Un rastreable<em> En Vivo</em> Ensayo para mitocondrial Moduladores Usando transgénico bioluminiscente<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.
Abstract
The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode’s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.
Introduction
El propósito general de este procedimiento es la rápida cuantificación de la situación energética de C. elegans in vivo con el fin de utilizar esto como un punto final en el cribado del compuesto. El fundamento se basa en la expresión transgénica de la luciferasa de luciérnaga en el nematodo C. elegans desde 1 hasta 3 a través de la plásmido pSLGCV (1 https://www.addgene.org/49862). La enzima luciferasa se fusiona con el verde fluorescente GFP proteína y se expresa constitutivamente y de forma ubicua en el citoplasma (se retiró el peroxisoma luciferasa señal de orientación). Esto conduce a la emisión de luz cuando el sustrato luciferina se proporciona de forma exógena. A medida que el tornillo sin fin es transparente, la luz puede medirse en un luminómetro como unidades relativas de luz (RLU). Combustibles ATP celular la reacción de bioluminiscencia y su disponibilidad determina los niveles de luz producidos. En consecuencia, luminometría ofrece una convenient significa evaluar los niveles relativos de la ATP y por extensión de la función mitocondrial, ya que la producción de ATP se produce principalmente en las mitocondrias. Un enlace entre los niveles de función y de bioluminiscencia mitocondriales ha sido previamente demostrada a través del silenciamiento de genes de la cadena de transporte de electrones mitocondriales y concomitante salida de luz reducida. 1
Las cepas de bioluminiscencia generados fueron designados PE254 (feIs4) y PE255 (feIs5) 1 (véase la lista de materiales) y se puede utilizar indistintamente. 3 Un número de estudios han utilizado estas cepas de sensores para informar sobre los niveles celulares de ATP in vivo tras la exposición a diversos productos químicos xenobióticos tales como azida de sodio 1, cadmio 2, las aguas residuales extracto de lodos 3, 5'-fluoro-2-desoxiuridina 6, y una nitrosamina específica del tabaco-7. Las cepas también han sido útiles para controlar los efectos de la exposición a la radiación ultravioleta C <sup> 8 y los efectos de la interrupción de la función de la cadena respiratoria mitocondrial. 1,9 Una primera versión del sensor de luminiscencia que expresa el gen de la luciferasa sin una fusión GFP (PE39) también se ha utilizado en la investigación de los efectos de los metales pesados y de un respiratoria . desacoplador 10 cepas PE254 y PE255 llevan la luciferasa: GFP fusión y GFP fluorescencia ha demostrado aumentar proporcionalmente con la masa de nematodos, que ofrece un medio conveniente para la normalización de los valores de luminiscencia 6,9 Los efectos de la cantidad diferencial de los gusanos por así también pueden ser. tenido en cuenta al incluir múltiples repeticiones técnica en el ensayo (un mínimo de 5 pozos por condición). 3
El protocolo ofrece la posibilidad de monitorización in vivo de los niveles de energía (en comparación con más técnicamente laborioso in vitro determinaciones de ATP) que permite la investigación de compuestos y reposicionamiento en el contexto fisiológico de toda una muorganismo lticellular. El procedimiento se puede extender a una variedad de orígenes genéticos de cruzar el transgén cromosómicamente integrados en cepas mutantes disponibles y / o por silenciar genes mediante ARN de interferencia; por lo tanto, aprovechando al máximo C. elegans como organismo modelo. El método debe ayudar a reducir la pérdida de fase tardía de candidatos a fármacos debido a la toxicidad mitocondrial y hacer una contribución a la reducción de la experimentación con animales superiores.
Protocol
Representative Results
Discussion
El organismo modelo C. elegans proporciona un potente sistema experimental. Es fácil a la cultura y produce abundante descendencia genéticamente idéntica con un ciclo de vida de 3,5 días de huevo a la reproducción de los adultos (a través de las etapas larvales juveniles L1 hasta L4). Debido a su pequeño tamaño, puede ser convenientemente cultivadas en placas de 96 pocillos, lo que facilita la investigación de compuestos. Se presenta un protocolo de cribado fenotípico basado en cepas de C. elegans que actúan como sensores in vivo de los niveles de energía. 14 El protocolo es aplicable a cualquier laboratorio, aunque se requiere un luminómetro placa de 96 pocillos y un gabinete estéril. Es importante para prevenir la contaminación en ensayos mediante el uso de una buena técnica de laboratorio. Si se trabaja manualmente, el número máximo de placas de nematodos alcanzable es 13 por experimento permitiendo la prueba de 2x placas de 96 pocillos de drogas y que incluye dos placas de vehículos. Los resultados representativos se presentan para el complejo I mitocondrial inhibidor rotenone, el paraquat generador de superóxido, el oxalacetato intermedio ciclo del ácido cítrico y cuatro compuestos con conocida actividad inhibidora de la luciferasa de luciérnaga. Los dos primeros compuestos condujo a una disminución en la bioluminiscencia como se predijo mientras que oxaloacetato condujo a una mejora, es probable que el resultado de una mayor generación de ATP. Los conjuntos de datos oxaloacetato también demuestran la variabilidad intrínseca en los experimentos sobre la base de la luciferasa de luciérnaga como reportero. Un mínimo de tres experimentos independientes son aconsejables para comprobar la robustez de las respuestas a los compuestos desconocidos.
La inhibición de la actividad de la luciferasa de luciérnaga era identificable con un ensayo in vitro utilizando un kit comercial. 3 Uno de los compuestos resultó en un incremento sustancial de la fluorescencia de GFP en consonancia con el inhibidor de aumentar los niveles de GFP-etiquetados luciferasa de luciérnaga mediante la unión a la de la enzima luciferasa activa sitio, y que lo hacen más estable. 15 En algunos casos(no en este caso particular) esto puede conducir a un aumento de los niveles de bioluminiscencia cuando el inhibidor se desplaza por el exceso de sustrato. 15 Es, por lo tanto, importante no interpretar los resultados erróneamente a partir de compuestos que interactúan con la enzima de luciérnaga como la disminución o el aumento de los niveles de ATP / función mitocondrial. Los cambios en la señal de luminiscencia muy a menudo se correlacionan con las mediciones adicionales de la salud tales como el movimiento, el desarrollo y el crecimiento. Como ejemplo, un compuesto es un inhibidor de la luciferasa sospechoso si se detecta una disminución dramática en la señal de bioluminiscencia pero los gusanos son indistinguibles de los controles por observación microscópica. Un aumento en la fluorescencia de GFP, no se explica por el crecimiento o autofluorescencia compuesto, también puede apuntar a un inhibidor. Una serie de inhibidores de luciferasa 15 son conocidos y se han celebrado PubChem. Por lo tanto, en primer lugar, es una buena práctica para consultar información sobre los inhibidores de la luciferasa en poder de PubChem; seguido por tresante de los efectos de compuestos en ensayos in vitro con la enzima purificada 3 y / o la confirmación de efectos sobre la función mitocondrial por medios adicionales. 16,17
Las mediciones de fluorescencia de GFP permiten la detección de los niveles de luciferasa de luciérnaga (y la detección potencial de algunos inhibidores de la enzima luciferasa como se discutió anteriormente) hacer un caso fuerte para la medición de este parámetro junto bioluminiscencia cuando sea posible. La normalización de las lecturas de bioluminiscencia a GFP es también un medio de dar cuenta de las variaciones en los números de gusano entre los pozos (aunque esto también puede lograrse mediante la inclusión de múltiples repeticiones técnica). Para mayor sensibilidad, es importante para restar la fluorescencia de fondo de las lecturas. El protocolo evalúa la contribución de la suspensión bacteriana a la fluorescencia de fondo, sin embargo autofluorescencia nematodo no se contabiliza (una limitación del ensayo actual, particularmente crítico para cualquier Stu envejecimientomuere dado que los aumentos de autofluorescencia nematodo con la edad). Autofluorescencia de compuestos de ensayo también debe evaluarse en paralelo. Normalización GFP parece indispensable donde los investigadores desean adaptar protocolo para comparar piscinas celulares de ATP en diferentes mutantes genéticos o después de silenciamiento de genes diferentes, con el fin de controlar por cualquier cepa diferencias en el nivel de expresión del transgén bioluminiscencia.
Los parámetros críticos dentro del protocolo incluyen la etapa de desarrollo en que se inicia la exposición, la duración de la exposición, y la obtención de un número similar de nematodos en diferentes pocillos. La exposición puede comenzar en cualquier etapa del desarrollo de los nematodos, sin embargo fase L3 o es mayor preferible. A partir de este momento en adelante, los nematodos dependen de la fosforilación oxidativa para el desarrollo en la edad adulta, como lo demuestra un incremento muy significativo en el contenido de ADN mitocondrial, el consumo de oxígeno y los niveles de ATP. 18,19,20 El presente protocolo inicia exposUre en la etapa L4. La razón de alícuotas de nematodos a placas de 96 pocillos solamente en esta etapa (en lugar de cuando se proporcionaron primero con los alimentos en la fase L1), es que, aunque las placas se colocan en cámaras húmedas para minimizar la evaporación, un grado de evaporación todavía ocurre en nuestra incubadora de agitación, visto como gotitas muy pequeñas que se forman en las tapas (esto puede no ser un problema con otras incubadoras temblorosas). Por alícuotas de nematodos a las placas justo antes de la adición de las normas de drogas, la concentración real de drogas no se ve afectada por cualquier pequeña variación en el volumen debido a la evaporación. Cargando una placa nematodo con vehículo solamente es útil para verificar que los nematodos se distribuyeron de manera uniforme entre los pozos. Las diferencias significativas encontradas para el vehículo solamente la placa sería indicativo de una mala técnica en la dispensación de los nematodos a los pozos.
La duración de la exposición es un factor importante a considerar. Si los efectos sobre el estado de la energía independientemente de crecimiento son de interés, el proprotocolo puede ser modificado para dar cabida a exposiciones más cortas (de respuestas casi inmediato a, por ejemplo, 2 h). Por otra parte, la entrada de compuestos en C. tejidos elegans puede tomar algún tiempo. Por ejemplo se requieren 12 a 24 hr para conseguir concentraciones internas máximas de resveratrol y 5-fluoro-2 'desoxiuridina (FUdR). 21 Por lo tanto, una exposición más larga (18 a 24 horas) puede ser justificable para maximizar los niveles de exposición. El tiempo de exposición debe limitarse a los tiempos que no permiten niveles significativos de la reproducción que tengan lugar en el pozo. Se recomienda que el tiempo de desarrollo total de nematodos se mantiene en 66 a 67 h. Aunque conveniente, nematodos están grávidas para entonces y han iniciado de postura de. Sin embargo, encontramos lecturas de bioluminiscencia a partir de preparaciones de huevo para ser insignificante (no mostrado). El impulsada expresión transgénica sur 5-promotor se detectó por primera vez sólo dos a dos y media horas después de la fertilización en la etapa de 100 células 22 y el ccáscara de huevo hitinous es probable que limite la entrada de luciferina. Otros han encontrado que los huevos embrionados no contribuyeron significativamente al metabolismo de los adultos grávidas. 23 Sin embargo, las condiciones que permitan una producción significativa descendencia deben ser evitados. Si se prefiere, la escala de tiempo experimental se puede desplazar hacia atrás: hemos iniciado con anterioridad la exposición a una toxina ambiental en la última etapa de las larvas L3 (36 h) y llevado a cabo mediciones de bioluminiscencia y las buenas prácticas agrarias a 55 hr 2 fondos Alternativamente, genéticos que son condicionalmente estéril. se puede utilizar para prevenir la producción de progenie, como por ejemplo la fer-15 (b16) II; Fem-1 (HC17) IV doble mutante que puede mantenerse a 15 ° C, pero es estéril a 25 ° C. 24 El uso de FUDR para inducir la esterilidad no se recomienda ya que esto en sí mismo puede afectar el metabolismo de los nematodos. 25 El ensayo podría también se puede realizar en las cepas con cutículas más permeables tales como parcial pérdida de función bus-8 mutantes que son-multirresistente sensible debido a aumentar la permeabilidad de las drogas. 26 Esto facilitará exposiciones más cortas y las concentraciones de compuestos inferiores. Las condiciones para la adición de luciferina a estos nematodos también necesite ajustar es decir, 1% de DMSO y 0,05% de Triton-X100 en el búfer de luminiscencia puede no ser necesaria para mejorar la disponibilidad luciferina.
El protocolo utiliza 1% de DMSO como vehículo para la entrega compuesto. Aunque no es mortal, esta concentración de DMSO tiene algunos efectos biológicos como hemos discutido en una publicación anterior. 3 Muchas de las bibliotecas de drogas disponibles se preparan en DMSO al 100%, en concentraciones que sean adecuados para ensayos basados en células después de la dilución del vehículo a 0,1%. Se requieren concentraciones del compuesto más altos para obtener respuestas en C. elegans, en comparación con las células humanas, de modo que a menudo no es posible llevar a cabo ensayos a menor de un 1% de DMSO. Una vez más, el uso de cepas conmás cutículas permeables pueden conducir a pruebas con menores concentraciones de vehículo. No se recomiendan concentraciones de DMSO más alto que 1%.
Un tiempo de incubación set con luciferina antes de las lecturas deben ser atendidas. Como se indica anteriormente, la luminiscencia llega a sus niveles máximos en el segundo minuto después de la adición de luciferina, permaneciendo relativamente estable durante los primeros 5 minutos, seguido de una disminución gradual lenta en la luminiscencia durante el próximo 30 min 1. Respuestas cinéticas a una sustancia química en particular puede llevar a cabo durante esta etapa inicial de 30 minutos después de la distribución inicial de luciferina.
El protocolo implica una etapa de hambre después de la recogida de los huevos para conseguir la sincronización de la población de nematodos. Recomendamos la sincronización de las poblaciones de nematodos de prueba ya que diferentes etapas de desarrollo difieren en los niveles celulares de ATP y pueden responder de manera diferente a los compuestos de ensayo. Al llevar a cabo el hambre en S completamedio en comparación con M9, los nematodos incubar están provistos de una fuente de carbono (etanol), de modo que las larvas no se desarrollan completamente pero no se mueren de inanición. 27,28 También se ha demostrado que arrestado L1 de se cebó de respuesta rápida frente a la alimentación y tasa de crecimiento normal de L1 se logra dentro de 3 horas después de la comida se convierte en disponible. 29 Sin embargo, la posibilidad de que la etapa de inanición puede alterar el metabolismo de C. elegans no se puede excluir. 30 Por esta razón la longitud de la inanición no debe exceder de 24 hr (18 hr es suficiente para la sincronización). Ciertos laboratorios pueden tener la posibilidad de utilizar un Biosorter Copas para la sincronización de edad sin pasar por la etapa de inanición por completo. Otros laboratorios pueden tener una preferencia por la expansión de la población de nematodos en medios sólidos (NGM placas con OP50) antes del blanqueo (paso 3.1) y esto va a funcionar bien también. Utilizamos medio S durante la exposición al compuesto como un medio estándar para el cultivo de nematodos, however otros medios de comunicación se pueden seleccionar, por ejemplo medio K o EPA moderadamente agua dura se utilizan a menudo para estudios ecotoxicológicos. 31,32
El protocolo proporciona un medio para defender y para identificar candidatos para realizar más pruebas en cuanto a los efectos sobre la función mitocondrial. En la etapa de cribado primario es probable que algunos compuestos se han perdido debido a una sola concentración se está probando, por lo tanto, las pantallas de drogas no debe considerarse exhaustiva. Golpea pueden ser validados por el uso de técnicas para la evaluación de diferentes aspectos de la función mitocondrial para el consumo de oxígeno ejemplo, C. elegans cepas con GFP expresar las mitocondrias, las manchas de potencial de membrana mitocondrial y / o mediciones ROS. 16,33,34 La mayor importancia de la metodología es tener un medio para el cribado de gran número de compuestos y / o las condiciones a nivel del organismo multicelular, y esto es importante ser capaz de tomar ventaja de le tratabilidad genética de C. elegans para investigar mecanismos de acción. La técnica puede ayudar a acelerar y encontrar nuevas vías para el descubrimiento de compuestos y objetivos interesantes. Se prevé que la combinación del sensor con antecedentes genéticos asociados con la enfermedad humana para el cribado de bibliotecas de compuestos en un contexto relevante enfermedad tendrá mucho que ofrecer.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank David Gray from the Dundee Drug discovery unit for kindly donating firefly luciferase inhibitory compounds DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 and DDD00023047; Tibor Harkani (Medical University of Vienna) for the suggestion of oxaloacetate as a test compound; and Charlie Dear (University of Aberdeen) for illustrations. This work was funded by a BBSRC Pathfinder award (BB/FOF/PF/4/11) and the University of Aberdeen.
Materials
| Orion II Microplate Luminometer | Berthold Detection Systems | with injector and the Simplicity 4.2 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement | |
| FLx800 fluorimeter | Biotek | with Gen5 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement | |
| Ks 130 basic shaking platform | Ika | #0002980000 | |
| Innova 4349 | New Brunswick Scientific | Refrigerated incubator shaker | |
| Eppendorf centrifuge 5804R | Eppendorf | with eppendorf rotor A-4-44 (for 50/15ml tubes) | |
| Stripette, Costar | Corning | #4489 | Serological pipette |
| Cellstar 50 ml tubes | Greiner bio-one | #227661 | |
| Cellstar 15 ml tubes | Greiner bio-one | #188261 | |
| Cellstar 60 mm tissue culture plates | Greiner bio-one | #628160 | |
| Superfrost Microscope slides | VWR | #631-0909 | |
| Sterile spatula | Corning | #3007; #3004 | for weighing out chemicals |
| 0.22 mM Millex GP filters | Millipore | #SLGP033RS | |
| Axygen eppendorf tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | #MCT-150-R | |
| Corning 96 well assay plate | VWR | #3603 | Black plate clear bottom with lid |
| Nunc 96 well assay plate | Fisher Scientific | #236105 | White plate with lid |
| Reservoir reagent 60 mL | Thermo Scientific Finnpipette | #9510027 | used as trough for nematodes in protocol section 4.4.1) |
| Storage box/damp chamber | Roche Diagnostics | #10 800 058 001 | 174 x101 x 56.6 mm, used as a damp chamber with wet paper towels; 2X 96-well plates with lids can fit into one, the lower sitting on top of a microplate lid |
| Bleach: Sodium hypochlorite solution 4-4.99% Chlorine content | Sigma Aldrich | #239305 | Store in aliquots at 4°C, seal with parafilm to prevent loss of chlorine and cover in foil |
| D-Luciferin, potassium salt | Biotium Inc | # 10101-2 | Molecular Probes can also be used as supplier; prepare a 20 mM stock in ddH2O, keep at -20 °C in aliquots |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | # P9416 | |
| DMSO | CalBiochem | #317275 | Purity 99.99% |
| Triton X100 | Alfa Aesar | #A16046 | Diltute to 10% in ddH20 |
| Nystatin | CalBiochem | #475914 | |
| C. elegans bioluminescent strains | Author's own laboratory | PE254, PE255 | contain integrated arrays feIs4 and feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] respectively on chromossome V and X; select for homogeneous and strong expression of luc::GFP by fluorescence microscopy (e.g. pick 15 worms) every now and then. |
| E. coli OP50 | CGC | ||
| General chemicals | Sigma Aldrich/Fisher Scientific |
References
- Lagido, C., Pettitt, J., Flett, A., Glover, L. A. Bridging the phenotypic gap: real-time assessment of mitochondrial function and metabolism of the nematode Caenorhabditis elegans. BMC Physiol. 8, 7 (2008).
- Lagido, C., McLaggan, D., Flett, A., Pettitt, J., Glover, L. A. Rapid sublethal toxicity assessment using bioluminescent Caenorhabditis elegans, a novel whole-animal metabolic biosensor. Toxicol Sci. 109, 88-95 (2009).
- McLaggan, D., et al. Impact of sublethal levels of environmental pollutants found in sewage sludge on a novel Caenorhabditis elegans model biosensor. PloS one. 7, e46503 (2012).
- Rodriguez-Enriquez, S., Juarez, O., Rodriguez-Zavala, J. S., Moreno-Sanchez, R. Multisite control of the Crabtree effect in ascites hepatoma cells. Eur J Biochem. 268, 2512-2519 (2001).
- Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants. Toxicol Sci. 97, 539-547 (2007).
- Rooney, J. P., et al. Effects of 5′-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans. Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).
- Bodhicharla, R., Ryde, I. T., Prasad, G. L., Meyer, J. N. The tobacco-specific nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) induces mitochondrial and nuclear DNA damage in Caenorhabditis elegans. Environ Mol Mutagen. 55, 43-50 (2014).
- Leung, M. C., et al. Effects of early life exposure to ultraviolet C radiation on mitochondrial DNA content, transcription, ATP production, and oxygen consumption in developing Caenorhabditis elegans. BMC Pharmacol Toxicol. 14, 9 (2013).
- Kuang, J. J., Ebert, P. R. The failure to extend lifespan via disruption of complex II is linked to preservation of dynamic control of energy metabolism. Mitochondrion. 12, 280-287 (2012).
- Lagido, C., Pettitt, J., Porter, A. J., Paton, G. I., Glover, L. A. Development and application of bioluminescent Caenorhabditis elegans as multicellular eukaryotic biosensors. FEBS Lett. 493, 36-39 (2001).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Brenk, R., et al. Lessons learnt from assembling screening libraries for drug discovery for neglected diseases. ChemMedChem. 3, 435-444 (2008).
- Lagido, C., Wilson, M. J., Kakouli-Duarte, T. . Nematodes as environmental indicators. , 225-251 (2009).
- Thorne, N., et al. Firefly luciferase in chemical biology: a compendium of inhibitors, mechanistic evaluation of chemotypes, and suggested use as a reporter. Chem Biol. 19, 1060-1072 (2012).
- Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497, 451-457 (2013).
- Andreux, P. A., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. Pharmacological approaches to restore mitochondrial function. Nat Rev Drug Discov. 12, 465-483 (2013).
- Tsang, W. Y., Lemire, B. D. Mitochondrial genome content is regulated during nematode development. Biochem Bioph Res Co. 291, 8-16 (2002).
- Decuyper, C., Vanfleteren, J. R. Oxygen-Consumption during Development and Aging of the Nematode Caenorhabditis-Elegans. Comp Biochem Phys A. 73, 283-289 (1982).
- Dillin, A., et al. Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development. Science. 298, 2398-2401 (2002).
- Zheng, S. Q., Ding, A. J., Li, G. P., Wu, G. S., Luo, H. R. Drug absorption efficiency in Caenorhbditis elegans delivered by different methods. PloS one. 8, e56877 (2013).
- Yochem, J., Gu, T., Han, M. A new marker for mosaic analysis in Caenorhabditis elegans indicates a fusion between hyp6 and hyp7, two major components of the hypodermis. Genetics. 149, 1323-1334 (1998).
- Vanfleteren, J. R., DeVreese, A. Rate of aerobic metabolism and superoxide production rate potential in the nematode Caenorhabditis elegans. J Exp Zool. 274, 93-100 (1996).
- Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161, 1101-1112 (2002).
- Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).
- Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis. Dev Biol. 317, 549-559 (2008).
- Castro, P. V., Khare, S., Young, B. D., Clarke, S. G. Caenorhabditis elegans Battling Starvation Stress: Low Levels of Ethanol Prolong Lifespan in L1 Larvae. PloS one. 7, (2012).
- Baugh, L. R. To Grow or Not to Grow: Nutritional Control of Development During Caenorhabditis elegans L1 Arrest. Genetics. 194, 539-555 (2013).
- Baugh, L. R., DeModena, J., Sternberg, P. W. RNA Pol II Accumulates at Promoters of Growth Genes During Developmental Arrest. Science. 324, 92-94 (2009).
- Maxwell, C. S., Antoshechkin, I., Kurhanewicz, N., Belsky, J. A., Baugh, L. R. Nutritional control of mRNA isoform expression during developmental arrest and recovery in C. elegans. Genome Res. 22, 1920-1929 (2012).
- Cressman, C. P., Williams, P. L. Reference toxicants for toxicity testing using Caenorhabditis elegans in aquatic media. Am Soc Test Mater. 131, 518-532 (1997).
- Khanna, N., Cressman, C. P., Tatara, C. P., Williams, P. L. Tolerance of the nematode Caenorhabditis elegans to pH, salinity, and hardness in aquatic media. Arch Environ Con Tox. 32, 110-114 (1997).
- Benedetti, C., Haynes, C. M., Yang, Y., Harding, H. P., Ron, D. Ubiquitin-like protein 5 positively regulates chaperone gene expression in the mitochondrial unfolded protein response. Genetics. 174, 229-239 (2006).
- Yang, W., Hekimi, S. A Mitochondrial Superoxide Signal Triggers Increased Longevity in Caenorhabditis elegans. Plos Biol. 8, (2010).
