vivo prostate tissue via spherical indentation in the clinic. Med Eng Phys. 33 (3), 302-309 (2011).
Hoyt, K., et al. Tissue elasticity properties as biomarkers for prostate cancer. Cancer Biomark. 4 (4-5), 213-225 (2008).
Krouskop, T. A., Wheeler, T. M., Kallel, F., Garra, B. S., Hall, T. Elastic moduli of breast and prostate tissues under compression. Ultrason Imaging. 20 (4), 260-274 (1998).
Zhang, M., et al. Quantitative characterization of viscoelastic properties of human prostate correlated with histology. Ultrasound Med Biol. 34 (7), 1033-1042 (2008).
Corona, G., et al. Benign prostatic hyperplasia: a new metabolic disease of the aging male and its correlation with sexual dysfunctions. Int J Endocrinol. , (2014).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Rodriguez-Teja, M., Breit, C., Clarke, M., Talar, K., Wang, K., Mohammad, M. A., Pickwell, S., Etchandy, G., Stasiuk, G. J., Sturge, J. How to Study Basement Membrane Stiffness as a Biophysical Trigger in Prostate Cancer and Other Age-related Pathologies or Metabolic Diseases. J. Vis. Exp. (115), e54230, doi:10.3791/54230 (2016).

Automatically Generated