A rastre�el<em> In Vivo</em> Ensaio para mitocondrial Modulators Usando Transgenic Bioluminescent<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.
Abstract
The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode’s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.
Introduction
O objetivo geral deste procedimento é a rápida quantificação do status de energia do C. elegans in vivo, com vista a utilizar este como um ponto final na triagem composto. A base racional é com base na expressão transgénica da luciferase de pirilampo, no nemátodo C. elegans 1-3 através do plasmídeo pSLGCV (1 https://www.addgene.org/49862). A enzima luciferase é fundida com a proteína fluorescente verde GFP e é expressa constitutivamente e ubiquamente no citoplasma (o sinal de direccionamento de peroxissoma luciferase foi removido). Isto conduz a emissão de luz, quando o substrato luciferina é fornecido exogenamente. À medida que o sem-fim é transparente, a luz pode ser medida num luminómetro como unidades relativas de luz (RLU). Combustíveis de ATP celular a reacção de bioluminescência e a sua disponibilidade determina os níveis de luz produzidos. Consequentemente, luminometria oferece uma convenient meios de avaliar os níveis relativos de ATP e função mitocondrial por extensão, uma vez que a produção de ATP ocorre principalmente nas mitocôndrias. A relação entre os níveis de função e bioluminescência mitocondriais tem sido demonstrada previamente através do silenciamento dos genes da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial e concomitante redução da produção de luz. 1
As cepas bioluminescência gerados foram designados PE254 (feIs4) e PE255 (feIs5) 1 (ver lista de materiais) e podem ser utilizados indiferentemente. 3 Um número de estudos foram utilizadas essas estirpes de sensores para informar sobre os níveis de ATP celular in vivo a seguir a exposição a vários produtos químicos xenobióticos tais como azida de sódio 1, cádmio 2, esgoto extracto de lamas 3, 5'-f luoro-2-desoxiuridina 6, e uma nitrosamina específica do tabaco 7. As cepas também têm sido úteis para monitorizar os efeitos da exposição à radiação ultravioleta C <saté> 8 e efeitos de perturbar a função da cadeia respiratória mitocondrial. 1,9 Uma primeira versão do sensor de luminescência que expressa o gene da luciferase sem uma fusão GFP (PE39) também tem sido utilizada na investigação dos efeitos de metais pesados e de um respiratória . 10 Cepas PE254 PE255 e desacoplador levar a luciferase: GFP fusão e fluorescência da GFP foi mostrado para aumentar proporcionalmente com massa nematóide, oferecendo um meio conveniente para a normalização dos valores de luminescência 6,9 Os efeitos do montante diferencial de vermes por poço também pode ser. tidas em conta, incluindo várias repetições técnicas no ensaio (um mínimo de 5 poços por condição). 3
O protocolo oferece a possibilidade de monitorização in vivo dos níveis de energia (em oposição a mais tecnicamente laboriosa determinações in vitro de ATP), que permite rastreio de compostos e reposicionamento no contexto fisiológico de um mu inteirolticellular organismo. O procedimento pode ser estendido para uma variedade de origens genéticas, atravessando o transgene cromossomicamente integrados em cepas mutantes disponíveis e / ou por silenciar genes por RNA de interferência; Assim, aproveitando ao máximo C. elegans como organismo modelo. O método deve ajudar a reduzir a falta de fase tardia de candidatos a medicamentos devido à toxicidade mitocondrial e fazer uma contribuição para a redução de maior experimentação animal.
Protocol
Representative Results
Discussion
O organismo modelo C. elegans fornece um poderoso sistema experimental. É fácil de cultura abundante e produz progenia geneticamente idênticos, com um ciclo de vida do dia 3,5 de ovo a reprodução de adulto (através de estágios larvais juvenis através L1 a L4). Devido ao seu pequeno tamanho, pode ser convenientemente cultivadas em placas de 96 poços, o que facilita a triagem composto. Nós apresentamos um protocolo de triagem fenotípica com base em cepas de C. elegans que actuam como sensores in vivo dos níveis de energia 14 O protocolo. é aplicável a qualquer laboratório, embora seja necessário um luminómetro de placas de 96 poços e um armário estéril. É importante evitar a contaminação em ensaios usando boa técnica laboratorial. Se trabalhar manualmente, o número máximo de placas de nematóides atingível é de 13 por experimento permitindo o teste de 2 x placas de 96 poços e de drogas incluindo duas placas de veículos. Os resultados representativos são apresentados para o complexo mitocondrial I inibidor rotenone, o paraquat gerador de superóxido, o oxaloacetato intermediário ciclo de ácido cítrico e quatro compostos com conhecida atividade inibitória da luciferase do pirilampo. Os primeiros dois compostos conduziu a um decréscimo na bioluminescência como previsto oxaloacetato Considerando que conduziu a uma melhoria, podem resultar de uma maior geração de ATP. Os conjuntos de dados oxaloacetato também demonstram a variabilidade intrínseca em experiências com base na luciferase do pirilampo como um repórter. Um mínimo de três experiências independentes são aconselháveis para determinar a robustez das respostas aos compostos desconhecidos.
A inibição da actividade da luciferase do pirilampo foi identificável com um ensaio in vitro utilizando um kit comercial. 3 Um dos compostos resultou num aumento substancial da fluorescência da GFP consistente com o inibidor de aumentar os níveis de luciferase de pirilampo pela ligação à enzima luciferase do activo marcado com GFP local, e tornando-o mais estável. 15 Em alguns casos(não, neste caso particular), o que pode levar ao aumento dos níveis de bioluminescência quando o inibidor é deslocada por um excesso de substrato. 15 É, portanto, importante não interpretar os resultados erradamente a partir de compostos que interagem com a enzima de pirilampo como níveis de ATP diminuída ou aumentada / função mitocondrial. As alterações no sinal de luminescência muitas vezes se correlacionam com as medições adicionais de saúde, tais como movimento, crescimento e desenvolvimento. Como um exemplo, um composto é um inibidor da luciferase suspeito se um declínio dramático do sinal de bioluminescência é detectado mas os vermes são indistinguíveis dos controlos por observação microscópica. Um aumento na fluorescência da GFP, não explicado pelo crescimento ou autofluorescência composto, também pode apontar para um inibidor. Uma série de inibidores da luciferase 15 são conhecidos e foram celebrados PubChem. Portanto, em primeira instância, é uma boa prática de consultar informações sobre os inibidores da luciferase detidas por PubChem; seguido por tressante os efeitos de compostos em ensaios in vitro com a enzima purificada, 3 e / ou a confirmação de efeitos sobre a função mitocondrial por meios adicionais. 16,17
Medições de fluorescência da GFP permitir a detecção de níveis de luciferase de pirilampo (ea detecção potencial de alguns inibidores da enzima luciferase, como discutido acima) fazendo um forte argumento para a medição deste parâmetro ao lado de bioluminescência sempre que possível. A normalização das leituras bioluminescência a GFP é também um meio de contabilizar variações no número de vermes entre poços (embora isto também pode ser conseguido pela inclusão de múltiplas repetições técnicas). Para uma maior sensibilidade, é importante para subtrair a fluorescência de fundo de leitura. O protocolo avalia contribuição da suspensão bacteriana para a fluorescência de fundo, no entanto nemátodo autofluorescência não é contabilizada (uma limitação do ensaio corrente, particularmente crítico para qualquer Stu envelhecimentomorre dado que nematóide autofluorescência aumenta com a idade). Autofluorescência de compostos de teste também deve ser avaliada em paralelo. GFP normalização pareceria indispensável quando investigadores deseja adaptar o protocolo para comparar piscinas de ATP celular em diferentes mutantes genéticos ou após o silenciamento de genes diferentes, a fim de controlar para quaisquer diferenças de tensão ao nível de expressão do transgene bioluminescência.
Os parâmetros críticos dentro do protocolo de incluir a fase de desenvolvimento em que a exposição é iniciada, a duração da exposição, e a obtenção de um número semelhante de nemátodos nos diferentes poços. A exposição pode começar em qualquer fase de desenvolvimento dos nematóides, no entanto fase L3 ou mais é preferível. A partir dessa etapa, nematóides depender de fosforilação oxidativa para o desenvolvimento até a idade adulta, como evidenciado por um aumento muito significativo no teor de mtDNA, consumo de oxigênio e níveis de ATP. 18,19,20 O presente protocolo inicia exposure no estádio L4. A razão para alíquotas nemátodos para placas de 96 poços apenas nesta fase (ao invés do que quando eles foram em primeiro lugar dotado de comida na fase L1), é que, embora as placas são colocadas em câmaras húmidas para minimizar a evaporação, um grau de evaporação ainda ocorre em nossa incubadora de agitação, vista como muito pequenas gotículas que formam nas tampas (isto pode não ser um problema com outras incubadoras agitação). Por nemátodos alíquotas para placas imediatamente antes da adição de padrões de droga, a concentração efectiva da droga não é afectada por qualquer variação pequena no volume devido a evaporação. Carregando uma placa com nematóide veículo só é útil para verificar se os nematóides foram distribuídos uniformemente entre os poços. Não existem diferenças significativas para o veículo só placa seria indicativo de má técnica na distribuição dos nematóides aos poços.
A duração da exposição é um fator importante a considerar. Se os efeitos sobre o estado de energia de forma independente do crescimento são de interesse, o proprotocolo pode ser modificado para acomodar exposições mais curtas (de respostas quase imediatos para, por exemplo, 2 horas). Por outro lado, a entrada de compostos em C. tecidos elegans pode levar algum tempo. Por exemplo são necessárias 12-24 horas para atingir as concentrações máximas internas do resveratrol e 5-fluoro-2'-desoxiuridina (FUdR). 21 Por conseguinte, uma exposição mais longa (18 a 24 horas) pode ser justificada para maximizar os níveis de exposição. O tempo de exposição deve ser limitado aos tempos que não permitem níveis significativos de reprodução para tomar lugar no poço. Recomendamos que o tempo total de desenvolvimento de nematóides é mantida sob 66-67 h. Embora conveniente, nematóides estão grávidas até lá e deram início a oviposição. No entanto descobrimos leituras bioluminescência preparações de ovo a ser insignificante (não mostrado). O sur-5 promotor impulsionado expressão do transgene é primeiro detectada apenas 2-2 horas e meia após a fertilização na fase 100 célula 22 e a ccasca de ovo hitinous é susceptível de limitar a entrada de luciferina. Outros descobriram que os ovos embrionados não contribuem significativamente para o metabolismo dos adultos grávidos. 23 No entanto, as condições que permitem a produção de descendência significativo, devem ser evitados. Se preferir, a escala de tempo experimental pode ser deslocado de volta: nós já iniciou a exposição a uma toxina ambiental na tarde L3 fase larval (36 h) e realizado bioluminescência e GFP medições a 55 hr 2 fundos alternativa, genéticas que são condicionalmente estéril. pode ser usado para evitar a produção de descendência, como por exemplo o fer-15 (B16) II; Fem-1 (hc17) IV mutante duplo que pode ser mantida a 15 ° C, mas é estéril a 25 ° C. 24 A utilização de FUDR para induzir a esterilidade não é recomendada como este pode, por si só afecta o metabolismo de nemátodos. 25 O ensaio pode também ser realizada em estirpes com cutículas mais permeáveis, tais como perda parcial-do-functião barramento-8 mutantes que são devidos a aumento da permeabilidade de drogas sensíveis a fármacos múltiplos. 26 Isto irá facilitar a exposições mais curtas e baixas concentrações de composto. As condições para a adição de luciferina a estes nemátodos podem também precisam de ajuste ou seja, 1% DMSO e 0,05% de Triton-X100 no buffer de luminescência pode não ser necessária para aumentar a disponibilidade luciferina.
O protocolo usa 1% de DMSO como veículo para a entrega do composto. Embora não letal, esta concentração de DMSO tem alguns efeitos biológicos como já discutido na publicação anterior. 3 Muitas das bibliotecas de medicamentos disponíveis são preparadas em 100% de DMSO, em concentrações que serão adequados para os ensaios baseados em células, após a diluição de veículo a 0,1%. Concentrações de composto mais elevados são necessários para induzir respostas em C. elegans quando comparado com células de origem humana, de tal modo que muitas vezes não é possível realizar ensaios em menor do que 1% de DMSO. Mais uma vez, a utilização de estirpes comcutículas mais permeáveis podem levar a testes com concentrações mais baixas de veículo. As concentrações de DMSO de 1% mais elevada do que não são recomendados.
Um tempo de incubação conjunto com luciferina antes de leituras devem ser respeitados. Como foi mostrado anteriormente, luminescência atinge seus níveis máximos no segundo minuto após a adição de luciferina, permanecendo relativamente estável para o primeiro 5 min, seguido por uma diminuição gradual lento na luminescência ao longo do próximo 30 min 1. Respostas cinéticas para uma determinada substância química pode ser levada a cabo durante esta etapa inicial de 30 minutos após a distribuição inicial da luciferina.
O protocolo envolve um passo de fome após a coleta de ovos para conseguir a sincronização da população do nematóide. Recomendamos sincronização de populações de nemátodos de teste uma vez que diferentes estágios de desenvolvimento diferem nos níveis de ATP celular e pode responder de forma diferente para os compostos de teste. Ao realizar a fome no S completomédio, por oposição a M9, os nemátodos incubação são fornecidos com uma fonte de carbono (etanol), de modo que as larvas não se desenvolvem, mas não são completamente fome 27,28. Também tem sido demonstrado que são presos L1 do preparado de resposta rápida ao alimento e L1 taxa de crescimento normal é alcançado dentro de 3 h após o alimento fique disponível. 29 No entanto, a possibilidade de que o passo de jejum pode alterar o metabolismo de C. elegans não pode ser excluída. 30 Por esta razão, o comprimento de fome não deve ser superior a 24 horas (18 horas é suficiente para sincronização). Alguns laboratórios podem ter a possibilidade de utilizar uma Copas Biosorter para sincronização de idade ignorando o passo fome completamente. Outros laboratórios podem ter uma preferência para a expansão da população de nematóides em meio sólido (placas NGM com OP50) antes do branqueamento (passo 3.1) e isso vai funcionar muito bem. Nós usamos meio S durante a exposição composto como um meio padrão para nematóide cultura, however outros meios de comunicação pode ser seleccionado, por exemplo K médio ou EPA moderadamente água dura são frequentemente utilizados para estudos ecotoxicológicos 31,32.
O protocolo proporciona um meio para rastrear e identificar candidatos para análises adicionais em termos dos efeitos sobre a função mitocondrial. Na fase de rastreio primário, é provável que alguns compostos que foram perdidas devido a uma única concentração a ser testada, por conseguinte, telas de drogas não deve ser considerada exaustiva. Visitas podem ser validados pelo uso de técnicas para avaliar diferentes aspectos da função mitocondrial por exemplo o consumo de oxigénio, C. elegans com estirpes expressando GFP mitocôndrias, manchas de potencial de membrana mitocondrial e / ou medições de ROS. 16,33,34 A maior importância da metodologia é ter um meio para o rastreio de grande número de compostos e / ou condições ao nível do organismo multicelular, e mais importante, de ser capaz de tirar vantagem do the tratabilidade genética de C. elegans para investigar os mecanismos de ação. A técnica pode ajudar a acelerar e encontrar novos caminhos para a descoberta de compostos e alvos interessantes. Prevê-se que a combinação do sensor com fundos genéticos associados à doença humana para o rastreio de bibliotecas de compostos, num contexto em causa doença terá muito a oferecer.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank David Gray from the Dundee Drug discovery unit for kindly donating firefly luciferase inhibitory compounds DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 and DDD00023047; Tibor Harkani (Medical University of Vienna) for the suggestion of oxaloacetate as a test compound; and Charlie Dear (University of Aberdeen) for illustrations. This work was funded by a BBSRC Pathfinder award (BB/FOF/PF/4/11) and the University of Aberdeen.
Materials
| Orion II Microplate Luminometer | Berthold Detection Systems | with injector and the Simplicity 4.2 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement | |
| FLx800 fluorimeter | Biotek | with Gen5 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement | |
| Ks 130 basic shaking platform | Ika | #0002980000 | |
| Innova 4349 | New Brunswick Scientific | Refrigerated incubator shaker | |
| Eppendorf centrifuge 5804R | Eppendorf | with eppendorf rotor A-4-44 (for 50/15ml tubes) | |
| Stripette, Costar | Corning | #4489 | Serological pipette |
| Cellstar 50 ml tubes | Greiner bio-one | #227661 | |
| Cellstar 15 ml tubes | Greiner bio-one | #188261 | |
| Cellstar 60 mm tissue culture plates | Greiner bio-one | #628160 | |
| Superfrost Microscope slides | VWR | #631-0909 | |
| Sterile spatula | Corning | #3007; #3004 | for weighing out chemicals |
| 0.22 mM Millex GP filters | Millipore | #SLGP033RS | |
| Axygen eppendorf tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | #MCT-150-R | |
| Corning 96 well assay plate | VWR | #3603 | Black plate clear bottom with lid |
| Nunc 96 well assay plate | Fisher Scientific | #236105 | White plate with lid |
| Reservoir reagent 60 mL | Thermo Scientific Finnpipette | #9510027 | used as trough for nematodes in protocol section 4.4.1) |
| Storage box/damp chamber | Roche Diagnostics | #10 800 058 001 | 174 x101 x 56.6 mm, used as a damp chamber with wet paper towels; 2X 96-well plates with lids can fit into one, the lower sitting on top of a microplate lid |
| Bleach: Sodium hypochlorite solution 4-4.99% Chlorine content | Sigma Aldrich | #239305 | Store in aliquots at 4°C, seal with parafilm to prevent loss of chlorine and cover in foil |
| D-Luciferin, potassium salt | Biotium Inc | # 10101-2 | Molecular Probes can also be used as supplier; prepare a 20 mM stock in ddH2O, keep at -20 °C in aliquots |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | # P9416 | |
| DMSO | CalBiochem | #317275 | Purity 99.99% |
| Triton X100 | Alfa Aesar | #A16046 | Diltute to 10% in ddH20 |
| Nystatin | CalBiochem | #475914 | |
| C. elegans bioluminescent strains | Author's own laboratory | PE254, PE255 | contain integrated arrays feIs4 and feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] respectively on chromossome V and X; select for homogeneous and strong expression of luc::GFP by fluorescence microscopy (e.g. pick 15 worms) every now and then. |
| E. coli OP50 | CGC | ||
| General chemicals | Sigma Aldrich/Fisher Scientific |
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