JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Bir taranabilir<em> İn Vivo</em> Transjenik biyolojik olarak ışık veren kullanarak Mitokondriyal Modülatörleri için tahlil<em> Caenorhabditis elegans</em

Published: October 16, 2015
doi:
10.3791/53083
, ,
1Institute of Medical Sciences,University of Aberdeen

Summary

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Abstract

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode’s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

Introduction

Bu prosedürün genel amacı C. enerji durumunun hızla ölçümü olan Bileşik taramasında bir son nokta olarak kullanarak bir görünüm ile in vivo elegans. Gerekçesi nematodu C'de ateşböceği lusiferaz transgenik ekspresyonu dayanır plazmid pSLGCV (1 ile elegans 1-3 https://www.addgene.org/49862). Lusiferaz enzim (hedefleme sinyalinin lusiferaz peroksizom uzaklaştırılmıştır) yeşil flüoresan proteini GFP kaynaştırılır ve sitoplazmadaki yapısal olarak ve her yerde bulunan ifade edilir. Alt-tabaka eksojen biçimde sağlanmaktadır lusiferin bu ışık emisyonuna yol açar. Solucan şeffaf olduğu için, ışık, göreceli ışık birimleri (RLU) olarak bir luminometrede ölçülebilir. Biyolüminesans reaksiyonu ve kullanılabilirlik hücresel ATP yakıtlar üretilen ışık seviyelerini belirler. Sonuç olarak, luminometri kullanılarak bir edilmesinin uygun sunarATP üretimi mitokondri ağırlıklı olarak oluşur çünkü t, göreli ATP seviyelerinin değerlendirilmesi ve uzatma mitokondriyal fonksiyon ile gelir. Mitokondriyal fonksiyonu ve biyoışıldama seviyeleri arasında bir bağlantı, mitokondriyal elektron taşıma zinciri genler ve eşlik azaltılmış ışık çıkışı susturma yoluyla önceden ortaya konmuştur. 1

PE254 (feIs4) belirlenmiştir oluşturulan biyolüminesans suşu ve PE255 (feIs5) 1 (malzeme listesi) ve 3. Birbirleri yerine kullanılabilir bir dizi çalışma, örneğin sodyum azid 1, kadmiyum 2, kanalizasyon gibi çeşitli ksenobiyotik kimyasallara maruz kaldıktan sonra, in vivo olarak, hücresel ATP seviyeleri rapor bu sensör suşları kullanmışlardır Çamur özü 3, 5'-floro-2-deoksiüridin 6, ve bir tütün spesifik nitrosamin 7-. Suşları da ultraviyole C radyasyona maruz kalma etkilerini izlemek için yararlı olmuştur <syukarı> 8 ve mitokondriyal solunum zinciri fonksiyonunu bozan etkileri. 1,9 bir GFP füzyon (PE39) olmadan lusiferaz genini ifade lüminesans sensörü erken bir versiyonu da ağır metallerin etkilerinin araştırılması ve bir solunum kullanılır olmuştur . uncoupler 10 Suşları PE254 ve PE255 lusiferazı taşıyan: GFP füzyon ve GFP floresan ışıma değerleri normalleşmesi için uygun bir vasıta sunan nematod kitle ile orantılı artış gösterilmiştir 6,9 kuyu başına solucanlar farklı miktarda etkileri de olabilir. tahlil (koşul başına 5 kuyuların en az) çok sayıda teknik çoğaltır dahil ederek dikkate alınır. 3

Protokol enerji seviyelerinin in vivo izlenmesi olasılığını sunar (karşıt olarak daha zahmetli teknik in vitro ATP saptamaları) bileşiği, taranmasını sağlar ve bir bütün mu fizyolojik bağlamında konumlandırmalticellular organizma. Prosedürü ve / veya RNA müdahalesi ile genleri susturmak ulaşabilirsiniz mutant suşlar içine kromozomal entegre transgen geçerek genetik geçmişleri çeşitli uzatılabilir; Böylece, C. tam yararlanarak Bir model organizma olarak elegans. Yöntem nedeniyle mitokondriyal toksisite ilaç adaylarının geç faz yetmezliği azaltmak ve daha yüksek hayvan testlerinin azaltılmasına yönelik bir katkı yapmak yardımcı olacaktır.

Protocol

NOT: (126 ° C, 11 dakika otoklav) tarafından steril koşullar (laminer akış kabini) kapsamında ve önceden sterilize edilmiş malzemeler ile tüm adımları uygulayın. Dışarı çizgili E. ile LB plakası E. coli OP50 her ay, üzerine çizgi taze LB plakaları gerekli ve restreak olan 4 ° C'de muhafaza. 1. Bakteriyel Yiyecek (Escherichia coli OP50) Preparasyon 1. Gün inoküle E. tek bir koloni ile iki evrensel şişe 2 x 5 mi LB E. coli OP50 ve 8 saat boyunca 37 ° C (220 rpm) inkübatör sallayarak yer. 8 saat inkübe edildikten sonra, E. 2 ml, E. coli OP50 LB kültür 3 x 200 mi LB zerk etmek için Kuluçka çalkalama yerleştirin şişelerde (220 rpm) O / 37 ° C de N (17 saat). 20 x 50 ml santrifüj tüpleri tartılır ve tüp ağırlığını yazın. Gün serolojik pipet kullanarak 2. kısım O 30 ml / N E. ön içine coli OP50 kültür santrifüj tüpleri tartılır. 7741 x g'de santrifüjeg, 10 ° C, 8 dakika. Dikkatle, süpernatant süzün üzerinde kapak ile ters tüp tutmak ve birkaç dakika bekletin. Bir pipet kullanarak kapağı toplanan olabilecek herhangi bir aşırı süpernatant kaldırmak. Tüp tartılır ve pelet ağırlığı hesaplamak. 30 g / L arasında bir süspansiyon sağlar ve boru üzerinde, bu hacim işaretlemek için gerekli hacim hesaplanır. 1-3 ay içinde ya da kullanılmak üzere -20 ° C'de tarihi, etiket ve yer tüpler – 80 ° C daha uzun 3 ay saklamak eğer. Nematod büyüyen bakteriyel süspansiyon hazırlamak; , girdap yavaşça pelletini dışarı çözülme ve her tüpe 11,12 tam orta S gerekli hacmi eklemek için bakteriyel pelet izin farklı tüplerin havuz içerikleri gerekli hacmi elde etmek için. Steril koşullar altında çalışmak. 96 oyuklu bir plaka biçiminde ilaç Standartları 2. Hazırlık NOT: Bir İlaç kütüphanesi kullanılarak takdirde, ilaç plakalar, tek bir sağlanmaktadırDMSO içinde bileşik konsantrasyonu. Birincil tarama tek bir konsantrasyonda bileşikleri test edecek. Talimatlar 10 uM istatistiksel açıdan anlamlı sonra seçilen, 0-160 uM arasındaki bir konsantrasyon aralığında test bileşiği, doğrulama ilaç plakanın hazırlanması için takip edin. Aşağıdaki adımlar, diğer konsantrasyonları test etmek için adapte edilebilir. DİKKAT! Uyuşturucu kullanımı için gerekli önlemleri izleyin (genellikle maske, koruyucu gözlük yüz, eldiven gerekli olan). Doğrulayıcı tarama için standartlar ile çalışan bir ilaç plakası hazırlayın: Steril 1,7 ml mikrosantrifüj tüpü içine bileşiğin gerekli miktarda ağırlığında ve DMSO içinde 16 mM bileşik hazırlamak (örneğin, 100 x maruz kalma istenilen makara miktarının artması ile konsantre edildi). 8, 4, 2, 1, 0.5 ve 0.25 mM standartları (steril koşullarda) elde edilmesi için DMSO içinde 2: seri olarak 16 mM stok: 1 seyreltin. Bunlar, konsantre 100x ve 0 (aracın yalnızca) nihai konsantrasyonları aşağı seyreltilmiş olacakİlaç maruz kalma sırasında (1% DMSO içinde) 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 ve 160 uM. Laminer akış kabininde, örneğin plaka konumu A1, 96 oyuklu bir plaka kolonu içindeki bir bileşik standartları oyuk başına 20-50 ul koyun: 16 mM, B1: 8 mM, C1: 4 mM, D1: 2 mM, E1: 1 mM, F1: 0.5 mM, G1: 0,25 mM ilaç ve H1: DMSO. Farklı ilaçların seyreltme serisi için farklı sütunlar kullanın. İlaç plaka sütun 12 kuyu Kısım araç. NOT: Bu o aracın bütün plaka pozisyonları temsilcisi olarak test edilir sağlanması, araç kontrolü aşağı satır H boyunca testine ek sütunlar test kolaylaştıracaktır. Not: teyit tarama için, her bir ilaç levhası, test edilecek 11 farklı ilaçlar en fazla ek vasıta kontrol için seyreltme serisi tutar. Gerekli dek Etiket ve mühür plaka, -20 ° C'de folyo ve yer ile kaplayın. 3. Nematodu Deneyleri NOT: tüm adımları uygulayın under Steril, aseptik olarak ve önceden sterilize edilmiş malzeme ve reaktiflerle. C koruyun elegans E. ile NGM plakalar üzerinde rutin suşları Farklı protokol adımları için E. coli OP50. 12 ÖNERİLEN zamanlamaları Tablo 1'de verilmiştir. 1. Gün Görev: sonraki eşitleme için biyosensör suşu sıvı kültürü kurdu. 2 ml S komple (gıda sadece tükendi genç larvaların bol) Bir 6 cm NGM plaka nematod alın ve 30 g / L E. ile şişeyi transfer S Tüm (toplam hacim 250 ml kapasiteli, konik bir cam kabın içinde 30 mi) içinde E. coli OP50. 20 ° C, 160 rpm'de 3 gün inkübe edilir. 4. Gün görevi (yaklaşık 30-35 dakika izin): ağartıcı kültür yumurta hasat ve solucan nüfus senkronize etmek. 1 dakika, 600 x g için tüm santrifüj adımları uygulayın. Kullanımdan hemen önce ağartma çözeltisi hazırlayın: 0,156 M KOH / NaOH, her 16 ml 4 mi ağartıcı ekleyin. 2 x 14 ml dökün15 ml konik santrifüj tüpleri içine sonsuz kültürü. Solucanlar yerçekimi (3 dk) tarafından yerleşmek için izin verin. Çıkarın ve sıvı yukarıda yerleşmiş nematod atın. Her tüpe ağartma çözeltisi 5 ml ilave edilir ve zaman ölçeri başlat. Bir tüp içine hacimleri birleştirin. 2 dakika süreyle hafifçe Tüpü ters çevirin solucanlar kırma ve süspansiyon içine yumurta serbest bırakılması için Stereoskop altında kontrol edin. Tüm çok yumurta serbest ya da ağartma çözeltisi içinde 2 dakika santrifüj maksimum zamanda. Dikkatlice süpernatantı. 14 ml S eksiksiz ve santrifüj ile pelet 1x yıkayın. Süpernatantı atın 10 ml çamaşır suyu çözeltisi ekleyip Sayacı başlatmak (bu ikinci ağartma adımı solucan karkas çoğu parçalanır ve artık Stereoskop altında görülen olmasını sağlar). 2 dakika santrifüj ağartma çözeltisi içinde maksimum süre sonra. Yıkama pelet 3x S tam olarak, yavaşça her santrifüj tamamlandıktan sonra 14 ml S süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet süzün. 14 ml S c son yıkamadan sonra, tekrar süspansiyon yumurta peletomplete. Konik cam şişeye hacim aktarın. 20 ° C, 160 rpm'de 18-24 saat inkübe edilir. NOT: Hasat yumurta O / N yumurtadan ilk larva (L1) gelişimini tutuklama nedeniyle gıda yetersizliği dolayısıyla hepsi büyümenin aynı aşamada olacak olacak. 5. Gün Görev: İlaç deneyleri için senkronize solucan kültürleri kurmak. Not: starvasyon ortamı içinde süspansiyon haline solucanlar örneğin pipet uçları ve tüpler gibi hidrofobik plastik yüzeylere yapışma eğilimindedir. % 0.01 tween-20 plastik yüzeyler daha hidrofilik yapacak ve sayma daha doğru (% 0.01 Triton-X100, aynı zamanda kullanılabilmektedir) sağlanması için burada kullanılan bir yüzey aktif maddedir. Nematodlar bakteriyel katkılı ortamda olduklarında plastik sopa eğilimi yoktur. Platformu (160 rpm) sallayarak üzerindeki şişesi tutmak, şişe içinde yumurtadan L1 yılların numaralarını belirleyin. Şişeden 100 ul örnekleri 3x atın 900 ul sıvı m ayrı 1.7 ml mikrotüpler içine (temiz bir ipucu her zaman kullanın)edium% 0.01 Tween-20. NOT: Sadece bir kez temiz ucu içine Aspire 100 ul örneği. Dağıtım Sonra, ara takviye ortama pipet yukarı ve aşağı birkaç kez ucu yapışan herhangi solucanlar serbest bırakmak için. Her üç nüsha seyreltme tüpünden 4x 10 ul damlacıkları nematod sayın. Ortalama değer hesaplayın ve konik cam şişeye mevcut solucanlar sayısını tahmin. 10 ul başına 10 nematod 2 x 20 ml kültürü kurmak için gerekli yumurtadan nematod süspansiyonu hacmini hesaplayın. Santrifüj adımları sırasında bazı sonraki nematod kaybı hesaba% 10 oranında hesaplanan ses seviyesini artırmak. Durusu hacmi 2 x 15 ml santrifüj tüpleri içine gerekli (önceden tartılmış). Nazikçe gerçek dağıtılan hacim, vorteks almak ve 5 ml'lik pipet (sadece steril ucu tüp girmelidir) ile aşırı hacim kaldırarak ses seviyesini hedef ayarlamak için tüpler tartılır. Oldu tam taze S 14 ml hacim Makyajh nematodlar. Santrifüj (1 dakika, 600 g) eklenmiştir. Çıkarın ve nematod pelet rahatsız etmemek için dikkatli süpernatant atın. 30 g / L E. ile birlikte S 5 ml tanelenmiş nematodlara coli OP50. 30 g / L E. ile birlikte 15 ml S ihtiva eden konik bir cam şişeye, her bir tüp içinde 5 ml transfer E. coli OP50. Aşağı Not zaman nematod ilk gıda ile sağlandı. Mikroskobik slaytlar nematod saymak için (taze ipuçları her zaman kullanın) ve yaklaşık 10 (± 2) 10 başına ul ortalamasını onaylamak üzerine yavaşça şişeyi (160 rpm) Salla, 9 x 10 ul damlacıkları alır. 20 ° C, 42-44 saat boyunca 160 rpm'de inkübatör sallayarak nematod şişeleri yerleştirin. Gün 7 görev: transferi 96 kuyu plakalara nematod ve ilaç maruziyeti başlatırlar. Tek bir balona nematod kültürleri birleştirmek yavaşça şişeyi dönen tutmak ve 60 ml steril çukurda nematod kültür 3 x 4 ml yerleştirin. Bir sallayarak platformu (160 rpm) üzerine çukur yerleştirin. Kullanım 8 channel pipet düz şeffaf dipli 96 oyuklu siyah mikrotitre plakaları, oyuk başına 25 ul süspansiyon nematod alikotuna (her iki ışık yayılımı ve flöresan değerlerini almak için ya da yalnızca lüminesans beyaz plakalar). Plaka kapak ile kapatın ve bir kenara koyun. Sonra her 2 plakaların kurmak kayıp hacmini yerine çukurda başka bir 2 x 2.5 ml nematod yerleştirin (yaklaşık 7 ml çukur bir 'ölü hacim "tutun). Nematod ile 13/14 tabak ayarlayın. 11 nematod plakaları, iki 96-kuyu tabak ilaç test etmek için gerekli olacaktır. 12. nematod plaka sadece bir kontrol olarak araçla yüklenir. 13. plaka 8. günde arka plan floresan (aşağıya bakınız) oluşturmak için kullanılır. Hatalar kurulması sırasında gerçekleşmesi gereken ekstra bir plaka kullanımı için hazırlanabilir. Bir sallayarak inkübatör nemli bir odasında her iyi ve yer plakasına tam S Kısım 74 ul (malzeme listesine bakınız) (20 ° C, 160 rpm) until (gıda temin sonra örneğin 45 saat 30 dakika) önceden seçilmiş gelişim anda kısım test bileşiklerinin hazır. [Kuyu başına Ses şimdi 99 ul]. Test ilaç plakasını (ler) dışarı çözülme. Ipuçları her zaman değişen, ilaç ile nematod plakaları kurmak için çok kanallı pipet kullanın. Ilaç aliquoting 96 plaka başına 5 dakika bekleyin. İlaç plaka 1. sütunundan 1 ul alın ve sütunlar nematod içeren bir plaka 1-5 eklemek; sütunlar nematod içeren plaka 8-12 içine ilaç plakasında 2. sütunundan tekrarlayın. Sütunlar 6 ve nematod plakasının 7 aracın 1 ul ekleyin. Not: bileşik / aracın 100 seyreltme: nematod plakası içerisinde oyuk başına toplam hacim, bir 1 ile sonuçlanan 100 ul olacaktır. Kolonlara ilaç plaka 3. / 4. sütunun 1 ul ekleyerek işlemi tekrarlayın ikinci nematod plakanın 1-5 / 8-12; sütunlar 6 ve nematod plakasının 7 aracı ekleyin. Kalan ilaç plaka sütunları test devam edin. İlaç plakanın 12. kolonunda numune tüm oyuklara araç bir kez nematod levhanın en az ayarlayın. Geri kuluçka 20-22 saat (20 ° C, 160 rpm) sallayarak nemli odalarında yerleştirin plakaları (gün 8 nota bakın). Bir sonraki gün için lüminesans tamponu Parça hazırlanması:% 1 DMSO ve% 0.15 Triton X-100 elde etmek üzere tamamen S gerekli hacme DMSO ve% 10 Triton-X-100 ilave edin. Işıma için plaka okuma başına 5 ml artı luminometre enjektör emişli için 1 ml bekleyin. 8. Gün Görev: Deneysel uç noktaları – Oku floresan ve biyoparlaklık. (GFP floresans okumaları biyoışıldama verileri normalleştirmek için bir yolu olarak tavsiye edilmektedir.) NOT: Gıda açıklanan deneysel koşullar altında önemli döl üretimini önlemek amacıyla nematod sağlanan sonra 66-67 saat ile uç noktaları okumak hedefliyoruz. Set up plaka GFP okumaları için arka plan kontrolü olarak kullanmak için. C15 ml'lik bir tüp içine 13 inci plakadan ombine de içeriği. Nematod (2-3 dk) yerleşmek için izin verin. Oyuk başına 100 ul bakteri süspansiyonu ile bir mikrotabla (saydam alt siyah) yüklemek için supernatant kullanın. Nematod görülebilir kuyuların aşağı belirterek mikroskop altında arka plan kontrol plakasını gözlemleyin. Sonraki veri analizinde kullanılan arka plan tahmini bu hariç. Arka plan kontrolü dahil olmak üzere her 96 oyuklu plakanın floresan, okuyun. (Ayarlar: plakanın altındaki optik; 485/20 uyarma filtreleri; 528/20 emisyon). Lüminesans okumalar için tampon hazırlayın: lusiferin (20 mM) hazırlanmış parçası tampon (bir önceki günden itibaren) ekleyin,% 1 DMSO (1x),% 0.15 Triton-X100 (3x) ve 0.3 mM lusiferin (3x lüminesans tamponu elde etmek üzere ). 150 ul ışıldama tamponu ile Başbakan luminometre enjektör 6x. Önceki adım ilaç maruziyeti sırasında araç olarak% 1 DMSO varsayar. Vasıta madde su ise olduğunda, co ayarlamak% 3 lüminesans tamponunda DMSO ncentration (yani, 3x). Bir defada bir plaka ile çalışın. Oyuk başına 50 ul ışıldama tamponu koyun. (Kuyuda 150 ul son hacim, ışıldama tamponu 3x seyreltme:% 1 DMSO,% 0.05 Triton-X100 ve 0.1 mM luciferase nihai konsantrasyonlar.) Yeri hemen platformu sallayarak ve Sayacı başlatmak üzerinde. Platformu (160 rpm) sallayarak 3 dakika sonra, lüminesans (ölçüm başına 1 sn) okuyun. 4. Veri Analizi Floresan sonuçlarından okuma ortalama GFP arka plan çıkarın. İlgili GFP okuyarak biyoparlaklık bölün. Yüksek GFP değeri bir bileşiğe maruz nematodlara tespit edildiğinde, herhangi bir bileşik floresan hesaba kendi başına bileşik floresan ölçer. Ortalamasından daha yüksek olursa, bunun yerine arka plan olarak kullanabilirsiniz. Ekspres biyoparlaklık, GFP normalize biyoparlaklık birHer plaka için araç kontrolü ortalama değerinin yüzdesi olarak nd GFP floresans verileri. Her bir konsantrasyon için ortalama değerleri ve hata çubukları çizilir. 'Konsantrasyon', 'Deney' ve etkileşim etkileri ile 2-yönlü varyans (ANOVA) analizi kullanılarak istatistiksel anlamlılık için test (her bir veri noktası tek bir kuyu anlamına gelir) ve vs (post-hoc test olarak Dunnett testi kullanmayınız . Araç kontrol). NOT: "deney" veya "etkileşim" terimleri önemli ise, daha fazla deneyler yanıtı doğrulamak için gerekli olabilir. Deneyler arasında hiçbir değişkenlik veri araziler gözlem açıkça olduğu durumlarda, bir tek yönlü ANOVA bağımsız deneyden elde edilen veriler üzerinde yapılabilir. Sadece araç plakası (ler) istatistiksel analizi için, sütunlar 6 -7 tüm kuyuları ve kontrol grubu olarak satır H tüm kuyuları seçin (bunlar rutin bileşik test sırasında araca atanmış pozisyonları). </li>

Representative Results

Metoda örnek vermek için Örnek sonuçlar rotenone (Şekil 1), parakuat (Şekil 2), oksaloasetat (Şekil 3) ve, bir ilaç kitaplığı 13 (Şekil 4), bir tarama sırasında olduğu gibi, ateş böceği luciferase inhibitörleri kaldırdı 4 bileşikler için elde edilmiştir. Ilaca maruz kalma her durumda L4 aşamasında başlandı, ancak gıda ilk kez diğer bileşikler için 45-46 saat kıyasla nematod sağlanan sonra parakuat maruz deneyleri 41 saat sonra başlanmıştır. Protokol ilaç maruziyeti başlatılması ve maruz kalma süresi için zaman seçiminde esneklik derecesi sağlar. Ancak, tarama amaçlı set kez kez deneyler arasındaki tekrarlanabilirlik için, seçilen uyulmalıdır. Uç noktalar kapsamlı yumurtlama ve kuyularda döl kuluçka önlemek için 66-67 saat gelişme süresi ile ölçülür. Zamanlamaları Kuralları T verilmektedir1 edebiliyoruz. Rotenone, I inhibitörü, bir mitokondriyal kompleks bir konsantrasyon aralığında her iki nispeten kısa (2 saat) ve daha uzun pozlar (24 saat) (Şekil 1) sonra, biyolüminesans azaltmıştır. Bu durumda, hiçbir GFP ölçümleri alınmıştır, ancak, teknik kopya sayısı kullanıldı (n = 6) kuyulara 3 arasındaki kurt sayısında herhangi bir farklılıklarını için yeterlidir. 24 saat maruz bırakma biyolüminesans düşüşe katkıda beklenen kompleks I inhibisyonunun bir sonucu olarak nematodlar büyüdüğü fazla zaman penceresi, ve daha yavaş bir gelişmedir. Bu durum, özellikle, yukarıda 20 uM ve konsantrasyonlarda, görülen gecikmeli gelişimi ile Stereoskop altında görsel olarak gözlenmesiyle de doğrulandı; Ayrıca bazı lethality (kalitatif gözlemler sayısal değil) 40 mcM gelen fark edildi. Hiçbir öldürücülüğü 2 saat maruz kaldıktan sonra gözlenmiştir ama solucan hareketi üzerindeki etkileri görüldü. Kontroller occu için biyoparlaklık göreli hızlı düşüşrotenone en düşük konsantrasyonda rred etkileri kolayca 2 saat maruz de hızlı bir görsel gözlem ile tespit edilemeyen edildiği için 2.5 mcM test. Biyolüminesans bu düşüş azaltılmış hücresel ATP ile tutarlıdır. Maksimum inhibisyon, özellikle rotenon hedefleme müteakip deneyler 0 ve 5 uM [konsantrasyon aralığı 0-160 uM arasında gerçekleştirilebilir gerektiğini belirten kullanılan rotenone en düşük konsantrasyon (2,5 uM) ile elde edilmiştir, diğer ilaçlar ile bir karşılaştırma parçası olarak seçildi Başlangıçta 10 mcM anlamlı etkilere sahip olarak tanımlanan] (başka yerde yayınlanacak). Herbisit parakuat reaktif oksijen türlerinin artışı yoluyla mitokondriyal fonksiyonunu etkiler. Burada, biz C'lik biyolüminesans üzerindeki etkisini göstermek 24 saat (Şekil 2) için bir dizi konsantrasyonda maruz bırakıldıktan sonra elegans suşu PE254. Suşu bir luc :: GFP füzyon taşır gibi, GFP floresan als olduO normalleştirme için bir araç olarak ölçülmüştür. 6,9 Paraquat anlamlı ışıldaması, GFP floresans ve normalize ışıldaması azalmıştır. Dunnet çoklu karşılaştırma testi, araç kontrolü ile ilgili olarak önemli farklılıklar olan parakuat konsantrasyonları biyolüminesans ve normalize biyoluminesans için 4 ve 8 mM, yanı sıra normalize biyoluminesans için 2 mM olduğunu göstermiştir. Önemli ölçüde GFP floresan azaltarak sadece konsantrasyon mM, büyüme etkileri ve zaman zaman ölü solucan (kalitatif gözlemler) görüldü hangi bir konsantrasyon 8 oldu. Biyolüminesans (normalize biyolüminesans) düşüş, mitokondriyal fonksiyonu ve ATP üretimi üzerindeki etkilerinin azalmış tutarlı flüoresans daha fazla idi. C üzerinde test sitrik asit döngüsü ara oksaloasetat 8 mM tek bir konsantrasyonda elegans suşu PE254, biyolüminesans bir artış (Şekil 3) yol açtı. Hiçbir GFP floresannce ölçümleri elde veya ek bir görsel gözlem gerçekleştirilmiştir; Bununla birlikte tek bir konsantrasyonda bu tür cevabı ayrıca bir konsantrasyon aralığına teyit maruz kalma ve etkileri daha detaylı gözlemler hak etmektedir. Yine de GFP floresans değerlendirerek lusiferaz seviyesi üzerinde herhangi bir etkileri kontrol etmek için tavsiye edilmektedir ATP (nihai olarak daha fazla üretimiyle ilişkili, sitrik asit döngüsünün daha fazla aktivite yol açtığı varsayılır üzere, bu bileşik tarafından biyolüminesans bir geliştirme şaşırtıcı değildir sonraki deneylerde). Oksaloasetat veri setleri lusiferaz bazlı deneylerde görülen tepki değişkenlik derecesini ortaya gösterilmiştir. Bizim tecrübelerimize göre bu değişkenlik, özellikle daha az zararlı maruziyet durumları test sisteminin bir özelliğidir. Ateşböceği lusiferaz önleyici bileşikler DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 ve DDD00023047 pu üzerindeki etkileri bakarak in vitro olarak, her iki test edildiçıkarmadan, enzim ve in vivo C. kullanarak elegans luc GFP suşu ifade. Test edilen bileşiklerin herhangi maruziyet koşullarında nematod ölümüne neden olduğuna dair hiçbir kanıt yoktu. Tüm bileşikler, 25 4, 100 uM (Şekil 4A) test edilen 2 konsantrasyonlarında in vitro lusiferaz aktivitesi etkilemiştir. DDD00001434 in vivo biyolüminesans (Şekil 4B) büyük düşüş için güvenilir bir gerekçe mesafede olan hemen hemen tamamen saflaştırılmış lusiferaz aktivitesi öldürdü. Şirketinden karşılaştırılabilir değildir, ancak, in vitro ve in vivo deneylerde, DDD00023047 yanıt her iki deneylerde benzerdi. DDD0001477 ve DDD00000635 in vitro daha etkin in vivo büyük bir düşüşe neden oldu. Bu bileşikler 22 saat önce lüsiferin yüzeye canlı solucanlar sağlanmıştır ve sonuçlar luciferase olunca kolayca lusiferaz aktif siteden yerinden olmadığını yansıtabilir avaietikel. Seçenek olarak ise, DDD0001477 ve DDD00000635 hücresel ATP seviyeleri üzerinde ek bir etkiye sahip olabilir. Bu ateşböceği lusiferaz içermeyen yollarla değerlendirilmelidir gerekir. Notun DDD00000635 bileşik maruz kalan canlı solucanlar GFP sinyalinin güçlü donanım oldu. Bu durum, aşağıda ele alınacaktır. Mitokondriyal kompleks 1. Şekil I rotenone C. enerji durumunu azalmış inhibitör elegans suşu PE254 ışıldaması ile ölçüldüğü haliyle. Senkronize L4 safhasındaki solucanların 0, 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 ve 2 1% DMSO içinde 160 uM rotenone maruz (45-46 saat L1 larvalarına sağlanan gıda sonra) hr (kısa) ya da sırasıyla 48, 24 saat (uzun pozlama) biyolüminesans önceki okumalar ve solucan gelişme 69 saat yiyecek temin sonra. Bio-ışıldama, (birim Nispi Işık Birimleri, RLU), aracın (1% DMS bir yüzdesi olarak ifade edilmiştirO) değerleridir. Hata çubukları her rotenone konsantrasyonunda teknik çoğaltır SEM tasvir (n = 6). Test edilen tüm konsantrasyonlar, araç kontrolü (p <0,001) ile ilgili olarak bir çok istatistiksel açıdan önemli bir fark ile sonuçlanmıştır. Oksidatif stres paraquat'a 2. Şekil C enerji durumunu azaldı (biyolüminesans ile ölçülen), konsantrasyon bağımlı bir tarzda elegans suşu PE254. (L1 larvalarına sağlanan gıda 41 saat sonra, bu durumda kolaylık) Senkronize L4 safhası solucanlarının 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 4 veya 8 maruz bırakılmıştır 24 saat mM parakuat. GFP floresan (birim Bağıl Floresan Birimleri, RFU) biyolüminesans verilerini (birim RLU), 65 saat gelişimine elde her iki uç noktaları normalize etmek için kullanılmıştır. Veriler kontrol yüzdesi (% 1 DMSO) olarak ifade edilmiştir. Hata çubukları teknik çoğaltır SEM tasvir(n = farklı konsantrasyonu için 5; n = 18 kontroller için). Tek yönlü ANOVA: *** p <aracın kontrolüne 0.001 göreceli. Şekil 3. sitrik asit döngüsü ara oksaloasetat (8 mM) C ışıldaması gelişmiş elegans suşu PE254. Senkronize L4 safhası solucanlarının (L1 larvalarına Resim gıda sonra 45-46 saat), taze 30 dakika ± 18 saat 8 mM oksaloasetat hazırlandı maruz bırakıldı. Bio-ışıldama, (birim RLU) 63,5 saat ± 1 saat bir gelişim zamanında okundu ve araç, bir kontrol yüzdesi olarak ifade edildi (GKD 2 O). Farklı sütunlar aynı deney içinde farklı 96 kuyucuğu tahsis 8 teknik çoğaltır farklı veri setlerini temsil etmektedir. Hata çubukları, teknik çoğaltır SEM tasvir (n = 8). 2 yollu ANOVA 'set' ve 'konsantrasyon' faktörler olarak sahip: ̵6; Set 'p> 0.05,' konsantrasyon 'p <0.001 ve etkileşim terimi p> 0.05. A B Ateşböceği lusiferaz lüminesans üzerindeki bilinen inhibitör aktivitesi olan (DDD00023047: DDD00001434, C2: DDD0001477, C3: DDD00000635 ve C4 C1) Dundee ilaç keşfi bileşiği kütüphanesinin 13 4 bileşiklere yanıtların Şekil 4. test edilmesi. Saflaştınldı ateşböceği lusiferaz aktivitesi üzerinde bileşiklerin (A) etkisi, (ışık birimleri, RLU olarak ölçülür), araç, bir kontrol yüzdesi olarak ifade edilir. ATP biyolüminesans CLSII kiti (Roche, Manheim, Almanya) oyuklara (beyaz 96-w bölünüp lusiferaz enzim aynı miktarda talimatlarına göre kullanılmıştırell mikrotiter plakaları). ATP 10 uM ve bileşimin 1 ul'lik bir nihai konsantrasyonda sağlandı (nihai konsantrasyon gösterilir) veya DMSO (% 1) ilave edildi. Lüminesans sinyali 10 saniye boyunca entegre edildi. Hata çubukları, teknik çoğaltır SEM tasvir (n = 4). Analiz: Tek yönlü ANOVA; * p <0.05 ve *** p <araç kontrolüne görece 0,001. Ve C2 ve C3 için önemli bir (sırasıyla DDD0001477 ve DDD00000635; p <0.05). GFP floresan (B) biyolüminesans in vivo ölçülmesi, normalize biyolüminesans ve; C1 (p <0,001 DDD00001434) için son derece önemli bir 25 ila 100 uM arasındaki farklar C'lik GFP flöresanı 22 saat süre ile, test bileşiklerine maruz kaldıktan sonra 67 saat gelişim zamanında elegans suşu PE254. Hata çubukları, teknik çoğaltır SEM tasvir (n = 8). İstatistiksel analizler (tek yönlü-ANOVA) 3 veri setleri (3 xn = 8) elde edilen verilerin yürütülmüştür. * p <0.05 ve *** p <ilgili araç kontrolüne görece 0,001. AyırıcıC4 (DDD00023047) maruz kalma aşağıdaki normalize biyoparlaklık 25 ve 100 mcM sadece istatistiksel olarak anlamlı (p <0.05) arasında ces. Günün zamanı 1.gün Gün 2 3. Gün 4. Gün 5. Gün Gün 6 7. Gün 8. Gün 9-10 Aşama 5 10-11 Aşama 5 11-12 Aşama 4 Aşama 5 12-13 Aşama 4 13-14 <td> 14-15 15-16 16-17 Adım 1 Aşama 3 17-18 18-19 2. Adım Protokol adımların Tablo 1. Genel nematod deneylerin her gün (Bölüm 3) yürütülen ve zamanlamaları önerdi edilecek.

Discussion

Model organizma C. elegans güçlü deneysel bir sistem sağlar. Bu kültüre kolaydır ve (L4 kadar çocuk larva evreleri L1 üzerinden) yetişkin üreyen yumurtadan bir 3.5 gün yaşam döngüsü ile bol genetik olarak özdeş döl üretir. Nedeniyle küçük boyutları nedeniyle, uygun bir bileşik, tarama kolaylaştırmak 96 oyuklu plakalar içinde yetiştirilebilir. Biz C. suşları dayalı bir fenotipik tarama protokolü sunuyoruz Bir 96-yuvalı plaka luminometre ve steril bir kabin gerekli olmasına rağmen enerji seviyelerinin in vivo sensörleri olarak hareket elegans. 14 protokolü, herhangi bir laboratuvar uygulanabilir. Bu iyi laboratuvar tekniği kullanılarak tahlillerde bulaşmasını önlemek için önemlidir. Manuel çalışan varsa, ulaşılabilir nematod plakaların sayısı 2x 96-iyi ilaç plakaların test sağlayan ve iki araç plakaları da dahil olmak üzere deney başına 13 olduğunu. Temsilcisi sonuçları Ben rotenon inhibitörü mitokondriyal kompleksi için sunulmuşture, süperoksit oluşturan paraquat'a, sitrik asit döngüsü, ara oksaloasetat ve bilinen ateşböceği lusiferaz önleyici etkinliğe sahip olan dört bileşik. Oksaloasetat, bir donanım için ATP daha kuşaktan yol açması muhtemel açtı oysa tahmin edildiği ilk iki bileşikler biyolüminesans bir düşüşe yol açtı. Oksaloasetat veri setleri de muhabir olarak ateşböceği lusiferaz dayalı deneylerde içsel değişkenlik göstermektedir. Üç bağımsız deneyin en az bilinmeyen bileşiklere yanıtların sağlamlığını tespit etmek için tavsiye edilir.

Ateşböceği lusiferaz aktivitesinin inhibisyonu, bir in vitro deney, ticari bir kit kullanılarak tanımlanabilir oldu. 3 bileşiklerin bir artan düzeylerde inhibitörü ile tutarlı bir GFP floresan önemli bir artış ile sonuçlanmıştır GFP etiketli lusiferaz enzim aktif bağlanarak ateş böceği lusiferaz site ve render daha kararlı. 15 Bazı durumlardaönleyicisi fazla alt-tabaka tarafından deplase olduğu zaman (bu özel durumda), bu biyolüminesans artmış seviyelerine sebep olabilir. 15 Dolayısıyla, önemli bir ateşböceği enzim ile etkileşime bileşiklerden hatalı sonuçları açıklamak değildir ATP seviyelerinin artmış ya da azalmış olarak / mitokondriyal fonksiyonu. Lüminesans sinyali değişiklikler oldukça sık bu tür hareket, gelişme ve büyüme gibi sağlık ek ölçümlerin ile ilişkilidir. Biyolüminesans sinyalinde dramatik bir düşüş tespit ancak solucanlar mikroskopik olarak gözlemlenmesiyle kontrollerden ayırt edilemez ise, bir örnek olarak, bir bileşiğin şüpheli lusiferaz inhibitörüdür. Olmayan büyüme ya da bileşim otofloresansı ile açıklanabilir GFP floresan bir artış, aynı zamanda bir inhibitörüne işaret edebilir. Lusiferaz inhibitörlerinin 15 bir dizi bilinen ve pubchem içine girildi. Bu nedenle, ilk etapta, bu pubchem tarafından düzenlenen lusiferaz inhibitörleri hakkında bilgi danışmak için iyi bir yöntemdir; t, ardındanEk vasıtasıyla mitokondriyal fonksiyon üzerinde etkileri saflaştırılmış enzim 3 ve / veya bir onay ile in vitro deneylerde bileşik, etkileri ayrıca ilgi çekicidir. 16,17

GFP floresans ölçümleri mümkünse biyolüminesans ile birlikte, bu son nokta ölçümü için güçlü bir hale ateşböceği lusiferaz seviyelerinin belirlenmesini (ve yukarıda ele alındığı gibi, bazı lusiferaz enzim inhibitörlerinin potansiyel algılama) sağlar. GFP'ye biyoışıldama okuma normalizasyonu de (birden fazla teknik çoğaltır dahil edilmesi ile elde edilebilir olsa da) kuyu arasındaki kurt sayısında değişimler hesaba için bir yöntemdir. Daha fazla duyarlılık için, okuma arka floresan çıkarmak için önemlidir. Protokol, ancak nematod otofloresansı akım testinin (bir sınırlama, herhangi yaşlanma stu için özellikle kritik sorumluydu değildir eşiğe bakteriyel süspansiyon katkısını değerlendiriyor) yaşla nematod otofloresansı artar verilen kalıplar. Test bileşiklerinin Otofloresans Buna paralel olarak değerlendirilmelidir. Araştırmacılar, biyoışıldama transgenin ekspresyonu seviyesinde herhangi bir suş farkları için kontrol etmek amacıyla, farklı genetik mutantlar ya da farklı genlerin susturma sonra hücresel ATP havuzlarının karşılaştırma protokolü adapte isteyen burada GFP normalleşme vazgeçilmez görünmektedir.

Protokol olan kritik parametreler maruz başlatıldığı gelişimsel aşamasında, maruz kalma süresi, ve farklı kuyularda nematodların içindeki sayılar elde edilmesini içermektedir. Maruziyet Bununla birlikte, nematod büyümesinin herhangi bir aşamasında L3 aşamasını başlatmak ya da daha büyük tercih edilir. MtDNA içeriğine, oksijen tüketimi ve ATP seviyeleri çok önemli bir artışla kanıtlandığı gibi, Bu aşamadan sonra, nematodlar, yetişkinliğe geliştirilmesi için oksidatif fosforilasyon bağlıdır. 18,19,20, mevcut protokolü Fuar Görüntüleri başlatırL4 aşamada ure. (Yerine ilk L1 aşamada gıda ile birlikte verilen zaman değil), sadece bu safhada, 96 oyuklu plakalara nematodları aliquoting nedeni, tabak buharlaşmasını en aza indirmek için, nemli odalarına yerleştirilir, ancak, buharlaştırma bir ölçüde hala meydana gelmesidir kapaklarındaki oluşturan çok küçük damlacıklar olarak görülen, bizim sallayarak inkübatör, (bu diğer sallayarak kuvöz ile ilgili bir sorun olmayabilir). Sadece ilaç standartları ilave edilmeden önce plakalara nematodları aliquoting olarak, gerçek ilaç konsantrasyonu buharlaşma nedeniyle herhangi bir hacim küçük değişkenlik etkilenmez. Araç ile bir nematod plaka yükleme yalnızca nematod eşit kuyuları arasında dağıtıldı olmadığını kontrol etmek yararlıdır. Aracın sadece plaka bulundu Herhangi önemli farklılıklar kuyulara nematotların dağıtım yoksul tekniğin göstergesi olacaktır.

Maruz bırakma uzunluğunun dikkate alınması gereken önemli bir faktördür. Bağımsız büyüme enerji durumu üzerindeki etkileri ilgi pro iseniztokol (mesela hemen hemen anında yanıtlardan, 2 saat) daha kısa maruz kalma uyum için değiştirilebilir. C. Bileşiklerin Diğer taraftan, giriş elegans dokular biraz zaman alabilir. Örneğin 12-24 saat resveratrol ve 5-floro-2'-deoksiüridin (FUDR) maksimum iç konsantrasyonlarını elde etmek için gereklidir. 21 Bu nedenle, uzun pozlama (18 saat 24) maruz kalma seviyelerini en üst düzeye çıkarmak için haklı olabilir. Pozlama süresi üreme önemli seviyeleri de yer almaya izin vermez kez sınırlı olmalıdır. Biz nematod toplam gelişimsel süresi 66-67 saat altında tutulur öneririz. Uygun olmasına rağmen, nematodlar o zaman gebe ve egglaying başlatmış bulunuyoruz. Yine de ihmal edilebilir yumurta preparasyonlardan biyolüminesans okumaları bulunan (gösterilmemiştir). Sur-5 promoter tahrikli transgen ifadesi ilk iki iki buçuk saat 100 hücre aşamasına 22 ve c döllenmeden sonra tespit edilirsehitinous kabuğu luciferase girişini sınırlamak için olasıdır. Diğer embriyolu yumurtaların gravid yetişkin metabolizması önemli ölçüde katkıda bulunmamış olduğunu bulduk. 23 Bununla birlikte, önemli bir yavru üretimine izin verir kaçınılması gereken şartlar vardır. Tercih edilmesi durumunda, deneysel zaman ölçeğini geri kaydırılabilir: Daha önce merhum L3 larva dönemi (36 saat) bir çevresel toksin maruziyeti başlatılan ve 55 saatte biyolüminesans ve GFP ölçümleri yapmışlardır şartlı steril 2 Alternatif olarak, genetik geçmişleri. Örneğin fer-15 (B 16) II gibi soy üretimini önlemek kullanılabilir; 15 ° C 'de muhafaza edilebilir (hc17) IV çift mutantı-1 fem ancak 25 ° C' de sterildir. 24 sterilite aşılamak için FudR kullanımı kendi içinde nematod metabolizmasını etkileyebilecek bu olarak tavsiye edilmez. 25 deney olabilir ayrıca kısmi-kaybı fonksiyonu olarak daha geçirgen cuticles ile suşlar yapılabilirçoklu ilaca duyarlı ilaçların geçirgenliğini artış nedeniyle. 26 olan iyon otobüs 8 mutantlar Bu kısa pozlama ve daha düşük bileşik konsantrasyonları kolaylaştıracaktır. Bu nematodlara lusiferin eklemek için koşullar da lüminesans tamponu içinde% 1 DMSO ve% 0.05 Triton-X100 lusiferin kullanılabilirliğini geliştirmek için gerekli olmayabilir, örneğin, ayarlama da gerekebilir.

Protokol bileşiği, teslimat için taşıyıcı olarak% 1 DMSO kullanır. Daha önceki bir yayında açıklanan gibi ölümcül olmasa da, DMSO bu konsantrasyon bazı biyolojik etkiye sahiptir. Mevcut ilaç kütüphanelerinin çoğu 3 aracın seyreltildikten sonra hücre bazlı deneyler için uygun olacaktır konsantrasyonlarda,% 100 DMSO içinde hazırlanmaktadır % 0.1. Yükseköğretim bileşik konsantrasyonları C. tepkiler gerekmektedir elegans da% 1'den daha düşük, DMSO de tahlilleri yapmak için çoğu zaman mümkün değildir, öyle ki, insan hücreleri ile karşılaştırıldığında. Yine, soyların kullanılması iledaha geçirgen cuticles aracın düşük konsantrasyonlarda ile test neden olabilir. DMSO daha yüksek% 1 konsantrasyonları tavsiye edilmez.

Önceki okumalara luciferase ile bir dizi inkübasyon süresi uyulmalıdır. Daha önce gösterildiği gibi, ışık yayılması aşağıdaki 30 dakika üzerinden 1 lüminesans yavaş yavaş bir azalma, ardından, lusiferin eklenmesi ilk 5 dakika boyunca nispeten sabit kalmasının ardından, ikinci dakika içinde en üst düzeye. Belirli bir kimyasal birine verilen kinetik tepkiler luciferase ilk dağıtma 30 dakika sonra, bu ilk aşamada gerçekleştirilebilir.

Protokol nematod nüfusun senkronizasyon sağlamak için yumurta toplama izleyen bir açlık adımı içerir. Farklı gelişim evreleri hücresel ATP seviyeleri farklı ve test bileşiklerinin farklı yanıt verebilir beri nematod testi popülasyonlarının senkronizasyonu öneririz. S complete içinde açlık yaparakM9 karşı orta gibi kuluçka nematod bu larvalar gelişimlerini kalmamak, bir karbon kaynağı (etanol) ile sağlanır ama tamamen aç değildir. 27,28 Ayrıca L1 tutuklandı yiyeceğine hızlı tepki için hazırlanmış ve gösterilmiştir Normal L1 büyüme hızı gıda kullanılabilir olduktan sonra 3 saat içinde ulaşılır. 29 Ancak, o ihtimali açlık adımı C metabolizmasını değiştirebilir olabilir elegans göz ardı edilemez. açlık uzunluğu 24 saat geçmemelidir Bu nedenle 30 (18 saat senkronizasyon için yeterlidir). Bazı laboratuvarlar tamamen açlık adımı atlayarak yaş senkronizasyon için Copas Biosorter kullanma imkanı olabilir. Diğer laboratuarlar önce ağartma (OP50 ile NGM plakaları) katı ortam üzerinde (adım 3.1) nematod popülasyonu genişletilmesi için bir tercih olabilir ve bu çok iyi çalışacaktır. Biz nematod kültür için bir standart ortamı, bileşik maruziyeti sırasında S ortamını kullanmak however diğer medya örneğin K orta veya EPA orta sert sular için, seçilebilir genellikle ekotoksikolojik çalışmaları için kullanılır. 31,32

Protokol bir araç taranması ve mitokondriyal fonksiyonu üzerindeki etkileri bakımından başka testler için materyal tespit etmek içerir. Primer taramada aşamasında bazı bileşikler, bu nedenle ilaç ekranları ayrıntılı olarak kabul edilmemelidir, bağlı tek bir konsantrasyonu, test edilmeden kaçırılmış olasıdır. Hitler örneği oksijen tüketimi, C için mitokondriyal fonksiyon farklı yönlerini değerlendirmek için tekniklerin kullanımı ile doğrulanabilir elegans GFP eksprese eden mitokondri suşlar, mitokondriyal membran potansiyeli ve / veya ROS ölçümleri için lekeleri. 16,33,34 metodoloji büyük önemi çok hücreli organizma seviyesinde bileşiklerin ve / veya durumların, çok sayıda taranması için bir yöntem sağlamaktır, ve önemlisi inci yararlanmak mümkünC. e genetik izlenebilirliği etki mekanizmaları araştırmak için elegans. Tekniği hızlandırmak ve ilginç bileşikler ve hedeflerin keşif yeni yollar bulmak için yardımcı olabilir. Bu bir hastalık, ilgili bağlamda bileşik kütüphanelerinin taranması için insan hastalığı ile ilişkili genetik geçmişleri ile sensörün kombinasyonu sunmak için çok sahip olacağı öngörülmektedir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank David Gray from the Dundee Drug discovery unit for kindly donating firefly luciferase inhibitory compounds DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 and DDD00023047; Tibor Harkani (Medical University of Vienna) for the suggestion of oxaloacetate as a test compound; and Charlie Dear (University of Aberdeen) for illustrations. This work was funded by a BBSRC Pathfinder award (BB/FOF/PF/4/11) and the University of Aberdeen.

Materials

Orion II Microplate Luminometer Berthold Detection Systems with injector and the Simplicity 4.2 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement
FLx800 fluorimeter  Biotek with Gen5 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement
Ks 130 basic shaking platform Ika #0002980000
Innova 4349 New Brunswick Scientific Refrigerated incubator shaker
Eppendorf centrifuge 5804R Eppendorf with eppendorf rotor A-4-44  (for 50/15ml tubes)
Stripette, Costar Corning #4489 Serological pipette
Cellstar 50 ml tubes Greiner bio-one #227661
Cellstar 15 ml tubes Greiner bio-one #188261
Cellstar 60 mm tissue culture plates  Greiner bio-one #628160
Superfrost Microscope slides VWR #631-0909
Sterile spatula Corning #3007; #3004 for weighing out chemicals
0.22 mM Millex GP filters Millipore #SLGP033RS
Axygen eppendorf tubes 1.5 ml Fisher Scientific #MCT-150-R
Corning 96 well assay plate VWR #3603 Black plate clear bottom with lid
Nunc 96 well assay plate Fisher Scientific #236105 White plate with lid
Reservoir reagent 60 mL Thermo Scientific Finnpipette #9510027 used as trough for nematodes  in protocol section 4.4.1)
Storage box/damp chamber Roche Diagnostics #10 800 058 001 174 x101 x 56.6 mm, used as a damp chamber with wet paper towels; 2X 96-well plates with lids can fit into one, the lower sitting on top of a microplate lid
Bleach: Sodium hypochlorite solution 4-4.99% Chlorine content Sigma Aldrich #239305 Store in aliquots at 4°C,  seal with parafilm to prevent loss of chlorine and cover in foil
D-Luciferin, potassium salt Biotium Inc # 10101-2 Molecular Probes can also be used as supplier; prepare a 20 mM stock in ddH2O, keep at -20 °C in aliquots
Tween 20 Sigma Aldrich # P9416
DMSO CalBiochem #317275 Purity 99.99%
Triton X100 Alfa Aesar #A16046 Diltute to 10% in ddH20
Nystatin CalBiochem #475914
C. elegans bioluminescent strains Author's own laboratory PE254, PE255 contain integrated arrays feIs4 and feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] respectively on chromossome V and X; select for homogeneous and strong expression of luc::GFP by fluorescence microscopy (e.g. pick 15 worms) every now and then.
E. coli OP50 CGC
General chemicals Sigma Aldrich/Fisher Scientific
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lagido, C., Pettitt, J., Flett, A., Glover, L. A. Bridging the phenotypic gap: real-time assessment of mitochondrial function and metabolism of the nematode Caenorhabditis elegans. BMC Physiol. 8, 7 (2008).
  2. Lagido, C., McLaggan, D., Flett, A., Pettitt, J., Glover, L. A. Rapid sublethal toxicity assessment using bioluminescent Caenorhabditis elegans, a novel whole-animal metabolic biosensor. Toxicol Sci. 109, 88-95 (2009).
  3. McLaggan, D., et al. Impact of sublethal levels of environmental pollutants found in sewage sludge on a novel Caenorhabditis elegans model biosensor. PloS one. 7, e46503 (2012).
  4. Rodriguez-Enriquez, S., Juarez, O., Rodriguez-Zavala, J. S., Moreno-Sanchez, R. Multisite control of the Crabtree effect in ascites hepatoma cells. Eur J Biochem. 268, 2512-2519 (2001).
  5. Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants. Toxicol Sci. 97, 539-547 (2007).
  6. Rooney, J. P., et al. Effects of 5′-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans. Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).
  7. Bodhicharla, R., Ryde, I. T., Prasad, G. L., Meyer, J. N. The tobacco-specific nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) induces mitochondrial and nuclear DNA damage in Caenorhabditis elegans. Environ Mol Mutagen. 55, 43-50 (2014).
  8. Leung, M. C., et al. Effects of early life exposure to ultraviolet C radiation on mitochondrial DNA content, transcription, ATP production, and oxygen consumption in developing Caenorhabditis elegans. BMC Pharmacol Toxicol. 14, 9 (2013).
  9. Kuang, J. J., Ebert, P. R. The failure to extend lifespan via disruption of complex II is linked to preservation of dynamic control of energy metabolism. Mitochondrion. 12, 280-287 (2012).
  10. Lagido, C., Pettitt, J., Porter, A. J., Paton, G. I., Glover, L. A. Development and application of bioluminescent Caenorhabditis elegans as multicellular eukaryotic biosensors. FEBS Lett. 493, 36-39 (2001).
  11. Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).
  12. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  13. Brenk, R., et al. Lessons learnt from assembling screening libraries for drug discovery for neglected diseases. ChemMedChem. 3, 435-444 (2008).
  14. Lagido, C., Wilson, M. J., Kakouli-Duarte, T. . Nematodes as environmental indicators. , 225-251 (2009).
  15. Thorne, N., et al. Firefly luciferase in chemical biology: a compendium of inhibitors, mechanistic evaluation of chemotypes, and suggested use as a reporter. Chem Biol. 19, 1060-1072 (2012).
  16. Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497, 451-457 (2013).
  17. Andreux, P. A., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. Pharmacological approaches to restore mitochondrial function. Nat Rev Drug Discov. 12, 465-483 (2013).
  18. Tsang, W. Y., Lemire, B. D. Mitochondrial genome content is regulated during nematode development. Biochem Bioph Res Co. 291, 8-16 (2002).
  19. Decuyper, C., Vanfleteren, J. R. Oxygen-Consumption during Development and Aging of the Nematode Caenorhabditis-Elegans. Comp Biochem Phys A. 73, 283-289 (1982).
  20. Dillin, A., et al. Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development. Science. 298, 2398-2401 (2002).
  21. Zheng, S. Q., Ding, A. J., Li, G. P., Wu, G. S., Luo, H. R. Drug absorption efficiency in Caenorhbditis elegans delivered by different methods. PloS one. 8, e56877 (2013).
  22. Yochem, J., Gu, T., Han, M. A new marker for mosaic analysis in Caenorhabditis elegans indicates a fusion between hyp6 and hyp7, two major components of the hypodermis. Genetics. 149, 1323-1334 (1998).
  23. Vanfleteren, J. R., DeVreese, A. Rate of aerobic metabolism and superoxide production rate potential in the nematode Caenorhabditis elegans. J Exp Zool. 274, 93-100 (1996).
  24. Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161, 1101-1112 (2002).
  25. Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).
  26. Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis. Dev Biol. 317, 549-559 (2008).
  27. Castro, P. V., Khare, S., Young, B. D., Clarke, S. G. Caenorhabditis elegans Battling Starvation Stress: Low Levels of Ethanol Prolong Lifespan in L1 Larvae. PloS one. 7, (2012).
  28. Baugh, L. R. To Grow or Not to Grow: Nutritional Control of Development During Caenorhabditis elegans L1 Arrest. Genetics. 194, 539-555 (2013).
  29. Baugh, L. R., DeModena, J., Sternberg, P. W. RNA Pol II Accumulates at Promoters of Growth Genes During Developmental Arrest. Science. 324, 92-94 (2009).
  30. Maxwell, C. S., Antoshechkin, I., Kurhanewicz, N., Belsky, J. A., Baugh, L. R. Nutritional control of mRNA isoform expression during developmental arrest and recovery in C. elegans. Genome Res. 22, 1920-1929 (2012).
  31. Cressman, C. P., Williams, P. L. Reference toxicants for toxicity testing using Caenorhabditis elegans in aquatic media. Am Soc Test Mater. 131, 518-532 (1997).
  32. Khanna, N., Cressman, C. P., Tatara, C. P., Williams, P. L. Tolerance of the nematode Caenorhabditis elegans to pH, salinity, and hardness in aquatic media. Arch Environ Con Tox. 32, 110-114 (1997).
  33. Benedetti, C., Haynes, C. M., Yang, Y., Harding, H. P., Ron, D. Ubiquitin-like protein 5 positively regulates chaperone gene expression in the mitochondrial unfolded protein response. Genetics. 174, 229-239 (2006).
  34. Yang, W., Hekimi, S. A Mitochondrial Superoxide Signal Triggers Increased Longevity in Caenorhabditis elegans. Plos Biol. 8, (2010).

Tags

Caenorhabditis ElegansBioluminescentLuciferaseATP LevelsMitochondrial ModulatorsIn Vivo AssayScreeningParaquatRotenoneOxaloacetateFirefly Luciferase InhibitorsOxidative PhosphorylationDrug ToxicityMulticellular Organism

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lagido, C., McLaggan, D., Glover, L. A. A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (104), e53083, doi:10.3791/53083 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image