スクリーニング可能<em>インビボ</em>トランスジェニック生物発光を使用したミトコンドリアモジュレーターについてのアッセイ<em>線虫（Caenorhabditis elegans）</em

注：（126°C、11分間オートクレーブ処理することによって）滅菌条件（クリーンベンチ）の下と予め滅菌材料とのすべてのステップを実行します。画線大腸菌を含むLBプレート大腸菌 OP50は4℃に維持し、必要な新鮮なLBプレート上にストリークアウト毎月restreakされます。 1.細菌性食品（ 大腸菌 OP50）準備 1日目接種大腸菌の単一コロニーを持つ2つのユニバーサルボトルで2×5ミリリットルのLB 8時間、37°C（220 rpm）で振盪インキュベーターで大腸菌 OP50と場所。 8時間のインキュベーション後、 大腸菌を2mlを使用3×200ミリリットルLBのそれぞれに接種するために大腸菌 OP50 LB培地37℃のインキュベーター（220 rpm）でO / N（17時間）を振っに入れフラスコ。 20×50 ml遠心管を秤量し、チューブ上に重量を書きます。 O / N Eの血清学的ピペット、アリコート30ミリリットルを使用して2日目。事前に大腸菌 OP50文化が遠心管の重量を量りました。 7741 xでの遠心分離G、10℃、8分慎重に、上清をデカントで蓋を反転チューブを維持し、数分間放置します。ピペットを使用して、蓋に収集している可能性のある余分な上清を除去します。チューブを秤量し、ペレットの重量を計算します。 30グラム/ Lのサスペンションを提供し、チューブにこのボリュームをマークするために必要な量を計算します。 1-3カ月以内にまたはで使用するために-20℃で日付、ラベルと場所チューブ – 80℃で3ヶ月以上のために保存する場合。 線虫を成長させるための細菌懸濁液を準備します。細菌ペレットを静かに必要な体積を得るために、ペレット、異なるチューブのプールの内容を再懸濁するために出て解凍し、各チューブに11,12完全培地Sの必要なボリュームを追加、ボルテックスすることができます。無菌状態の下で働きます。 96ウェルプレートフォーマットで薬物標準の調製注：薬剤ライブラリを使用する場合、薬剤プレートは単一に設けられています。DMSO中の化合物の濃度。一次スクリーニングは、単一の濃度で化合物を試験します。手順については、10μMで統計的有意後に選択し、0〜160μMの濃度の範囲で確認化合物試験のための薬剤プレートの調製のために従ってください。以下の手順は、他の濃度をテストするために適合させることができます。 注意！薬を扱うために必要な注意事項を守ってください（一般的に手袋が必要とされる、マスク、安全ゴーグルに直面しています）。 確認スクリーニングのための作業標準に薬物プレートを準備します（ つまり、100倍を露光のために必要な最大濃度に比べて集中）滅菌1.7ミリリットルマイクロ遠心チューブに化合物の必要量を計量し、DMSOに16mMの化合物を製造。 8、4、2、1、0.5、および0.25 mMの標準（無菌状態）を取得するためにDMSOに2：シリアル16mMのストック1を希釈。これらは、100倍に濃縮され、0（車両のみ）の最終濃度まで希釈され、薬物曝露の間に（1％DMSO中）2.5、5、10、20、40、80および160μM。 クリーンベンチでは、例えばプレートの位置A1のために、96ウェルプレートの列内の化合物基準のウェル当たり20〜50μLを置く：16 mMの、B1：8 mMの、C1：4 mMの、D1：2 mMの、 E1：1 mMの、F1：0.5 mMの、G1：0.25 mMの薬とH1：DMSO。異なる薬剤の希釈系列の異なるカラムを使用してください。 薬剤プレートの列12のウェルに分注し車。 注：これは、車両全体のプレートの位置の代表でテストされて確実に、車両制御下に行Hに沿って検査に加えて、列のテストを容易にします。 注：確認のスクリーニングのための各薬剤プレートは、試験される11種類の薬剤の最大プラス車両制御のための希釈系列を保持しています。 必要になるまでラベルとシールプレートは、-20℃で箔と場所でカバーしています。 3.線虫の実験注：すべてのステップを実行し、Uファインダー無菌状態、無菌的かつ事前に滅菌材料および試薬で。 C.を維持エレガンスは、EとNGMプレート上で日常株異なるプロトコルステップの大腸菌 OP50 12示唆タイミングは、表1に提供されています。 1日目の作業は：その後の同期のためのバイオセンサー株の液体培養を設定します。 S完全2mlに（食品がちょうどなくなった若い幼虫をたっぷり使って）1 6センチメートルNGMプレートから線虫を取り、30グラム/ L Eでフラスコへの転送S完全な（250ミリリットル容量の円錐形のガラスフラスコ中の総容量30ミリリットル）中の大腸菌 OP50。 20℃、160rpmで3日間インキュベートします。 4日目の作業（約30〜35分を許可）：漂白文化卵を収穫し、ワームの人口を同期します。 1分間のすべての遠心操作を実行し、600×gで。 使用直前に漂白剤溶液を調製：0.156 M KOH / NaOHを各16ミリリットルに4ミリリットル漂白剤を追加します。 2×14ミリリットルを注ぎます15ミリリットルの円錐遠心チューブにワーム文化。ワームは、重力（3分）によって解決することができます。取り外し、液体上の落ち着いた線虫を捨てます。各チューブに漂白剤溶液5mlを加え、タイマーを開始します。 1チューブにボリュームを兼ね備​​えています。 ワームの破壊と懸濁液に卵を放出するステレオスコープの下で確認し、2分間穏やかにチューブを反転。ときほとんどの卵が解放されるか、漂白溶液中で2分間、遠心機の最大時。 注意深く上清を取り除きます。 14ミリリットルのS完了し、遠心分離してペレット1×を洗ってください。 （この第二の漂白工程は、ワームの死体のほとんどが崩壊し、もはやステレオスコープの下に見ていることを保証します）上清を捨て、10ミリリットル漂白剤溶液を添加し、タイマーを開始します。 2分の漂白液の最大時間後、遠心分離。 完全なS内の洗浄ペレット3倍、静かに各遠心後のS完全な14ミリリットルで上清と再懸濁したペレットをデカント。最終洗浄後、14ミリリットルのS cで卵のペレットを再懸濁omplete。 円錐形のガラスフラスコにボリュームを転送します。 20℃、160 rpmで18〜24時間インキュベートします。 注：収穫卵は、したがって、彼らはすべての成長の同じステージになります、O / Nを孵化し、原因食品の不足のために最初の幼虫齢（L1）で開発を逮捕します。 5日目の作業：薬物アッセイのための同期ワームの文化を設定します。 注：飢餓培地に懸濁ワームは、ピペットチップおよびチューブのような疎水性プラスチック表面に付着する傾向があります。 0.01％のTween-20がプラスチック表面をより親水性とカウントでより高い精度（0.01％のTriton-X100を使用することもできる）を可能にするためにここで使用される界面活性剤です。線虫、細菌添加培地である場合、それらは、プラスチックに固執する傾向がありません。 プラットフォーム（160 rpm）を振っにフラスコを維持し、フラスコ中の斜線のL1の数を決定します。 900μlの液体mの独立した1.7ミリリットルのマイクロチューブに（きれいな先端を毎回使用）フラスコから3倍の100μlのサンプルを取りますedium 0.01％のTween-20。 注：一度だけきれいな先端への熱望100μlのサンプル。そして、ときに先端に付着した虫を解放するためにトゥイーン添加した培地に、ピペットアップし、数回上下分配します。 各三連の希釈チューブから4倍の10μlの液滴中の線虫をカウントします。平均値を計算し、円錐形のガラスフラスコ内に存在するワームの数を推定します。 10μLあたり10線虫で2×20ミリリットル文化をセットアップするために必要な斜線の線虫懸濁液の体積を計算します。遠心分離工程の間に、いくつかの後続の線虫の損失を考慮して10％、算出容量を増やします。 デカントボリュームが2×15 mLの遠心分離管に必要な（予め秤量）。優しく実際の分注量、渦を取得し、5 mlピペット（のみ無菌先端がチューブを入力してください）​​と過剰量を除去することによって、ボリュームをターゲットにする調整するためにチューブを秤量します。 だったの完全な新鮮なSで14ミリリットルにボリュームを構成します時間線虫。遠心分離（1分、600 g）を得ました。線虫のペレットを乱さないように注意して上清を除去し、廃棄します。 30グラム/ L Eで完全なSの5ミリリットルを追加します。ペレット化した線虫の大腸菌 OP50。各チューブ内の5mlを30グラム/ L、Eとの完全な15ミリリットルSを含む円錐形のガラスフラスコに移し大腸菌 OP50。線虫が最初に食べ物を提供した時間を書き留めます。 （160 rpm）で静かにフラスコを振って、10μLあたりの線虫をカウントし、約10（±2）の平均値を確認する（新鮮なヒントを毎回使用）顕微鏡スライド上に9×10μlの滴を取ります。 20℃、42〜44時間、160 rpmで振盪インキュベーターで線虫フラスコを置きます。 7日目の作業：転送は96ウェルプレートに線虫および薬物曝露を開始します。 、単一のフラスコに線虫の文化を組み合わせ軽くフラスコを旋回維持し、60 mlの滅菌トラフで線虫文化の3×4ミリリットルを配置します。振盪台（160 RPM）で谷を置きます。 8ちゃんを使用してくださいNELピペットは、平坦な透明底の96ウェル黒色マイクロタイタープレートのウェルあたり25μlの一時停止線虫をアリコートに（両方の発光と蛍光読み取りを行うための、または唯一の発光用白色プレート）。プレート蓋で覆い、脇に置きます。 後ごとに2枚のプレートの設定、失われたボリュームを交換するトラフ内の別の2×2.5ミリリットル線虫を置く（約7ミリリットルの谷に「デッドボリューム」を保ちます）。 線虫との13/14のプレートを設定します。 11線虫プレートを2枚の96ウェル薬物プレートを試験するために必要とされます。線虫のプレート番目 12は、制御等の車両を独占的にロードされます。 13 番目のプレートは、8日目にバックグラウンド蛍光を確立するために使用される（下記参照）。間違いがセットアップ中に発生した余分な板を使用するために調製することができます。 振盪インキュベーターで湿ったチャンバー内の各ウェルと場所のプレートへの完全なSのアリコート74μlの（素材リストを参照してください）​​（20℃、160 rpm）でUNT予め選択された発達時点でのアリコートの試験化合物を準備IL（提供食後例えば、45時間30分）。 【ウェルあたりのボリュームは現在99μlです]。 試験に薬剤プレート（単数または複数）を解凍します。 ヒントを毎回変え、薬物と線虫のプレートを設定するためにマルチチャンネルピペットを使用してください。薬を小分けするために、96ウェルプレートあたり5分を許可します。 薬剤プレートの1 列目から1μLを取り、列線虫を含むプレートの1-5に追加します。列線虫を含むプレートの8-12への薬物プレートで2 番目の列から繰り返します。列6と線虫のプレートの7に車両の1μLを加えます。 注：化合物/車両：100希釈の線虫のプレート中のウェルあたりの総容量は、1の結果を100μlになります。 第二の線虫のプレートの列1-5 / 8-12に薬剤プレートの第 3 / 第 4列の1μLを添加することにより、プロセスを繰り返し、列6と線虫のプレートの7に車両を追加します。残りの薬剤プレートの列をテストし続けます。薬剤プレートのカラム12からサンプリングすることにより、すべてのウェルに車で1線虫プレートの最小値を設定します。バック湿ったチャンバ内で20〜22時間（20℃、160 rpm）を振盪インキュベーターに入れプレート（8日目のための注意を参照）。 翌日の発光バッファをパート準備：1％DMSOおよび0.15％トリトンX-100を取得するための完全なSの必要量にDMSOおよび10％トリトンX-100を追加します。発光のために読んでプレート当たり5ミリリットルに加え、1mlをルミノメーターインジェクタをプライミングするために許可します。 8日目の作業：実験的なエンドポイントを読む – 蛍光と生物発光。 （GFP蛍光測定値は、生物発光データを正規化するための手段として推奨されています。） 注：記載された実験条件の下でかなりの子孫の生産を防止するために、線虫に提供食べ物後66〜67時間までに、エンドポイントを読むことを目指します。 GFPの測定値のバックグラウンドコントロールとして使用するためにプレートを設定します。 C言語15ミリリットルチューブに13 番目のプレートからombineよく内容。線虫は（2-3分）を解決するために許可します。ウェルあたり100μlの細菌懸濁液をマイクロプレート（透明底部と黒）をロードするために上清を使用してください。 線虫を見ることができる井戸の下に注目顕微鏡下でのバックグラウンドコントロールプレートを観察します。その後のデータ分析に使用されるバックグラウンドの見積もりからこれらを除外します。 バックグラウンドコントロールを含む各96ウェルプレートの蛍光を、お読みください。 （設定：プレートの底から光学; 485/20励起フィルター; 20分の528放射）。 発光測定値のためにバッファを準備します：ルシフェリン（20 mM）のパート準備するためのバッファを（前日から）を追加し、1％のDMSO（1×）、0.15％トリトンX100（3回）および0.3 mMのルシフェリン（3回発光バッファを取得します）。 150μlの発光バッファーで総理ルミノメーターインジェクタ6倍。 前のステップでは、薬物暴露中の車両として、1％DMSOを前提としています。車両が水である場合には、共調節3％（ すなわち、3回）に発光バッファー中のDMSOのncentration。 一度に一つのプレートで動作します。ウェル当たり50μlの発光バッファーを分注します。 （ウェル中の150μlの最終容量;発光バッファの3倍希釈：1％DMSO、0.05％トリトン-X100および0.1mMルシフェリン最終濃度）のプラットフォームを振っに即座に置き、タイマーを開始します。 プラットフォーム（160 rpm）を振っに3分後、発光（測定あたり1秒）をお読みください。 4.データ解析蛍光結果からの読み取りの平均GFPの背景を引きます。それぞれのGFP読み取りによって生物発光を割ります。 高いGFPの値が化合物に暴露された線虫のために検出された場合、任意の化合物の蛍光を考慮するためにそれ自体で化合物の蛍光を測定します。平均より高い場合は、代わりに背景として使用します。 エクスプレス生物発光、GFP正規化された生物発光A各プレートにおける車両制御のための平均値の百分率としてND GFP蛍光データ。 各濃度の平均値を、エラーバーをプロットします。 「濃度」、「実験」、およびそれらの相互作用の効果と分散の2方向分析（ANOVA）を使用して統計的有意性についての試験（各データ点は、単一のウェルをいう）、およびポストホック検定（対としてダネット検定を使用して。車両制御）。 注：「実験」または「相互作用」という用語は、有意である場合には、さらなる実験は、応答を確認するために必要とされ得ます。実験の間にばらつきがデータプロットの観察から明らかでない場合には、一方向ANOVAは、独立した実験からプールされたデータに対して実行することができます。 唯一の車両とプレート（S）の統計分析のために、列6 -7で全てのウェルと対照群として行Hにおける全てのウェルを選択します（これらは、日常的に化合物試験中の車両に割り当てられた位置です）。 </lI>