Ein screenbaren<em> In-vivo-</em> Assay für Mitochondriale Modulatoren Verwendung transgener Bioluminescent<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.
Abstract
The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode’s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.
Introduction
Der Zweck dieses Verfahrens ist die schnelle Quantifizierung des Energiestatus von C. elegans in vivo im Hinblick auf die mit dieser als ein Endpunkt in Verbindung Screening. Das Grundprinzip ist bei der transgenen Expression der Luciferase in dem Fadenwurm C. basierend elegans 1-3 über das Plasmid pSLGCV (1 https://www.addgene.org/49862). Die Luciferase-Enzyms zu dem grün fluoreszierenden Protein GFP fusioniert ist und konstitutiv und ubiquitär im Zytoplasma exprimiert (die Luciferase Peroxisomen-Targeting-Signal entfernt wurde). Dies führt zu einer Lichtemission, wenn das Substrat Luciferin wird exogen bereitgestellt. Da die Schnecken transparent ist, kann das Licht in einem Luminometer als relative Lichteinheiten (RLU) gemessen werden. Zellulären ATP-Kraftstoffe der Biolumineszenzreaktion und seine Verfügbarkeit bestimmt die erzeugte Lichtpegel. Folglich bietet Luminometrie eine convenient Mittel zur Bewertung in Bezug ATP-Spiegel und durch die Erweiterung der mitochondrialen Funktion, da die ATP-Produktion erfolgt hauptsächlich in den Mitochondrien. Eine Verbindung zwischen mitochondrialen Funktion und Biolumineszenz Ebenen zuvor durch das Silencing der mitochondrialen Elektronentransportkette Gene und damit einhergehenden reduzierten Lichtleistung gezeigt. 1
Die Biolumineszenz-Stämme erzeugt wurden PE254 (feIs4) bezeichnet und PE255 (feIs5) 1 (siehe Materialliste) und können untereinander ausgetauscht werden. 3 Eine Reihe von Studien haben diese Sensor-Stämme verwendet werden, um auf die zelluläre ATP-Spiegel in vivo berichten nach Exposition gegenüber verschiedenen xenobiotischen Chemikalien wie Natriumazid 1, Cadmium 2, Abwasser Schlammextrakt 3, 5'-Fluor-2-desoxyuridin 6 und eine tabakspezifische Nitrosamin 7. Die Stämme sind auch nützlich gewesen, um Auswirkungen der Bestrahlung mit UV-C-Strahlung zu überwachen <sbis> 8 und Wirkungen der Störung der mitochondrialen Atmungskette. 1,9 Eine frühe Version Lumineszenzsensor das Luciferase-Gen exprimieren, ohne GFP-Fusion (PE39) wurde ebenfalls in die Untersuchung der Wirkung von Schwermetallen und eines Atmungs verwendet . Entkoppler 10 Stämme PE254 und PE255 tragen das Luciferase: GFP-Fusions und GFP-Fluoreszenz wurde gezeigt, proportional mit Nematodenmasse zu erhöhen und bietet ein bequemes Mittel zur Normalisierung der Lumineszenz-Werte 6,9 Die Auswirkungen der Unterschiedsbetrag von Würmern pro Vertiefung kann auch sein. indem mehrere technische Replikate in dem Test (mindestens 5 Vertiefungen pro Bedingung) berücksichtigt. 3
Das Protokoll bietet die Möglichkeit der in vivo-Überwachung von Energieniveaus (im Gegensatz zu technisch umständlich in vitro ATP Bestimmungen) ermöglicht Wirkstoff-Screenings und Neupositionierung im physiologischen Kontext der gesamten multicellular Organismus. Das Verfahren kann auf eine Vielzahl von genetischen Hintergründen durch Kreuzung der chromosomal integriertes Transgen in verfügbar Mutantenstämme und / oder durch Abschaltung von Genen durch RNA-Interferenz verlängert werden; somit unter voller Nutzung der C elegans als Modellorganismus. Das Verfahren soll helfen, Spätphasenausfall von Wirkstoffkandidaten zu reduzieren durch mitochondriale Toxizität und einen Beitrag zur Verringerung der höheren Tierversuche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Modellorganismus C. elegans stellt ein leistungsfähiges experimentelles System. Es ist leicht, Kultur und produziert reichlich genetisch identische Nachkommen mit einer 3,5 Tage Lebenszyklus vom Ei bis zum Reproduzieren Erwachsenen (über juvenile Larvenstadien L1 bis L4). Aufgrund seiner geringen Größe, kann es bequem in 96-Well-Platten gezüchtet werden, die Erleichterung Substanz-Screening. Wir präsentieren eine phänotypische Screening-Protokoll basierend auf Stämme von C. elegans, die als in vivo Sensoren von Energieniveaus dienen. 14 Das Protokoll ist anwendbar auf jedes Labor, obwohl eine 96-Well-Platte Luminometer und einem sterilen Gehäuse ist nicht notwendig. Es ist wichtig, um eine Kontamination in Assays durch die Verwendung eines Labortechnik verhindern. Wenn sie manuell arbeiten, ist die maximale Anzahl der Nematodenplatten erzielbare 13 pro Versuch ermöglicht die Prüfung von 2x 96-well Platten Medikament ist und zwei Fahrzeug-Platten. Repräsentative Ergebnisse sind für die mitochondriale Komplex I Inhibitor Rotenon vorgestellte, die Superoxid-Generator Paraquat, dem Zitronensäurezyklus Zwischen Oxalacetat und vier Verbindungen mit bekannten Leuchtkäfer-Luciferase-inhibitorische Aktivität. Die ersten beiden Verbindungen führte zu einer Abnahme der Biolumineszenz wie vorherwohin Oxalacetat führte zu einer Verbesserung, eher von größer Erzeugung von ATP führen. Die Oxalacetat Datensätzen auch die intrinsische Variabilität bei Experimenten basierend auf Leuchtkäfer-Luciferase als Reporter zu demonstrieren. Ein Minimum von drei unabhängigen Experimenten sind ratsam, um die Robustheit der Antworten auf nicht bekannten Verbindungen festzustellen.
Inhibition der Firefly-Luciferase-Aktivität war erkennbar mit einem in vitro-Assay unter Verwendung eines kommerziellen Kits. 3 Eine der Verbindungen führte zu einem erheblichen Anstieg der GFP-Fluoreszenz, die mit dem Inhibitor die Erhöhung des Niveaus der GFP-markierten Luciferase durch Bindung an das Luciferase-Enzym die aktive Stelle und macht sie stabiler. 15 In einigen Fällen(in diesem besonderen Fall) kann dies zu erhöhten Werten von Biolumineszenz 15 führen, wenn der Inhibitor durch überschüssiges Substrat verschoben wird. Es ist daher wichtig, nicht zu Ergebnissen irrtümlich aus Verbindungen, die mit dem Glühwürmchen-Enzyms in Wechselwirkung zu interpretieren, wie verringerte oder erhöhte ATP-Spiegel / Funktion der Mitochondrien. Veränderungen in Lumineszenzsignal korrelieren oft mit zusätzlichen Messungen der Gesundheit wie Bewegung, Entwicklung und Wachstum. Als ein Beispiel, ist eine Verbindung, ein Verdächtiger Luciferase-Inhibitor, wenn ein dramatischer Rückgang der Biolumineszenz-Signal erkannt wird, aber Würmer sind nicht von Kontrollen durch mikroskopische Beobachtung. Eine Erhöhung der GFP-Fluoreszenz, nicht durch das Wachstum oder die Autofluoreszenzverbindung erläutert, kann auch auf eine Inhibitor. Eine Anzahl von Luciferase Inhibitoren 15 sind bekannt und wurden in PubChem eingegeben. Daher in erster Linie ist es gute Praxis, Informationen über Luciferase Inhibitoren durch PubChem gehalten zu konsultieren; gefolgt von testing der Wirkungen der Verbindung in in vitro-Tests mit dem gereinigten Enzym 3 und / oder die Bestätigung von Wirkungen auf die Funktion der Mitochondrien durch zusätzliche Mittel. 16,17
GFP-Fluoreszenz-Messungen ermöglichen die Erkennung von Glühwürmchen-Luciferase-Ebenen (und das Potenzial Nachweis einiger Luciferase-Enzym-Inhibitoren, wie oben erörtert) machen ein starkes Argument für die Messung dieser Endpunkt neben Biolumineszenz, soweit möglich. Normalisierung der Messwerte auf Biolumineszenz GFP ist auch ein Mittel zur Berücksichtigung der Unterschiede in Wurmzahlen zwischen Vertiefungen (obwohl dies auch durch Einschluss von mehreren technischen Wiederholungen erreicht werden). Zu einer höheren Empfindlichkeit, ist es wichtig, um Hintergrundfluoreszenz von den Messungen subtrahiert. Das Protokoll beurteilt Beitrag der Bakteriensuspension auf die Hintergrund-Fluoreszenz jedoch Nematodenautofluoreszenz ist nicht für (eine Begrenzung der Strom Assay für jede Alterungs stu besonders kritisch entfielenstirbt da Nematoden Autofluoreszenz steigt mit dem Alter). Autofluoreszenz der Testverbindungen sollten auch parallel bewertet werden. GFP Normalisierung scheint unverzichtbar, wo Forscher wollen Protokoll anzupassen, um zelluläre ATP-Pools in verschiedenen genetischen Mutanten oder nach dem Schweigen der verschiedenen Genen zu vergleichen, um für Dehnungsunterschiede auf dem Niveau der Expression des Transgens Biolumineszenz steuern.
Kritischen Parameter innerhalb des Protokolls sind die Entwicklungsstufe, bei der Belichtung initiiert wird, der Dauer der Einwirkung und Erhalten ähnliche Anzahl von Nematoden in verschiedenen Vertiefungen. Die Belichtung kann in jedem Stadium der Entwicklung der Nematoden L3 Stadium beginnen jedoch älter ist vorzuziehen. Von diesem Zeitpunkt an, Nematoden sind abhängig von der oxidativen Phosphorylierung für die Entwicklung bis ins Erwachsenenalter, wie durch einen sehr deutlichen Anstieg der mtDNA Gehalt, Sauerstoffverbrauch und ATP-Spiegel zeigt. 18,19,20 Das vorliegende Protokoll initiiert Ausstellungenure im L4-Stadium. Der Grund für das Aliquotieren von Nematoden auf 96-Well-Platten in diesem Stadium nur (und nicht, wenn sie zum ersten Mal mit der Nahrung im L1 Stufe vorgesehen ist), ist, dass obwohl Platten in feuchten Kammern angeordnet, um Verdampfung zu minimieren, eine Verdampfungsgrad noch auftritt unsere Schüttelinkubator, wie sehr kleine Tröpfchen bilden auf den Deckeln zu sehen (das kann nicht ein Problem mit anderen Schüttelinkubatoren sein). Aliquotieren von Nematoden, Platten unmittelbar vor der Zugabe von Arzneimittel-Standards, dem eigentlichen Wirkstoffkonzentration nicht durch irgendeine kleine Veränderung des Volumens durch Verdunstung beeinflusst wird. Laden eines Nematodenplatte mit dem Vehikel allein ist sinnvoll, zu prüfen, ob Nematoden wurden gleichmäßig zwischen Vertiefungen verteilt. Signifikante Unterschiede für das Fahrzeug nur Schild wäre bezeichnend für schlechte Technik werden bei der Abgabe die Nematoden in die Vertiefungen.
Die Belichtungsdauer ist ein wichtiger Faktor zu berücksichtigen. Wenn Auswirkungen auf den Energiestatus unabhängig von Wachstum sind von Interesse, die Pro-Protokoll modifiziert werden, um kürzere Expositionen (fast unmittelbaren Reaktionen auf, zum Beispiel, 2 h) unterzubringen. Auf der anderen Seite, Eintrag von Verbindungen in C. elegans Geweben kann einige Zeit dauern. Beispielsweise 12-24 h erforderlich sind, um maximale innere Konzentrationen von Resveratrol und 5-Fluor-2'-desoxyuridin (FUdR) zu erreichen. 21 daher eine längere Belichtungszeit (18 bis 24 h) kann gerechtfertigt Belichtungspegel zu maximieren. Die Belichtungszeit sollte auf Zeiten, in denen nicht ein erhebliches Maß an Wiedergabe, um Platz in der gut zu nehmen beschränkt werden. Wir empfehlen, dass die Gesamtentwicklungszeit von Nematoden unter 66-67 h gehalten. Obwohl praktisch, sind Nematoden bis dahin trächtig und haben Eiablage begonnen. Dennoch fanden wir Biolumineszenz-Messwerte von Eierzubereitungen vernachlässigbar zu sein (nicht dargestellt). Die sur-5-Promotor gesteuerte Expression des Transgens zuerst erkannt nur zwei bis zweieinhalb Stunden nach der Befruchtung bei der 100-Zellstadium 22 und der chitinous Eierschale ist wahrscheinlich, um den Eintritt von Luciferin zu begrenzen. Andere haben festgestellt, dass embryonierten Eiern nicht wesentlich dazu beitragen, den Stoffwechsel von schwangeren Erwachsenen. 23 jedoch zu vermeidende Bedingungen, die für bedeutende Nachkommen Produktion sind. Falls gewünscht, kann der experimentellen Zeitskala wieder verschoben werden: Wir haben zuvor initiierten Exposition gegenüber einem Umweltgift am späten L3 Larvenstadium (36 hr) und aus Biolumineszenz und GFP-Messungen bei 55 h durchgeführt 2 Alternativ genetischen Hintergründen, die bedingt steril sind. kann verwendet werden, um Nachkommen Produktion zu verhindern, wie zum Beispiel die fer-15 (b16) II; Fem-1 (HC17) IV-Doppelmutante, die bei 15 ° C gehalten werden kann, ist aber sterile bei 25 ° C. 24. Die Verwendung von FUDR zur Sterilität induziert wird nicht empfohlen, da dies kann selbst betreffen Nematodenstoffwechsels. 25. Der Test konnte auch in Stämmen mit permeabler cuticles wie partielle Verlust-Funkt geführt werdenIonen-Bus-8-Mutanten, die Multidrug-sensitive aufgrund Lässigkeit von Medikamenten zu erhöhen. 26 Dies wird kürzere Belichtungen und niedrigere Verbindungskonzentrationen erleichtern. Die Bedingungen für das Hinzufügen von Luciferin zu diesen Nematoden müssen möglicherweise auch Anpassung dh 1% DMSO und 0,05% Triton-X100 in der Lumineszenz-Puffer kann nicht verlangt werden Luciferin Verfügbarkeit zu verbessern.
Das Protokoll verwendet 1% DMSO als Vehikel für Verbindung Lieferung. Obwohl nicht tödlich, diese Konzentration des DMSO hat einige biologische Wirkungen, wie wir in einer früheren Veröffentlichung. 3 diskutiert Viele der verfügbaren Medikamentenbibliotheken werden in 100% hergestellt DMSO, bei Konzentrationen, die nach Verdünnung Fahrzeug für zellbasierte Assays sein wird bis 0,1%. Höhere Konzentrationen der Verbindung erforderlich sind, um Antworten in C hervorzurufen elegans, wenn sie mit menschlichen Zellen, so daß es oft nicht möglich, Tests bei weniger als 1% DMSO durchzuführen, verglichen. Wiederum ist die Verwendung von Stämmen mitlässiger Nagelhaut kann auf die Prüfung mit geringeren Konzentrationen von Fahrzeug zu führen. Konzentrationen von DMSO von über 1% sind nicht zu empfehlen.
Eine Reihe Inkubationszeit mit Luciferin vor Lesungen sollten eingehalten werden. Seinen Maximalpegel innerhalb der zweiten Minute, wie zuvor gezeigt, erreicht Lumineszenz nach Zugabe von Luciferin, relativ stabil bleibt für die ersten 5 min, gefolgt von einer langsamen Abnahme der Lumineszenz schrittweise über die nächsten 30 min 1. Kinetischen Antworten auf eine bestimmte Chemikalie kann während dieser ersten Phase von 30 min nach der anfänglichen Dosierung von Luciferin durchgeführt werden.
Das Protokoll beinhaltet eine Hungersnot Schritt nach der Entnahme von Eiern, um die Synchronisation der Nematodenpopulation zu erreichen. Wir empfehlen Synchronisation von Nematodentest Populationen seit verschiedenen Entwicklungsstadien unterscheiden sich in zellulären ATP-Spiegel und können unterschiedlich auf die Testverbindungen zu reagieren. Durch die Durchführung der Hunger in S KomplettMedium gegenüber M9 werden die Brut Nematoden mit einer Kohlenstoffquelle (Ethanol) 27,28 versehen, so daß Larven entwickeln sich nicht, sind aber nicht vollkommen ausgehungerte. Es hat sich auch gezeigt, dass L1 verhaftet sind für eine schnelle Reaktion auf Lebensmittel grundiert und normale L1 Wachstumsrate wird innerhalb von 3 Stunden nach dem Essen zur Verfügung steht 29 jedoch die Möglichkeit erreicht., es, dass der Hunger-Schritt kann den Stoffwechsel von C. ändern elegans kann nicht ausgeschlossen werden. 30 Aus diesem Grund ist die Länge des Hungers sollte 24 Stunden nicht überschreiten (18 Stunden ist ausreichend für die Synchronisation). Einige Labors haben die Möglichkeit, mit Hilfe eines Copas Biosorter für Alter Synchronisation Umgehung des Hungers Schritt ganz. Andere Laboratorien können eine Präferenz für die Erweiterung des Nematodenpopulation auf festen Medien (NGM-Platten mit OP50) vor dem Bleichen (Schritt 3.1) haben, und das wird auch gut funktionieren. Wir verwenden S Medium während der Verbindung Exposition als Standardmedium für Nematodenkultivierung, however andere Medien ausgewählt werden, zum Beispiel K Medium oder EPA mäßig hartem Wasser werden oft für ökotoxikologische Untersuchungen verwendet. 31,32
Das Protokoll bietet eine Möglichkeit, zu screenen und zu Kandidaten für weitere Untersuchungen im Hinblick auf die Auswirkungen auf die Funktion der Mitochondrien zu identifizieren. Auf der Stufe der primären Screening ist es wahrscheinlich, dass einige Verbindungen wird durch nur eine Konzentration getestet sehen wurden daher Drogen-Bildschirme sollte nicht als erschöpfend betrachtet werden. Zugriffe kann durch die Verwendung von Techniken zur Bewertung verschiedener Aspekte der mitochondrialen Funktion beispielsweise der Sauerstoffverbrauch, C. validieren elegans-Stämme mit GFP-exprimierenden Mitochondrien, Flecke für mitochondriale Membranpotential und / oder ROS-Messungen. 16,33,34 Die größte Bedeutung der Methodik ist es, eine Einrichtung zum Sortieren von großen Anzahl von Verbindungen und / oder Bedingungen an der vielzelligen Organismen Pegel haben, und vor allem in der Lage sein, die Vorteile der th nehmene genetische Lenkbarkeit von C. elegans, um Wirkmechanismen zu untersuchen. Die Technik kann helfen, zu beschleunigen und zu finden, neue Wege zur Entdeckung interessanter Verbindungen und Ziele. Es ist vorgesehen, dass die Kombination des Sensors mit genetischen Hintergründen mit menschlichen Krankheiten für das Screening von Substanzbibliotheken in einem krankheitsrelevanten Kontext zugeordnet wird viel zu bieten haben.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank David Gray from the Dundee Drug discovery unit for kindly donating firefly luciferase inhibitory compounds DDD00001434, DDD0001477, DDD00000635 and DDD00023047; Tibor Harkani (Medical University of Vienna) for the suggestion of oxaloacetate as a test compound; and Charlie Dear (University of Aberdeen) for illustrations. This work was funded by a BBSRC Pathfinder award (BB/FOF/PF/4/11) and the University of Aberdeen.
Materials
| Orion II Microplate Luminometer | Berthold Detection Systems | with injector and the Simplicity 4.2 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement | |
| FLx800 fluorimeter | Biotek | with Gen5 Software; transfer data to Excel at the end of plate measurement | |
| Ks 130 basic shaking platform | Ika | #0002980000 | |
| Innova 4349 | New Brunswick Scientific | Refrigerated incubator shaker | |
| Eppendorf centrifuge 5804R | Eppendorf | with eppendorf rotor A-4-44 (for 50/15ml tubes) | |
| Stripette, Costar | Corning | #4489 | Serological pipette |
| Cellstar 50 ml tubes | Greiner bio-one | #227661 | |
| Cellstar 15 ml tubes | Greiner bio-one | #188261 | |
| Cellstar 60 mm tissue culture plates | Greiner bio-one | #628160 | |
| Superfrost Microscope slides | VWR | #631-0909 | |
| Sterile spatula | Corning | #3007; #3004 | for weighing out chemicals |
| 0.22 mM Millex GP filters | Millipore | #SLGP033RS | |
| Axygen eppendorf tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | #MCT-150-R | |
| Corning 96 well assay plate | VWR | #3603 | Black plate clear bottom with lid |
| Nunc 96 well assay plate | Fisher Scientific | #236105 | White plate with lid |
| Reservoir reagent 60 mL | Thermo Scientific Finnpipette | #9510027 | used as trough for nematodes in protocol section 4.4.1) |
| Storage box/damp chamber | Roche Diagnostics | #10 800 058 001 | 174 x101 x 56.6 mm, used as a damp chamber with wet paper towels; 2X 96-well plates with lids can fit into one, the lower sitting on top of a microplate lid |
| Bleach: Sodium hypochlorite solution 4-4.99% Chlorine content | Sigma Aldrich | #239305 | Store in aliquots at 4°C, seal with parafilm to prevent loss of chlorine and cover in foil |
| D-Luciferin, potassium salt | Biotium Inc | # 10101-2 | Molecular Probes can also be used as supplier; prepare a 20 mM stock in ddH2O, keep at -20 °C in aliquots |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | # P9416 | |
| DMSO | CalBiochem | #317275 | Purity 99.99% |
| Triton X100 | Alfa Aesar | #A16046 | Diltute to 10% in ddH20 |
| Nystatin | CalBiochem | #475914 | |
| C. elegans bioluminescent strains | Author's own laboratory | PE254, PE255 | contain integrated arrays feIs4 and feIs5 [Psur-5::luc+::gfp; rol-6(su1006)] respectively on chromossome V and X; select for homogeneous and strong expression of luc::GFP by fluorescence microscopy (e.g. pick 15 worms) every now and then. |
| E. coli OP50 | CGC | ||
| General chemicals | Sigma Aldrich/Fisher Scientific |
References
- Lagido, C., Pettitt, J., Flett, A., Glover, L. A. Bridging the phenotypic gap: real-time assessment of mitochondrial function and metabolism of the nematode Caenorhabditis elegans. BMC Physiol. 8, 7 (2008).
- Lagido, C., McLaggan, D., Flett, A., Pettitt, J., Glover, L. A. Rapid sublethal toxicity assessment using bioluminescent Caenorhabditis elegans, a novel whole-animal metabolic biosensor. Toxicol Sci. 109, 88-95 (2009).
- McLaggan, D., et al. Impact of sublethal levels of environmental pollutants found in sewage sludge on a novel Caenorhabditis elegans model biosensor. PloS one. 7, e46503 (2012).
- Rodriguez-Enriquez, S., Juarez, O., Rodriguez-Zavala, J. S., Moreno-Sanchez, R. Multisite control of the Crabtree effect in ascites hepatoma cells. Eur J Biochem. 268, 2512-2519 (2001).
- Marroquin, L. D., Hynes, J., Dykens, J. A., Jamieson, J. D., Will, Y. Circumventing the Crabtree effect: replacing media glucose with galactose increases susceptibility of HepG2 cells to mitochondrial toxicants. Toxicol Sci. 97, 539-547 (2007).
- Rooney, J. P., et al. Effects of 5′-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans. Exp Gerontol. 56, 69-76 (2014).
- Bodhicharla, R., Ryde, I. T., Prasad, G. L., Meyer, J. N. The tobacco-specific nitrosamine 4-(methylnitrosamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone (NNK) induces mitochondrial and nuclear DNA damage in Caenorhabditis elegans. Environ Mol Mutagen. 55, 43-50 (2014).
- Leung, M. C., et al. Effects of early life exposure to ultraviolet C radiation on mitochondrial DNA content, transcription, ATP production, and oxygen consumption in developing Caenorhabditis elegans. BMC Pharmacol Toxicol. 14, 9 (2013).
- Kuang, J. J., Ebert, P. R. The failure to extend lifespan via disruption of complex II is linked to preservation of dynamic control of energy metabolism. Mitochondrion. 12, 280-287 (2012).
- Lagido, C., Pettitt, J., Porter, A. J., Paton, G. I., Glover, L. A. Development and application of bioluminescent Caenorhabditis elegans as multicellular eukaryotic biosensors. FEBS Lett. 493, 36-39 (2001).
- Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. Methods Cell Biol. 48, 3-29 (1995).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Brenk, R., et al. Lessons learnt from assembling screening libraries for drug discovery for neglected diseases. ChemMedChem. 3, 435-444 (2008).
- Lagido, C., Wilson, M. J., Kakouli-Duarte, T. . Nematodes as environmental indicators. , 225-251 (2009).
- Thorne, N., et al. Firefly luciferase in chemical biology: a compendium of inhibitors, mechanistic evaluation of chemotypes, and suggested use as a reporter. Chem Biol. 19, 1060-1072 (2012).
- Houtkooper, R. H., et al. Mitonuclear protein imbalance as a conserved longevity mechanism. Nature. 497, 451-457 (2013).
- Andreux, P. A., Houtkooper, R. H., Auwerx, J. Pharmacological approaches to restore mitochondrial function. Nat Rev Drug Discov. 12, 465-483 (2013).
- Tsang, W. Y., Lemire, B. D. Mitochondrial genome content is regulated during nematode development. Biochem Bioph Res Co. 291, 8-16 (2002).
- Decuyper, C., Vanfleteren, J. R. Oxygen-Consumption during Development and Aging of the Nematode Caenorhabditis-Elegans. Comp Biochem Phys A. 73, 283-289 (1982).
- Dillin, A., et al. Rates of behavior and aging specified by mitochondrial function during development. Science. 298, 2398-2401 (2002).
- Zheng, S. Q., Ding, A. J., Li, G. P., Wu, G. S., Luo, H. R. Drug absorption efficiency in Caenorhbditis elegans delivered by different methods. PloS one. 8, e56877 (2013).
- Yochem, J., Gu, T., Han, M. A new marker for mosaic analysis in Caenorhabditis elegans indicates a fusion between hyp6 and hyp7, two major components of the hypodermis. Genetics. 149, 1323-1334 (1998).
- Vanfleteren, J. R., DeVreese, A. Rate of aerobic metabolism and superoxide production rate potential in the nematode Caenorhabditis elegans. J Exp Zool. 274, 93-100 (1996).
- Garigan, D., et al. Genetic analysis of tissue aging in Caenorhabditis elegans: a role for heat-shock factor and bacterial proliferation. Genetics. 161, 1101-1112 (2002).
- Davies, S. K., Leroi, A. M., Bundy, J. G. Fluorodeoxyuridine affects the identification of metabolic responses to daf-2 status in Caenorhabditis elegans. Mech Ageing Dev. 133, 46-49 (2012).
- Partridge, F. A., Tearle, A. W., Gravato-Nobre, M. J., Schafer, W. R., Hodgkin, J. The C. elegans glycosyltransferase BUS-8 has two distinct and essential roles in epidermal morphogenesis. Dev Biol. 317, 549-559 (2008).
- Castro, P. V., Khare, S., Young, B. D., Clarke, S. G. Caenorhabditis elegans Battling Starvation Stress: Low Levels of Ethanol Prolong Lifespan in L1 Larvae. PloS one. 7, (2012).
- Baugh, L. R. To Grow or Not to Grow: Nutritional Control of Development During Caenorhabditis elegans L1 Arrest. Genetics. 194, 539-555 (2013).
- Baugh, L. R., DeModena, J., Sternberg, P. W. RNA Pol II Accumulates at Promoters of Growth Genes During Developmental Arrest. Science. 324, 92-94 (2009).
- Maxwell, C. S., Antoshechkin, I., Kurhanewicz, N., Belsky, J. A., Baugh, L. R. Nutritional control of mRNA isoform expression during developmental arrest and recovery in C. elegans. Genome Res. 22, 1920-1929 (2012).
- Cressman, C. P., Williams, P. L. Reference toxicants for toxicity testing using Caenorhabditis elegans in aquatic media. Am Soc Test Mater. 131, 518-532 (1997).
- Khanna, N., Cressman, C. P., Tatara, C. P., Williams, P. L. Tolerance of the nematode Caenorhabditis elegans to pH, salinity, and hardness in aquatic media. Arch Environ Con Tox. 32, 110-114 (1997).
- Benedetti, C., Haynes, C. M., Yang, Y., Harding, H. P., Ron, D. Ubiquitin-like protein 5 positively regulates chaperone gene expression in the mitochondrial unfolded protein response. Genetics. 174, 229-239 (2006).
- Yang, W., Hekimi, S. A Mitochondrial Superoxide Signal Triggers Increased Longevity in Caenorhabditis elegans. Plos Biol. 8, (2010).
